ELISA及

相關免疫分析技術江蘇省臨床檢驗中心許斌9/30/2023概述ELISA是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法，由于其試劑穩定、易保存、操作簡便、結果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規模篩查試驗又可以用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做半定量分析等優點，已廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子等領域。ELISA的影響因素較多，加強質量管理才能充分發揮其方法學的優點。9/30/2023ELISA1971年Engvall等人把免疫組化的EIA技術應用于臨床檢驗開展為ELISA〔EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay〕技術，酶聯免疫吸附劑試驗。特點：在聚苯乙烯固相載體外表組裝免疫活性物質形成“免疫吸附劑〞酶標記免疫活性物質，化學顯色劑進行信號放大；有二步溫育反響二次洗滌過程；靈敏度、特異性相對較高。9/30/2023ELISA原理雙抗體〔原〕夾心法檢測抗原〔體〕的常見方法，應用針對抗原兩個不同決定族的兩種單抗分別作為固相載體和酶標抗體檢測溶液中的抗原〔適用于二價以上抗原,不能測小分子半抗原〕。9/30/2023間接法檢測抗體的方法，利用酶標記的抗抗體〔一般為抗人IgG〕檢測已與固相抗原結合的抗體，因有干擾須稀釋標本。

固相包被抗原待測抗體酶標記第二抗體底物9/30/2023競爭法檢測抗原或小分子半抗原、抗體，以測抗原為例，使待測抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，結果如待測抗原含量越多，與固相抗體結合的酶標抗原就越少，顯色越淺，二者呈負相關。

固相包被抗原待測抗體酶標記特異抗體底物9/30/2023試劑盒選擇衛生部規定乙肝試劑，丙肝試劑，艾滋病試劑，梅毒試劑及血型試劑必須使用經衛生部生物制品檢定所檢定合格，并貼有防偽標簽的產品，試劑應從靈敏度，特異性，精密度，穩定性，簡便性，平安性及經濟性作出全面的評價。靈敏度：有二層含義，1〕為試劑檢出被檢物質的最低量的能力；2〕為試劑對人群或大量樣品中陽性檢出的能力〔假陰性越少越好〕，取決于包被物的全面性。特異性：指試劑正確檢定不存在的被檢物質的能力〔無假陽性〕，取決于包被抗原〔體〕及標記抗原〔體〕的純度及特異性。精密度：ELISA試劑一般指其批內CV，其值應小于15%；定量試劑應同時考察線性范圍9/30/2023CLSII/LA23-A

Assessingthequalityofimmunoassaysystems:radiooimmunoassaysandenzyme,fluorescence,andluminescenceimmunoassays;approvedguideline11.2:Thelowerimmunochemicaldetectionlimitforanassayrepresentsthelowestlevelofanananlytethatcanbereproduciblydetected.thelaboratoryortestsensitivityisidenticaltothedetectionlimit;usecutoffvalueClinical(diagnostic)sensitivity:theproportionofpatientswithawell-definedclinicaldisorderwhosetestvaluesarepositiveorexceedadefineddecisionlimit(i.e.,apositiveresultandidentificationofthepatientswhohaveadisease);usepositivepredictivevalue,false-negativeresults,et.al.9/30/20239/30/2023

9/30/20239/30/20239/30/20239/30/2023HBV基因型和血清學亞型以HBsAg的抗原決定族分血清學亞型共同決定族a，相互排斥的二對決定族d/y，w/r；w又分1-4；r又分q+和q-。共有9種亞型：ayw1，ayw2，ayw3，ayw4，ayr，adw2，adw4，adrq+，adrq-只說明包膜蛋白氨基酸差異，有流行病學意義9/30/20239/30/20239/30/2023保存參考品的國際機構或組織英國國立生物學標準及控制品研究院〔NIBSC〕：免疫血清學IU/ML德國鮑爾-艾立希研究院〔PEI〕：病毒學、免疫血清學等，傳染病標志物最全。PEI/ML法國國家中心實驗室〔LNS〕、法國輸血協會〔SFTS〕：病毒性肝炎、艾滋等血清盤。NG/ML荷蘭輸血中心實驗室〔CLB〕：血型、病毒學、自身抗體等。丹麥國家血清研究院〔SSI〕：病毒學、寄生蟲、免疫蛋白等。美國BBI：HBV、HCV、HIV-1、HIV-2、HTLV-1等Panel。9/30/2023穩定性：試劑在規定條件下能儲存的時間，一般采用破壞性試驗即將試劑存放于37℃保存，定期測定其靈敏度，特異性和精密度等指標，直到其質量指標開始下降為止，通常認為37℃每穩定一天相當于4—10℃保存一個半月。簡便性：指在不影響試劑的前三項指標的前題下，實驗和測定步驟越少越好，在定性試驗中結果判斷簡單明了，〕定量試驗結果計算也應簡單。平安性：指試劑對操作者和環境平安無害無傳染性。經濟性：試劑在同等質量條件下通過大規模生產或技術進步降低本錢而市場價格比較合理。9/30/2023試劑盒選擇試劑評價需要有權威的血清考核盤〔Panel〕進行檢測，一般實驗室不易從生檢所或臨檢中心取得，每進一次試劑評價一次也很麻煩。可以通過間接的信息對試劑進行選擇。根據該試劑生檢所批批檢定報告，了解其質量水平，按照質量方案選擇靈敏度高的或特異性高的試劑；通過詢問試劑包被物的組成，如原料來源〔基因工程或合成多肽〕，片段的組合〔按比例混合或化學合成〕，片段的長短等判斷試劑的優劣；參考室間質評評價報告中對試劑的評價結果，這比較客觀公正，因為統計數字均來自各參評醫院，反映了試劑在某一地區的使用情況；根據權威部門發布的試劑評價結果，了解市場上試劑的質量優劣。9/30/2023標本的采集和保存可用作ELISA的標本十分廣泛，體液〔如血清，血漿，各種積液〕，分泌物〔如唾液〕和排瀉物〔如糞便，尿液〕均可作為標本以測定其中的抗原或抗體成分，一般使用血清。標本采集時應盡量防止溶血，因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質干擾立可讀方法的結果，可造成假陽性；長菌的標本同樣的道理易產生假陽性。抗凝不完全的標本因纖維蛋白元的干擾而造成假陽性，建議盡量不用抗凝血尤其是用肝素抗凝劑。標本在冰箱中保存時間過長易導致血清IgG聚合，使間接法的試劑本底加深，一般血清置4℃冰箱5天內完成測試。如需保存一周以上那么要-20℃冰凍保存，融解時應上下顛倒充分混勻，同時防止氣泡。ELISA的靈敏度>1ng/ml水平上,標本間的污染要盡量防止，尤其不應與生化試驗用同一管標本.最起碼應先做免疫后做生化.9/30/2023標本使用真空采血管別離膠不抗凝9/30/2023內外干擾物質的影響分析

溶血脂濁RF自身抗體AFP補體肝素EDTAA0.1650.2000.2500.2640.1860.1460.1830.126S0.0230.0160.0070.0290.0100.0070.0190.013A對照0.1510.1950.1950.1950.1160.1160.1160.116S0.0380.0080.0080.0080.0180.0180.0180.018P>0.05>0.05<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.019/30/2023操作中本卷須知ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發揮ELISA的高靈敏，強特異的優點。因此,應建立實驗工程的標準操作程序(SOP)。9/30/2023儀器質控為使儀器保持最正確工作狀態應建立維護和校正儀器的標準操作程序〔SOP〕，所要控制的儀器包括移液器〔加樣槍〕，水浴箱〔溫箱〕，洗板機和酶標儀。移液器：ELISA加樣量小〔5-100ｕl〕，其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法檢查：吸取刻度指示量的水，萬分之一天平稱重后計算吸量是否準確，一般應在±10%以內；水浴箱經常檢查水浴箱溫度計所示的溫度和水中〔或溫箱內〕實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差；洗板機每個廠家設置洗板后的殘留液有各自的規定一般不超過2ul，人工扣板時，墊紙不濕，定期檢查管孔是否堵塞；酶標儀經常維護其光學局部，防止濾光片霉變，定期檢測校正濾光片波長和線性范圍，使其保持良好的工作性能。9/30/2023加樣器合格標準水合格標準9/30/2023酶標儀校正程序濾光片波長精度檢查：將不同波長的濾光片從酶標儀上卸下，用UV-2201型紫外-可見分光光度計〔波長精度±0.3nm〕于可見光區對每個濾光片進行掃描，其檢測值與標定值之差為濾光片波長精度。通道差與孔間差檢測：通道差檢測是取一只酶標板小孔杯〔杯底須光滑，透明，無污染以酶標板架作載體， 將其〔內含200ul甲基橙溶液吸光度調至0.500A左右〕置于8個通道的相應位置，蒸溜水調零，1于490nm處連續測三次,觀察其不同通道的檢測器測量結果的一致性，可用極差值來表示。孔間差的測量是選擇同一廠家，同一批號酶標2板條〔8條共96孔〕分別參加200ul甲基橙溶液〔吸光度調至0.100A左右〕先后置于同一通道，蒸溜水調零,于490nm處檢測，其誤差大小用±1.96s衡量。零點飄移〔穩定性觀察〕：取8只小孔杯分別置于8個通道的相應位置，均參加200ul蒸溜水并調零，于490nm處每隔30分鐘測一次，觀察各個通道4小時內吸光度的變化。9/30/2023酶標儀校正程序精密度評價：每個通道3只小杯分別參加200ul高中低3種不同．濃度的甲基橙溶解，蒸溜水調零，于490nm作雙份平行測定，每日測二次〔上下午各一次〕，連續測定20天。分別計算其批內精密度，日內批精密度,日間精密度和總精密度及相應的CV值。線性測定：用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液，于490nm平行測8次，取其均值。計算其回歸方程，相關系數及標準估計誤差s，并用±1.96s表示樣品測量的誤差范圍.雙波長測定評價：取一分甲基橙溶液，分別參加3種不同濃度的溶血液〔測定波長為490nm，校正波長為585nm〕，先后于8個通道檢測，每個通道測3次，51比較各組之間是否具有統計學差異，以考察雙波長消除干擾組分的效果。一般酶標儀無585nm濾光片，可選用550nm或630nm濾光片。450nm濾光片的檢定選用普魯蘭溶液〔校正波長為630nm〕9/30/2023全自動酶標儀定期校準〔年檢，維修后〕主要參數：加樣精度〔針間誤差〕，攜帶污染率〔加樣和管道〕，洗板效果，光學系統。

9/30/20239/30/20239/30/2023加樣

加樣應用微量移液器〔加樣槍)按規定的量參加微孔板的1/3處防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反響，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。9/30/2023溫育抗原抗體反響需要在一定溫度下〔37°C〕，經過一定的時間才能到達反響的平衡點ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反響液溫度迅速到達平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。邊緣效應〔2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結果〕

水浴法

孵箱法

微波法A中央（S）

0.307（0.023）

0.282（0.028）

0.151（0.059）

A周圍（S）

0.290（0.038）

0.357（0.047）

0.097（0.038）P<0.05<0.01<0.019/30/2023洗滌ELISA是靠洗滌來到達別離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾去除掉。手工洗滌一般采用浸泡方法：1〕甩去孔內反響液；2〕用洗滌液過洗一遍〔即注滿孔后即甩去〕；3〕微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；4〕甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。重復以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，防止堵孔。9/30/2023顯色HRP催化底物H2O2釋放自由氧，氧化OPD或TMB顯色反響，同樣需要一定的時間和溫度，一定要按照說明書規定的時間溫度〔一般為37°C，10-15分鐘〕恒定反響后終止或根據臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反響時間.9/30/2023酶標儀判讀結果

顯色反響終止后應立刻比色〔30分鐘內〕。常見的顯色系統有OPD和TMB二種，以后者最為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；TMB終止后顯黃色，測定波長為450nm，二種底物的校正波長均用630nm。使用雙波長的優點可以消除反響板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反響板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否那么吸光度易出現負值或損壞濾光片。9/30/2023報告方式定性試驗國內外為便于統一計算，一律按S/C.O方式報告，S為標本A值，C.O即CutOff值〔陽性判定值)夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽性；竟爭法與中和法以S/C.O﹤1為陽性CutOff的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有：A〕

C.O=2.1×N〔當N缺乏0.05時按0.05計〕，此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。B〕C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來，常用于竟爭，中和法C〕C.O=N+C〔C為常數〕，用于間接法。D)

C.O=C×P+N〔C為常數〕，用于間接法。此公式最客觀，但對生產廠家要求很高，陰陽性對照測定值要根本恒定。9/30/2023報告方式定量分析用量的標準品作一系列稀釋，ELISA測定，繪制標準曲線，結果以絕對量或單位表示。ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。現有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內成直線，要得到精確的結果實屬不易。因此嚴禁用定性試劑盒做定量分析。9/30/2023灰區概念把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區概念，即將CO值上下的一段區域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區范圍內那么報告+〔陽性〕。灰區概念對血站系統的獻血員篩查尤為重要。灰區的設置有二種：1〕C.O×〔1±CV〕，CV為該試劑的批內CV(一般在15-20%間〕；2〕C.O±2s，s為實驗室做室內質控ROC的s。9/30/20239/30/2023確認試驗抗原檢測—中和試驗抗體檢測—RIBA〔RecombinantImmunoblotAssay〕：將病毒的各種抗原單獨包被在纖維素膜、尼龍膜等載體上，檢測不同抗原的反響性。或WesternBlot：用十二烷基硫酸鈉SDS處理的待檢血清經SDS-聚丙烯酰胺凝膠PAGE電泳，使抗原與抗體別離，將抗原轉移到硝酸纖維膜上，參加抗體，再用與酶或同位素標記的二抗反響，顯色或放射自顯影判定結果。9/30/2023質量審核型式檢查〔編號唯一性、工程完整性、書寫完整性〕儀器檢查〔狀態、校準〕試劑檢查〔效期〕質控檢查〔室內、室間〕異常值檢查〔及時與臨床聯系〕9/30/20239/30/20239/30/2023HBsAgHBeAgHBcAb-IgGHBcAg-IgMHBeAbHBsAb臨床意義++————急性HBV感染早期HBV復制活潑

++++——急慢性HBV感染，HBV復制活潑

+—++——急慢性HBV感染，HBV復制中躍

+—+++—急慢性HBV感染，HBV復制低躍異型慢性乙型肝炎+—+—+—HBV復制停止或極低

——++——平靜的HBV攜帶狀態，HbsAg極低測不出，HBsAg/抗HBs空白期——+———HBV既往感染，未產生抗-HBs——+++—抗HBs出現前期，HBV復制低——+—++HBV感染恢復期——+——+HBV感染恢復期

++++—+不同亞型ＨＢＶ再感染+—————ＨＢＶ－ＤＮＡ整合—————＋病后或接種疫苗后獲得免疫9/30/2023HBsAgA.急、慢性肝炎的診斷。B.獻血員和各種血制品的篩選。C.急性肝炎最早期的預后指標。D.流行病學調查。

本卷須知：一、HBsAg假陽性血清別離不佳或肝素抗凝血；二、HBsAg假陰性①感染早期易形成抗原抗體復合物，這種情況需要檢測抗HBc-IgM及HBVDNA；②多數商用試劑盒檢測系統采用的為多克隆抗體檢測HBsAg的adr、ayw型，S區的點突變即可導致臨界測定值或陰性結果；③由于慢性病毒攜帶者〔低水平HBsAg攜帶者〕或HBV感染潛伏期，HBsAg濃度低于檢測水平的下限。

9/30/2023抗-HBs：A.預后：抗HBs經常在肝炎病癥出現后4-6個月出現，一般表示病毒去除，感染開始恢復。近年來的研究發現在抗HBs陽性患者體內有5%HBVDNA陽性，慢性肝炎中的一些抗HBs陽性者，肝細胞中可檢出HBsAg、HBeAg、HBVDNA，因此盡管自然感染者抗HBs陽轉后，大多數預后良好，但也不能過于樂觀，應定期復查。B.流行病學調查。C.疫苗接種對象的篩選和效果觀察。接種疫苗后，抗HBs濃度超過10IU/L，說明其具有保護性。加強免疫后4-8周，大于100IU/L，即便以后有所降低，其免疫力能維持10年以上。

本卷須知：A．疑心假陽性結果時要進行中和試驗。B．抗HBs經常在HBsAg消失幾周至幾月前方呈陽性〔窗期〕，極少數在HBsAg消失后即為陽性，同時可檢出抗HBs及HBsAg見于以下幾種情形：①前后或同時感染兩種亞型HBV，抗HBs及HBsAg同時檢出通常要持續很久，且濃度均很高；②抗HBs假陽性；③編碼HBsAg的基因變異使得HBsAg抗原性改變，原型抗HBs不能將其去除。9/30/2023HBeAg：A.評價血清傳染性：慢性HBsAg攜帶者中，HBeAg及HBV-DNA檢測可以用來評估其傳染危險性，90%HBeAg陽性HBsAg攜帶者可以傳染給她們的新生兒，而HBeAg陰性或抗HBe陽性的孕婦中只有10%會傳染給嬰兒。B.預后：急性期HBeAg的消失通常伴隨ALT的降低，預示著疾病的好轉；HBeAg持續陽性超過12周，提示HBV感染趨向慢性；HBeAg陽性的無病癥者較少。

本卷須知：〔1〕假陰性：前C區基因變異導致不能生成和分泌HBeAg，血清中HBeAg陰性，但這種突變并不影響乙肝病毒的復制，仍可形成完整的