專題1基因工程1.1

DNA重組技術的基本工具1.2基因工程的基本操作程序1.3基因工程的應用1.4蛋白質工程的崛起本節知識體系基因工程的基本操作程序：一、目的基因的獲取二、基因表達載體的構建三、將目的基因導入受體細胞四、目的基因的檢測與鑒定1.2基因工程的基本操作程序專題1基因工程原核細胞的基因結構原核細胞基因編碼區（編碼序列）：能指導有關蛋白質的合成，即能夠編碼蛋白質非編碼區（調控序列）：位于編碼區上游和編碼區下游的DNA序列，不能轉錄并不能編碼蛋白質，但有調控遺傳信息表達的核苷酸序列，如啟動子、終止子等它山之石原核細胞的基因結構RNA聚合酶的作用是催化DNA轉錄為RNA。它能夠識別調控序列中的結合位點，并與其結合。轉錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并與DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。它山之石

RNA聚合酶是催化以DNA為模板（template）、三磷酸核糖核苷為底物、通過磷酸二酯鍵而聚合的合成RNA的酶。因為在細胞內與基因DNA的遺傳信息轉錄為RNA有關，所以也稱轉錄酶。真核細胞的基因結構真核細胞基因編碼區（間隔、不連續）外顯子：能編碼蛋白質的DNA序列內含子：不能編碼蛋白質的DNA序列非編碼區：與原核生物具有相似功能的啟動子、終止子它山之石真核細胞的基因結構與原核細胞比較，真核細胞基因結構的主要特點是：編碼區是間隔的、不連續的。也就是說，能夠編碼蛋白質的序列被不能夠編碼蛋白質的序列分隔開來，成為一種斷裂的形式。其中，能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子，一般不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子。它山之石原核細胞與真核細胞的基因結構比較原核細胞真核細胞不同點編碼區是連續的編碼區是間隔的、不連續的相同點都由能夠編碼蛋白質的編碼區和具有調控作用的非編碼區組成的它山之石編碼相同數目氨基酸的蛋白質，原核細胞與真核細胞基因結構一樣長嗎？思考？基因的種類（1）編碼蛋白質的基因：包括結構基因和調節基因。（2）沒有翻譯產物的基因：如rRNA基因和tRNA基因。（3）不能轉錄的DNA片段：如操縱基因。它山之石啟動子與終止子

啟動子是在非編碼區內緊靠轉錄起點，調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序列，它能引導RNA聚合酶與正確的基因部位結合，使轉錄從起點開始，沿編碼區進行。

終止子是在非編碼區內緊靠轉錄終點，調控遺傳信息表達的脫氧核苷酸序列，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉錄終止。它山之石基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取新授

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。1.從基因文庫中獲取目的基因基因文庫基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）1.從基因文庫中獲取目的基因某生物體內全部DNA許多DNA片段受體菌群體

限制酶

與表達載體連接導入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA

反轉錄受體菌群體

與表達載體連接導入部分基因文庫（cDNA文庫）基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取cDNA為具有與某RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNA即complementaryDNA之縮寫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉錄受體菌群體與運載體連接導入cDNA文庫基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取1.從基因文庫中獲取目的基因比較：部分基因文庫和基因組文庫原理：前提：過程：PCR擴增儀DNA雙鏈復制的基本原理一段已知目的基因的核苷酸序列目的基因DNA受熱變性解鏈為單鏈；引物與單鏈互補結合；合成鏈在DNA聚合酶作用下進行延伸。基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取2.利用PCR技術擴增目的基因由穆里斯等人于1988年發明，并于1993年獲得諾貝爾化學獎。PCR全稱為多聚酶鏈式反應（polymerasechainreaction)反應過程：1.變性：加熱至90～95℃目的基因DNA解鏈;2.復性：冷卻至55～60℃，引物結合到互補DNA鏈;3.延伸：加熱至70～75℃，熱穩定DNA聚合酶從引物起始互補鏈的合成基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取2.利用PCR技術擴增目的基因利用PCR技術擴增目的基因動畫演示PCR技術擴增與DNA復制的比較PCR技術DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制(PCR擴增儀內)主要在細胞核內熱穩定的DNA聚合酶（Taq酶）大量的DNA片段形成整個DNA分子解旋酶、普通的DNA聚合酶等基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取3.人工合成：反轉錄法等基因比較小已知其核苷酸序列已知其mRNA

的序列已知其翻譯產物的氨基酸序列

生物材料DNA目的基因的獲取mRNAcDNAPCR反轉錄cDNA文庫DNA一定大小范圍的DNA基因組文庫人工合成限制酶切自然界中分離人工方法合成自然界分離后再人工合成歸納小結基因比較小，且已知核苷酸序列基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取

構建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構建基因文庫。基因工程的基本操作程序一、目的基因的獲取尋根問底深度思考為什么要構建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內提取不行嗎？基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建----基因工程的核心⑴使目的基因在受體細胞中穩定存在并遺傳給下一代⑵同時使目的基因能表達和發揮作用。1.構建基因表達載體的目的2.基因表達載體的組成a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點它們各有什么作用？基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建----基因工程的核心2.基因表達載體的組成a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因e、復制原點一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識別和結合的部位，驅動基因轉錄出mRNA一段有特殊結構的DNA片段，位于基因的尾部，起終止轉錄的作用為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來（如抗氨芐青霉素基因，綠色熒光基因）

它們各有什么作用？外來的編碼特定蛋白質的基因DNA復制起點，即DNA聚合酶結合位點

⑴用一定的_________切割質粒，使其出現兩個切口，露出____________。⑵用_____________切斷目的基因，使其產生_________________。3.基因表達載體的構建的步驟⑶將切下的目的基因片段插入質粒的_____處，再加入適量___________，形成了一個重組

DNA分子（重組質粒）限制酶黏性末端同一種限制酶的黏性末端切口DNA連接酶相同基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建質粒一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶重組DNA分子（重組質粒）同一種限制酶

目的基因與運載體的結合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。DNA分子基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建----基因工程的核心尋根問底深度思考作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。必須構建上述元件的主要理由是：（1）生物之間進行基因交流，需要使用啟動子和終止子才能比較有利于基因的表達。通過cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導入受體生物中無法轉錄；（2）目的基因是否導入受體生物中需要有篩選標記；（3）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他調控元件，如增強子等；（4）有時需要確定目的基因表達的產物存在于細胞的什么部位，往往要加上可以標識存在部位的基因（或做成目的基因與標識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。基因工程的基本操作程序二、基因表達載體的構建----基因工程的核心尋根問底深度思考將生物的所有DNA直接導入受體細胞不是更簡便嗎？如果這么做，結果會怎樣？提示：有人采用總DNA注射法進行遺傳轉化，即將一個生物中的總DNA提取出來，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，沒有進行表達載體的構建，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定什么基因導入了受體植物。此法目前爭議頗多，嚴格來講不算基因工程。基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞轉化—目的基因進入

內，并且在受體細胞內維持

和

的過程受體細胞穩定表達方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法（最常用80%）基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法1.將目的基因導入植物細胞的方法：農桿菌轉化法（1）農桿菌感染特點：（2）轉化原理：基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞

易感染雙子葉植物和裸子植物(對大多數單子葉植物沒有感染能力）。

當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的酚類化合物，吸引農桿菌移向這些細胞，這時農桿菌中的Ti質粒上的T-DNA（插入目的基因也可轉移）可轉移至受體細胞的染色體DNA上。1.將目的基因導入植物細胞的方法：農桿菌轉化法（3）轉化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞

目的基因插入Ti質粒的T-DNA上農桿菌導入植物細胞整合到受體細胞的染色體DNA上目的基因的遺傳特性得以維持穩定和表達

根據農桿菌可將目的基因導入雙子葉植物的機理，你能分析出農桿菌不能將目的基因導入單子葉植物的原因嗎？原因：根瘤農桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產生一些糖類和酚類物質吸引根瘤農桿菌向受傷組織集中。研究證明，主要酚類誘導物為乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，這些物質主要在雙子葉植物細胞壁中合成，通常不存在于單子葉植物中，這也是單子葉植物不易被根瘤農桿菌侵染的原因。酚類物質和糖類物質既可以作為根瘤農桿菌的趨化物，又可以作為農桿菌中Ti質粒上Vir區（毒性區）基因的誘導物，使Vir區基因活化，導致T-DNA的加工和轉移，從而侵染植物細胞。尋根問底深度思考

基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。將目的基因導入植物細胞的其他方法：單子葉植物中常用的一種基因轉化方法

植物花粉在柱頭上萌發后，花粉管要穿過花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。將目的基因導入植物細胞的其他方法：2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射技術（最常用、最有效）（2）轉化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞發育成新性狀動物顯微注射取卵（受精卵）目的基因表達載體提純受精卵發育、移植3.將目的基因導入微生物細胞（1）原核生物作受體細胞的優點（2）轉化過程：基因工程的基本操作程序三、將目的基因導入受體細胞繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對較少。（應用最為廣泛----大腸桿菌）受體細胞