細胞的復蘇一簡單步驟V（總3頁）--本頁僅作為文檔封面，使用時請直接刪除即可----內(nèi)頁可以根據(jù)需求調(diào)整合適字體及大小--實驗名稱：細胞的復蘇二 實驗目的：將凍存的細胞恢復活性實驗原理：在低于-70oC的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應極其緩慢，甚至終止。所謂冷凍保存，就是將體外培養(yǎng)物或生物活性材料懸浮在加有或不加冷凍保護劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度（一般是低于-700C的超低溫條件），并在此溫度下對其長期保存的過程。而復蘇就是將凍存在-1961液氮中的細胞快速融化至37°C,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。實驗步驟一.實驗前準備：將水浴鍋預熱至37C，將培養(yǎng)液預熱后分裝到培養(yǎng)皿中離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。二?取出凍存管：根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。迅速解凍：迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min離心3min制備細胞懸液：吸棄上清液。向離心管內(nèi)加入10ml培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。細胞計數(shù)：細胞濃度以5X105/ml為宜。培養(yǎng)細胞：將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37°C5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定。初學者易犯錯誤：1水浴鍋未預熱或者未預熱到37C。水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。版本2一、 細胞復蘇的原則在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養(yǎng)傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內(nèi)，再次形成胞內(nèi)結晶損傷細胞。二、 細胞復蘇的主要操作步驟佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。迅速放入38C水浴中，并不時搖動，在1分鐘內(nèi)使其完全融化，然后在無菌下取出細胞。在1000r/min速度下離心5?10分鐘，棄去上層液，加入適量培養(yǎng)液后接種于培養(yǎng)瓶中，接種濃度1X109/L,置37C溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代?；驘o需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)12?24小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。三、注意事項在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過最易受損的溫度段（-5?0°C）。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態(tài)良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養(yǎng)液上（已死亡）的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養(yǎng)液，也會獲得較為滿意的結果。是細胞內(nèi)防護液。DMSO能快速通過細胞膜進入細胞內(nèi)部，在細胞冷凍過程中，維持細胞內(nèi)外的水和離子平衡。將DMSO與右旋糖苷等細胞外防護液組合使用效果更佳。在常溫下，DMSO是有細胞毒性的。因此在往細胞懸液中加DMSO時，要在冰水混合物中進行，一方面避免加入DMSO時放熱，對細胞造成損傷；另一方面避免溫度較高時，對細胞的毒性。細胞冷凍時，DMSO的濃度一般控制在5-15%，不能再高，否則也對細胞有毒性。一般