改良式水楊醛比色法測定奶牛紅細胞膜上apase活性

近年來，我國奶牛酮病的發病率顯著增加，尤其是隱酮病，降低了牛奶產量，影響了奶牛業的發展。奶牛酮病是高產奶牛產犢后6周內最常發生的一種以碳水化合物和揮發性脂酸代謝紊亂為基礎的營養代謝病。臨床表現為頑固性消化紊亂,產奶量下降,機體脫水和一定的神經癥狀。臨床特征為酮血、酮尿、酮乳、低血糖、血漿游離脂肪酸濃度升高和肝糖元含量降低。為了進一步揭示奶牛酮病的發生機理,首次對奶牛酮病紅細胞膜上ATPase活性進行了測定,旨在為臨床防治奶牛酮病提供科學依據。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物黑龍江某牛場泌乳量在6.5×103kg以上的3～6胎荷斯坦奶牛。1.1.2儀器7230G分光光度計(上海第三分析儀器廠);低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);旋渦混勻器(上海第一醫學院儀器廠)。1.1.3試劑紅細胞膜上ATPase活性測定試劑盒,南京建成生物研究所;亞硝基鐵氰化鈉,無水碳酸鈉,硫酸銨(分析純),天津市化學試劑一廠。1.2方法1.2.1動物實驗應用酮粉法和改良式水楊醛比色法對黑龍江某農場的荷斯坦奶牛進行酮病抽樣檢測。分為兩組,每組10頭,分別為對照組和試驗組。1.2.2紅細胞沉淀和回血率于對照組和實驗組奶牛尾靜脈采取1mL肝素抗凝全血,測定紅細胞數,然后加4倍左右的0.86%NaCl溶液,2000r/min離心10min,棄去上層血清,留紅細胞沉淀。在沉淀的紅細胞中加雙蒸水1.0mL反復混勻,使其充分溶血,直至溶液透亮,取0.2mL溶血液應用試劑盒比色法測定紅細胞膜上ATPase活性。1.2.3數據處理和分析采用Excel軟件對實驗數據進行t檢驗。2結果2.1酮病陽性牛的診斷2.1.1乳中酮體的測定酮體的含量與實驗色澤反應的快慢,深淺成正比,陰性反應成土褐色,陽性結果以“+”表示,并代表乳中酮體的大約含量。陽性牛顯示有紫色跡象,并逐漸加深,于30s達頂點者為(++++),表示乳中約含酮體4.0mmol/L以上(圖1)。2.1.2楊樹業的比色法得以更好地診斷在酮粉法診斷結果的基礎上,進行改良式水楊醛比色法血清酮體含量的測定(表1),根據上述兩種方法選擇實驗牛。2.2紅膜上的apse活性試驗3不同類型的乳狀液對紅氧化酶活性的影響酮病的發病機理很復雜,但普遍接受的是糖缺乏理論。機體低血糖是產生酮病的關鍵。由于各種原因所致碳水化合物供應不足及高泌乳消耗大量的糖,導致機體低血糖及能量負平衡。為此,動用體脂肪和體蛋白,補充能量的不足。但是,脂肪和蛋白質分解產生大量的游離脂肪酸和生酮氨基酸,經肝臟的β-氧化為乙酰輔酶A,乙酰輔酶A可與草酰乙酸縮合成檸檬酸經三羧酸循環氧化供能。如果生成草酰乙酸的先質丙酸的碳水化合物不足,使得大量乙酰輔酶A不能進入三羧酸循環,導致酮體蓄積,進而引起一系列的代謝與機能紊亂。臨床表現為消化型、神經型和癱瘓型酮病。ATP酶存在于組織細胞及細胞器的膜上,是生物膜上的一種蛋白酶,它包括Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase4種,在物質運送、能量轉換以及信息傳遞方面具有重要的作用,機體在缺氧及某些病理情況下,此酶活性發生一系列改變。試驗結果表明,酮病陽性組與對照組相比,Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性均有程度不同的下降,并且差異顯著。從而說明奶牛酮病影響紅細胞膜上ATPase的活性變化。分析實驗結果可能有以下兩方面的原因:①酮病陽性牛的高酮血癥和低糖血癥導致動物機體缺氧,缺氧則導致ATPase活性降低;②酮病陽性牛早期的食欲下降和代謝紊亂,使血液中Na+、K+、Ca2+、Mg2+水平發生變化,進而影響Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、Ca2+-ATPase和Mg2+-ATPase活性,表現程度不同的下降,尤其是神經型酮病和癱瘓型酮病更為突出。另外,ATPase作為生物膜物質轉運和能量代謝的關鍵酶,