鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的研究

超氧化物誘導酶（sod）是一種特殊的金屬酶，能加速和有效消除超氧化物（o2-）的異質反應，從而有效地將超氧化物（o2-）分解為身體。它是一個重要的細胞防御系統之一，具有重要的紫色皮膚反應、抗輻射、抗衰竭、腫瘤和抗炎作用。超氧化物誘導酶（sod）的獨特生理功能，促進了藥物領域的良好應用，激發了人們的廣泛研究熱情。自1969年mc打破了具有活性的超氧化物（sod）以來，許多方法逐漸建立起來，其中最常用的是化學法。作為一種經典的抗膽紅素法，1973年出版的《抗膽紅素法》提高了很好的抗膽紅素法。之后，二苯基自氧化法可以在國內外廣泛使用。與其他方法相比，二苯基自氧化法具有操作簡單、速度快、試劑少、使用方便、重復性好等優點。然而，根據文獻報道的相鄰三酚自氧化法測定的超氧化物誘導酶活性的測定條件不同，這導致測量結果的參考模式混亂和比較不足。因此，我們研究了三酚自氧化法測定的自氧化反應的方法，并對該測試系統中緩沖溶液的介質組成、濃度、ph和edta因素對測定結果的影響。1鄰苯三酚自氧化反應在堿性條件下,鄰苯三酚迅速氧化釋放出超氧化物陰離子,生成有色中間產物,吸光度隨之增加,使吸光度值與反應時間呈良好的線性關系.SOD加入鄰苯三酚自氧化反應體系后,催化超氧化物陰離子生成過氧化氫,使有色中間產物的生成受阻,導致吸光值下降,鄰苯三酚自氧化速率降低,可作為測定SOD活性的理論依據.2材料和方法2.1實驗試劑與儀器0.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2,內含2mmol/LEDTA):0.2mol/LTris(內含4mmol/LEDTA)100ml與0.2mol/LHCl44.76ml混合,加雙蒸水至200ml,調pH8.2±0.01;鄰苯三酚(45mmol/L):以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液,存放于冰箱備用;所用試劑均為國產分析純;實驗用水為自制雙蒸水;PHS-3C型數字酸度計;TU-1800型分光光度計.2.2方法2.2.1鄰苯三酚用量的測定在試管中按表1加入緩沖液和雙蒸水,于25℃恒溫20min后加入25℃預熱過的鄰苯三酚(對照管用10mmol/L鹽酸代替),迅速搖勻,立即傾入比色杯中,在波長325nm處每30s測定一次吸光值A0.2.2.2sod的用量SOD活性測定法按上述表1操作,加入鄰苯三酚前,先加入一定量SOD,并減少同體積雙蒸水,其它操作均與上述2.2.1相同,所測吸光度為ASOD.抑制率=(△A0-△ASOD)/△A0×100%3結果與討論3.1edta和二甲酸鈉對本活力測定體系的影響在經典鄰苯三酚自氧化法中,文獻報道的緩沖液介質組成較混亂,文獻報道的方法中大多在緩沖液中加入EDTA,但也有的不加.有的在緩沖液介質中加入二甲胂酸鈉,但也有不加者.為此,我們研究了EDTA和二甲胂酸鈉對本活力測定體系的影響,實驗中各緩沖液的pH均為8.20±0.01;SOD加入量均為250ng/mL.3.1.1緩沖液中edta的用量表2實驗表明無EDTA時,鄰苯三酚自氧化速率很高、吸光值與時間的線性范圍狹小、SOD抑制率很低,由此可見緩沖液中的EDTA量雖小,但它的作用卻很大,因此向緩沖液中加入適量EDTA是十分必要的.3.1.2鄰苯三酚自氧化對sod活性的影響表3實驗結果表明二甲胂酸鈉在鄰苯三酚自氧化活力測定體系中無論是鄰苯三酚自氧化初速率、吸光值、SOD抑制率還是時間的線性范圍均無顯著影響.而且二甲胂酸鈉是有毒物質,因此在鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性實驗中不需加入二甲胂酸鈉.3.2鄰苯三酚自氧化速率及sod抑制率固定體系其它測定條件不變,并將體系SOD加入量定為250ng/mL,僅改變緩沖溶液中EDTA濃度進行實驗.表4實驗結果表明當體系中EDTA加入量大于0.1mmol/L時,鄰苯三酚自氧化速率及SOD抑制率均基本保持不變;而當其加入量小于0.1mmol/L時,鄰苯三酚自氧化速率大大加快,SOD抑制率顯著降低.因為一定量的SOD其歧化超氧陰離子自由基(O2—)的能力是一定的,隨著鄰苯三酚自氧化速率的增加,超氧陰離子自由基(O2—)的生成速率也在增加,結果必然造成等量SOD對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率降低,從而使測試的靈敏度下降.因此體系中EDTA加入量應不小于0.1mmol/L.3.3緩沖液ph值的確定pH值在鄰苯三酚自氧化中起重要作用,控制測定體系其它條件不變,SOD加入量也固定(250ng/mL),僅改變緩沖溶液的pH值進行實驗.實驗結果表明,鄰苯三酚自氧化速率隨pH的升高而增大(見圖1),SOD抑制率則隨pH的升高而降低(見圖2).其中在pH=7.70～8.20范圍內,對鄰苯三酚自氧化速率及SOD抑制率影響都不太大.但當pH低于或高于此范圍時,微小的pH變化會引起鄰苯三酚自氧化速率的顯著變化,從而導致SOD抑制率的顯著變化.當pH<7.50時,雖然SOD抑制率很高,但此時由于鄰苯三酚自氧化速率很低,不便于吸光值的準確讀數.綜合考慮諸因素的影響,本文選pH8.20±0.01作為緩沖液適宜的pH值.4緩沖液用量的影響文獻報道的鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的測定條件各不相同,這就造成了測定結果的混亂和缺乏可比性.根據實驗結果,我們認為鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的活力測定體系中緩沖液中的EDTA量雖小,但它的作用卻很大,因此向緩沖液中加入適量EDTA是十分必要的,且EDTA加入量應不小于0.1mmol/L.二甲胂酸鈉是有毒物質在鄰苯三酚自氧化活