ThecentralroleofUDPGDHplayedincapsuleandotherpolysaccharidessynthesis.KPS,capsulepolysaccharide;LPS,lipopolysaccharide簡并引物設計方法（1） 利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質或cDNA編碼的氨基酸序列因為密碼子的關系，不同的核苷酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統，查找到一條相關序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過蛋白查蛋白），在整個NR數據庫中查找與之相似的氨基酸序列。（2） 對所有的序列進行多序列比對將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對，可選工具有ClustalW/X也可在線分析。所有序列的共有部分將會顯示出來。“*”表示保守，“：”表示次保守。（3） 確定合適的保守區域設計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區域，且兩個保守區域相距50~400個氨基酸殘基為宜，使得PCR產物在150~1200bp之間，最重要的是每一個保守區域至少有6個氨基酸的保守區，因為每條引物至少18bp左右。若比對結果保守性不是很強很可能找不到6個氨基酸序列的保守區，這時可以根據物種的親緣關系，選擇親緣關系近的物種進行二次比對，若保守性仍達不到要求，則需進行三次比對，總之，究竟要選多少序列來比對，要根據前一次的結果反復調整。最終目的就是有兩個6個氨基酸且兩者間距離合適的保守區域。（4） 利用軟件設計引物當得到保守區域后，就可以利用專業的軟件來設計引物了，其中Primer5.0支持簡并引物的設計，將參與多序列比對的序列中的任一條導入Primer5.0中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/C/T，B=C/G/T，V=A/C/G，D=A/G/T，N=A/C/G/T，該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區域的對應部分，在Primer5.0中修改參數，令其在兩個距離合適的保守的nt區域內尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區域內，結果會有數對，分數越高越好。（5） 對引物的修飾若得到的引物為：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3則簡并度二4x2x4^3x4^3x2=2304，很明顯該條引物的簡并度很高不利于PCR，可以通過次黃嘌吟代替N（因為次黃嘌吟可以很好的和4種堿基配對）和根據物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度。這樣設計出來的簡并引物對，適用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。簡并引物設計原則從蛋白到核酸，請注意：（1） 盡量選擇簡并度低的氨基酸區域為引物設計區，如蛋氨酸和色氨酸僅有一個密碼子。（2） 充分注意物種對密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。（3） 引物不要終止于簡并堿基，對大多數氨基酸殘基來說，意味著引物的3末端不要位于密碼子的第三位。（4） 在簡并度低的位置，可用次黃嘌吟（dI）代替簡并堿基。以上幾點遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡并度，尤其在3'末端或近3'末端。TAIL-PCR引物設計W?般的PCR反應相比，TAIL-PCR反應對引物的要求較高，引物的設計很是重要，特異性引物和筒并引物的選擇且接影響擴增的效果.特異引物設計3個嵌套的特異性引物長度?般在20-30bp之間，Tin值-般設為SP1、SP2和SP3之間最好相距100bp以上以便在屯泳肘更容易區分3輪PCR產物。 口e.網V簡井引物是按照物種普遍存在的蛋白質的保守氨基酸序列設計的，相對較短，長度-般是14bp左右，Tm值介于3Q-48T之間，AD引物是否最住與它的簡弁度、引物箕度和核吾酸序列蛆成有很大關系，為丁更好的與目標序列退火：苜光，盡量選拜簡并度低的菱慕酸區域作為引物設計區；其次，充分注意物種對于密碼子的餉好性，選樣該物種使用頻率高的密嗎子，以降低引物的簡并性；最后，盡量避免3,末端的簡并，

生物信息學分析內容WWl^O加想數瑁質控11生物信且分析流程圖TAIL-PCR反應條件■Riblr2TAIL-FCRfs.應混合液的坍成<30plL>Keu^entAmount-inpriinaryRea^icimjuLAmnuniinsecondan1reaction^LAmouniintertiaryreactiom'yLlOXFC'Rbuffer2222mmolZLdNIPS222IDyjmol'LgenespecificPrimer11I10iiihdL'LAFPr