第十章核酸的生物合成詳解演示文稿本文檔共71頁；當前第1頁；編輯于星期三\14點42分優選第十章核酸的生物合成本文檔共71頁；當前第2頁；編輯于星期三\14點42分半保留復制（semiconservativereplication）：在DNA復制時，親代DNA的雙螺旋先行解旋和分開，然后以每條鏈為模板，按照堿基配對原則，在這兩條鏈上各形成一條互補鏈。這樣，從親代DNA的分子可以精確地復制成2個子代DNA分子。每個子代DNA分子中，有一條鏈是從親代DNA來的，另一條則是新形成的。DNA的生物合成機制——半保留復制本文檔共71頁；當前第3頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第4頁；編輯于星期三\14點42分1957年Meselson及Stahl通過實驗證實了半保留復制的模式。半保留復制的實驗證據本文檔共71頁；當前第5頁；編輯于星期三\14點42分1963年，Cairns用放射自顯影的方式觀察到大腸桿菌正在復制中的DNA，在用氚標記的胸苷復制近兩代，放射自顯影，未復制部分銀密度低，由一條放射鏈和一條非放射鏈組成；已復制部分有一條雙鏈是放射的，一條雙鏈有一半是放射的。這證明大腸桿菌DNA是環狀分子，以半保留方式復制。半保留復制的實驗證據本文檔共71頁；當前第6頁；編輯于星期三\14點42分1956年，Arthur

Kornberg首先從大腸桿菌中發現DNA聚合酶（DNA聚合酶Ⅰ）。70－71年分離出Ⅱ和Ⅲ。1999年發現Ⅳ、Ⅴ，涉及錯誤傾向修復DNA聚合酶及其發現本文檔共71頁；當前第7頁；編輯于星期三\14點42分以四種dNTP為底物需要模板指導需要有引物3’-羥基存在DNA鏈的生長方向是5’→3’產物DNA的性質與模板相同DNA聚合酶的反應特點本文檔共71頁；當前第8頁；編輯于星期三\14點42分大腸桿菌DNA聚合酶本文檔共71頁；當前第9頁；編輯于星期三\14點42分小片段/323aa5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段/

604aa5′→3′聚合/

5核酸外切N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠ

Klenow片段本文檔共71頁；當前第10頁；編輯于星期三\14點42分真核生物DNA聚合酶有α、β、γ（線粒體）、δ、ε五種核DNA的復制主要由α、δ完成；α最初認為相當于聚合酶Ⅲ，現認為主要用于引發（因為無校正功能，僅其有引發功能）；δ能持續合成，且有校正功能。ε相當于Ⅰ，主要起修復作用，γ位于線粒體，β為修復酶。本文檔共71頁；當前第11頁；編輯于星期三\14點42分DNA連接酶本文檔共71頁；當前第12頁；編輯于星期三\14點42分DNA連接酶使雙鏈DNA切口處的5’-磷酸和3’-羥基生成磷酸二酯鍵。需供能，細菌用NAD，動物和噬菌體用ATP，形成焦磷酸鍵的活化形式，再由3’羥基發動親核攻擊，形成磷酸二酯鍵。大腸桿菌的連接酶作用于粘末端，T4的還可作用于平末端。本文檔共71頁；當前第13頁；編輯于星期三\14點42分DNA的合成是以四種三磷酸脫氧核糖核苷為底物的聚合反應，該過程除了需要酶的催化之外，還需要適量的DNA為模板，RNA（或DNA）為引物和鎂離子的參與。催化這個反應的酶也有多種，除DNA聚合酶外，還有RNA引物合成酶（即引發酶），DNA連接酶、拓撲異構酶、解螺旋酶及單鏈結合蛋白多種蛋白質因子參與。DNA復制有關的酶及相關蛋白因子本文檔共71頁；當前第14頁；編輯于星期三\14點42分DNA的復制拓撲異構酶拓撲異構酶Ⅰ:切斷DNA雙鏈中一股鏈，封閉切口，反應不需ATP。拓撲異構酶Ⅱ:切斷DNA分子兩股鏈，利用ATP供能，連接斷端。本文檔共71頁；當前第15頁；編輯于星期三\14點42分DNA的復制過程——復制的起始復制的起始點：從DNA分子的特定部位開始，此特定部位稱為復制起始點（originofreplication），可以用ori表示。原核生物常只有一個起始點，E.Coli的起點為OriC，由245個bp組成（p421），非常保守。真核生物的染色體有多個復制起始點。）本文檔共71頁；當前第16頁；編輯于星期三\14點42分DNA甲基化與DNA復制起始密切相關DNA子鏈被合成后，起點處子鏈GATC（11個）較長時間保持未甲基化。半甲基化的oriC與細胞原生質膜相結合。只有當oriC被從膜上釋放出來，子鏈被Dam甲基化后，才能有效地與DnaA蛋白結合，起始新一輪的DNA復制。本文檔共71頁；當前第17頁；編輯于星期三\14點42分DNA拓撲異構酶Ⅱ在復制起始部位將DNA引入負超螺旋。DnaA蛋白辨認、結合于起始位點，并促使解鏈。DnaB與DnaC復合物進入，生成引發前體，然后DnaB繼續發揮解鏈的作用。SSB與解開的單鏈結合，穩定和保護單鏈。引物酶(DnaG)進入并與引發前體結合生成引發體（DnaB、DnaC蛋白、引物酶和DNA起始區）。引發體中的引物酶催化NTP聚合，生成引物。DNA拓撲異構酶(Ⅱ型為主)在解鏈前方理順DNA鏈，松弛正超螺旋。原核生物DNA復制的起始本文檔共71頁；當前第18頁；編輯于星期三\14點42分DnaADnaB、DnaCDNA拓撲異構酶引物酶SSB3535復制的引發——形成引發體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復制起始區域的復合結構稱為引發體。本文檔共71頁；當前第19頁；編輯于星期三\14點42分DNA的復制起始過程說明復制的方向：一般為雙向復制。合成的開始與甲基化有關，由甲基化酶Dnm完成起始相關蛋白，DnaA、DnaB、DnaC、DnaG等復制時需要解螺旋酶和拓撲異構酶來解鏈的。單鏈結合蛋白(SSB)可與解開的單鏈結合，防止復性和水解復制有一些特殊方式。本文檔共71頁；當前第20頁；編輯于星期三\14點42分復制叉、滯后鏈、岡崎片段與不連續復制復制叉由5’向3’方向連續復制，稱為前導鏈；另一條鏈復制叉由3’向5’移動，稱為滯后鏈。滯后鏈的復制中，形成許多不連續片段，稱為岡崎(Okazaki)片段。岡崎片段連接成完整的DNA引物合成酶由5’向3’方向合成RNA引物聚合酶Ⅲ在引物3’-羥基上合成DNA聚合酶Ⅰ切除引物，填補空白DNA連接酶將岡崎片段連接起來本文檔共71頁；當前第21頁；編輯于星期三\14點42分向導鏈滯后鏈岡崎片段5′5′3′3′5’3’本文檔共71頁；當前第22頁；編輯于星期三\14點42分DNA的復制過程：半保留的半不連續復制本文檔共71頁；當前第23頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第24頁；編輯于星期三\14點42分其他DNA復制模式滾環復制D環復制（線粒體DNA)本文檔共71頁；當前第25頁；編輯于星期三\14點42分端粒和端粒酶的發現30年代，Muller等發現對保持染色體穩定十分重要的染色體末端結構—端粒。1972年JamesWatson提出復制末端問題。1984年，Blackburn發現草履蟲（無限增殖）具有重建端粒的酶——端粒酶。本文檔共71頁；當前第26頁；編輯于星期三\14點42分端粒端粒是真核生物線性染色體的兩個末端所具有的特殊結構,其由許多成串的短的重復序列組成。功能：維持染色體的穩定性；保證染色體末端DNA復制的完整性TTAGGGTTAGGG…本文檔共71頁；當前第27頁；編輯于星期三\14點42分端粒酶(telomerase)端粒酶由RNA和蛋白質組成。兼有模板和逆轉錄酶兩方面的作用多莉與細胞的死亡本文檔共71頁；當前第28頁；編輯于星期三\14點42分爬行模型動畫演示本文檔共71頁；當前第29頁；編輯于星期三\14點42分PCR——多聚酶鏈式反應聚合鏈式反應（PolymeraseChainReaction），K.Mullis1985年發明。是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，又稱為基因的體外擴增法。PCR技術的原理與細胞內發生的DNA復制過程十分類似。1993年獲得諾貝爾獎本文檔共71頁；當前第30頁；編輯于星期三\14點42分PCR主要包括三個階段變性DNA在高溫94℃變性，形成兩條單鏈。

退火反應體系降溫至50-60℃，模板DNA與引物結合。延伸反應體系升溫至72℃，耐熱DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，在引物的指導下，復制出互補的DNA。本文檔共71頁；當前第31頁；編輯于星期三\14點42分一種PCR反應體系

10×擴增緩沖液10ul4種dNTP混合物各200μmol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加雙或三蒸水至100μl本文檔共71頁；當前第32頁；編輯于星期三\14點42分94℃，預變性5分鐘94℃，變性1分鐘55℃，退火1分鐘72

℃，延伸1分鐘最后一次72

℃，延伸5分鐘

30個循環一種PCR反應程序設計本文檔共71頁；當前第33頁；編輯于星期三\14點42分生物因素、物化因素均可導致DNA的損傷1.

物理因素

紫外線、

電離輻射、αβγX-射線等2.

化學因素

烷化劑、

堿基或核苷類似物、亞硝酸鹽及亞硝胺、

代謝活化化合物（苯并笓、黃曲霉毒素等）以上物理及化學因素統稱誘變劑。3.

生物因素

DNA、RNA腫瘤病毒可插入基因組，引起突變。

復制時的堿基錯配，互變異構、堿基脫氨、堿基丟失。本文檔共71頁；當前第34頁；編輯于星期三\14點42分DNA的損傷修復主要有五種修復系統：錯配復活（mismatchrepair)直接修復（directrepair)切除修復（excisionrepair）重組修復（recombinationrepair）易錯修復（error-pronerepair）本文檔共71頁；當前第35頁；編輯于星期三\14點42分錯配復活(MismatchRepair)原核細胞內存在Dam甲基化酶，能使5`GATC中A的N6位甲基化。復制后DNA在短期內（數分鐘）為半甲基化的GATC序列。細胞錯配系統能區別新鏈與舊鏈。MutS二聚體與其識別結合，兩向移動形成突環至GATC。核酸內切酶（MutH）從未甲基化的GATC5’端開切，重新合成（DNA聚合酶）本文檔共71頁；當前第36頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第37頁；編輯于星期三\14點42分直接修復（DirectRepair)光復活酶可被可見光激活，分解UV照射形成的嘧啶二聚體。O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶能去除O6上的甲基，恢復正常的鳥嘌呤。

UV本文檔共71頁；當前第38頁；編輯于星期三\14點42分O6-甲基鳥嘌呤甲基轉移酶去除O6上的甲基本文檔共71頁；當前第39頁；編輯于星期三\14點42分切除修復（ExcisionRepair）是細胞內最重要和有效的修復機制，主要由DNA-polⅠ和連接酶完成。多種特異的核酸內切酶，識別DNA損傷部位，在其附近將DNA單鏈切開，再由外切酶將損傷鏈切除，由聚合酶以完整鏈為模板進行修復合成，最后有連接酶封口。本文檔共71頁；當前第40頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第41頁；編輯于星期三\14點42分重組修復——稀釋錯誤此過程也叫復制后修復。重組修復中原損傷沒有除去，若干代后可逐漸稀釋。所需要的酶包括與重組及修復合成有關的酶。本文檔共71頁；當前第42頁；編輯于星期三\14點42分易錯修復（Error-ProneRepair）SOS反應：是細胞DNA受到損傷或復制系統受到抑制的緊急情況下，為求得生存而出現的應急效應。紫外線照射過的E.Coli較未照射過的E.Coli，接受紫外線照射過的λ噬菌體感染時存活率高。SOS反應誘導的修復系統包括避免差錯修復(errorfreerepair)和易產生差錯修復.本文檔共71頁；當前第43頁；編輯于星期三\14點42分逆轉錄（ReverseTranscription)以RNA為模板,指導DNA合成的過程稱為逆轉錄，由逆轉錄酶催化進行。1964年Temin提出前病毒假設。1970年Temin和Baltimore同時分別從(雞)勞氏肉瘤病毒和小白鼠白血病病毒等致癌RNA病毒中分離出反轉錄酶1975年，二人獲得諾貝爾獎本文檔共71頁；當前第44頁；編輯于星期三\14點42分RNA模板逆轉錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNA酶單鏈DNA逆轉錄酶雙鏈DNA逆轉錄病毒的復制本文檔共71頁；當前第45頁；編輯于星期三\14點42分逆轉錄酶的酶學性質逆轉錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性：RNA指導的DNA聚合酶活性DNA指導的DNA聚合酶活性核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA。本文檔共71頁；當前第46頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第47頁；編輯于星期三\14點42分轉錄（transcription）

生物體以DNA為模板合成RNA的過程不對稱轉錄：DNA片段轉錄時，雙鏈DNA中只有一條鏈作為轉錄的模板。原料：四種NTP合成過程:無需引物，連續，方向：5‘→3’從頭合成本文檔共71頁；當前第48頁；編輯于星期三\14點42分不對稱轉錄指導RNA合成的DNA鏈為模板鏈（負鏈，反意鏈），另一條DNA鏈為編碼鏈（正鏈，有意義鏈）DNA鏈上只有部分的區段作為轉錄模板，且模板鏈并非自始至終位于同一股DNA單鏈上5′···GCAGTACATGTC···3′編碼鏈3′···CGTCATGTACAG···5′模板鏈5′···GCAGUACAUGUC···3′mRNAN······Ala·Val·His·Val······C

蛋白質轉錄翻譯本文檔共71頁；當前第49頁；編輯于星期三\14點42分1960年發現。全酶：α2ββ’σ，其中α2ββ’為核心酶，σ因子識別轉錄起始位點。5’→3’聚合活性，無外切酶活性合成起始不需引物RNA聚合酶（E.coli）

本文檔共71頁；當前第50頁；編輯于星期三\14點42分原核生物的轉錄起始起始包括對雙鏈DNA特定部位的識別、局部（17bp）解鏈以及在最初兩個核苷酸間形成磷酸二酯鍵。第一個核苷酸摻入的位置稱為轉錄起點。σ識別起始位點，RNApol全酶解開雙鏈DNA10～20bp形成轉錄空泡。在RNA聚合酶作用下發生第一次聚合反應，形成轉錄起始復合物。本文檔共71頁；當前第51頁；編輯于星期三\14點42分E.coli的啟動子(promoter)啟動子：RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列。足跡法和DNA測序確定啟動子序列結構。本文檔共71頁；當前第52頁；編輯于星期三\14點42分開始轉錄TTGACAAACTGT-35區PribnowboxTATAATPuATATTAPy-10區1-30-5010-10-40-205335－35序列55RNA聚合酶保護區結構基因33原核生物啟動子結構－35序列，提供RNA聚合酶識別的信號，pribnowbox，有助于局部解鏈本文檔共71頁；當前第53頁；編輯于星期三\14點42分本文檔共71頁；當前第54頁；編輯于星期三\14點42分原核生物轉錄的延伸過程σ因子脫落，核心酶變構，與模板鏈結合變松，沿DNA滑動。轉錄泡隨核心酶滑動而移動，生成的RNA與DNA模板形成約12bp雜化雙鏈，過長的RNA脫離模板鏈，伸出轉錄泡外本文檔共71頁；當前第55頁；編輯于星期三\14點42分原核生物轉錄的終止提供終止信號的DNA序列，稱為終止子核心酶識別終止信號，停止轉錄。兩類終止子：依賴和不依賴ρ因子的終止子本文檔共71頁；當前第56頁；編輯于星期三\14點42分順式作用元件（cis-actingelement）是指那些與結構基因表達調控相關、能夠被基因調控蛋白特異性識別和結合的特異DNA序列。包括啟動子、上游啟動子元件、增強子（又稱遠上游信號）、加尾信號和一些反應元件等。存在于基因旁側序列中能影響基因表達的序列，順式作用元件本身不編碼任何蛋白質。本文檔共71頁；當前第57頁；編輯于星期三\14點42分反式作用因子（trans-actingfactor）參與基因表達調控的因子,通過與特異的靶基因的順式元件結合起作用。轉錄因子:與轉錄有關的反式作用因子反式作用因子對基因表達的調控可正(激話)可負(阻遏)。本文檔共71頁；當前第58頁；編輯于星期三\14點42分真核生物RNA聚合酶種類IIIIII轉錄產物45S-rRNAhnRNA5S-rRNAtRNAsnRNA鵝膏蕈堿耐受極敏感中度敏感利福平不敏感不敏感不敏感亞細胞定位核仁核質核質本文檔共71頁；當前第59頁；編輯于星期三\14點42分真核生物轉錄啟動啟動子有3類，分別由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種酶進行轉錄。啟動子由轉錄因子而非RNA聚合酶識別。Ⅰ、Ⅲ的啟動子種類有限，識別所需輔助因子也較少。酶Ⅱ復雜：基本上由各種順式作用元件組合而成，其分布在轉錄起點上游約200bp的范圍內。本文檔共71頁；當前第60頁；編輯于星期三\14點42分類別Ⅱ啟動子涉及眾多編碼蛋白質的基因的表達。包括：基本啟動子、起始子、上游元件、應答元件。基本啟動子：TATA（Goldberg-Hogness)Box基本啟動子是RNA聚合酶和通用因子形成前起始復合物的主要裝配點。本文檔共71頁；當前第61頁；編輯于星期三\14點42分起始子TATA盒CAAT盒GC盒增強子轉錄起始前的上游區段

AATAAA切離加尾修飾點外顯子翻譯起始點內含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體轉錄起始點本文檔共71頁；當前第62頁；編輯于星期三\14點42分POL-ⅡTFⅡFRNA聚合酶Ⅱ的轉錄前起始復合物（PIC）POL-ⅡTFⅡFⅡHⅡETFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復合物ⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-PPIC組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化本文檔共71頁；當前第63頁；