關于動物細胞表達制備藥用蛋白第1頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三思考要制備出我們想要的蛋白，需要了解些什么，做些什么？第2頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三

生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得常用生產(chǎn)用動物細胞的特性基因工程細胞構(gòu)建和篩選第3頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三

生產(chǎn)用動物細胞的要求和獲得（1）原代細胞是直接取自動物組織器官,經(jīng)過消化分離而獲得。用量大，浪費時間。常用的有：雞胚細胞、原代兔腎細胞、鼠腎細胞等。NO.1第4頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三（2）二倍體細胞系原代細胞經(jīng)過傳代篩選克隆，挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。二倍體細胞有正常細胞的特點：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。第5頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三（3）轉(zhuǎn)化細胞系常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細胞特點，而獲得無限增殖能力。自發(fā)人工誘變第6頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三常用生產(chǎn)用動物細胞的特性

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細胞系。核型為2n=46。成纖維細胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,

倍增時間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。NO.2第7頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。核型為2n=46。屬成纖維細胞。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。第8頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三BHK-21:從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細胞構(gòu)建。第9頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴的成纖維細胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。第10頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三基因工程細胞構(gòu)建和篩選NO.3真核細胞基因表達載體的構(gòu)建使用的載體有兩類：1）病毒載體牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒2）質(zhì)粒載體第11頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三

1）病毒載體牛痘病毒：用構(gòu)建多價疫苗腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒：用于基因治療。

桿狀病毒：用于外源基因表達。第12頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三2）質(zhì)粒載體在細菌和哺乳動物細胞體內(nèi)都能擴增。都含有如下基本成分：①允許載體在細菌體內(nèi)擴增的質(zhì)粒序列。②含有使基因表達的調(diào)控元件。③能用以篩選出外源基因已整合的選擇標記。④有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴增系統(tǒng)。第13頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選第14頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三1）基因載體的導入基因載體導入動物細胞最常用方法是：

磷酸鈣沉淀法電穿孔法

第15頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三磷酸鈣沉淀法：溶解的DNA加Na2HPO4和CaCl2形成磷酸鈣沉淀，DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當和細胞表面接觸時，則通過細胞吞噬作用而將DNA導入。第16頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三電穿孔法：

借助電穿孔儀的高壓脈沖電場，使細胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進入細胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。第17頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三真核生物細胞生產(chǎn)藥用蛋白優(yōu)點：①具有準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu),理化特性最接近于天然蛋白分子；②具有產(chǎn)物胞外分泌功能，便于下游產(chǎn)物分離純化；③具有重組基因的高效擴增和表達能力；④具有貼壁生長特性，且有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可以進行懸浮培養(yǎng)，表達水平較高；⑤CHO（注射用重組人促紅素

）細胞屬于成纖維細胞，很少分泌自身的內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離。因此，可以針對性的篩選細胞株第18頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三

由于CHO-dhfr-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。二氫葉酸還原酶能夠被葉酸類似物氨甲喋呤(methotrexate,MTX)所抑制,用含有目的基因及與之相連的DHFR基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化CHOdhfr細胞,利用濃度不斷提高的MTX選擇抗MTX的細胞系,其中DHFR基因及與之相連的目的基因一起擴增,從而使目的基因高水平表達。主要采用DHFR系統(tǒng)和GS系統(tǒng)

2）高效表達工程細胞株的篩選二氫葉酸還原酶系統(tǒng)DHFR第19頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三第20頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三DHFR擴增僅僅發(fā)生在二個等位基因中的一個。在穩(wěn)定系中擴增的基因得以保持，因為它們位于染色體上DHFR基因座上（均勻染色區(qū)），而其等位基仍保持正常的單拷貝。而在不穩(wěn)定系中當選擇壓力消除時，擴增的基因至少會部分丟失，但未丟失的是以染色體外的方式（雙微體）存在。第21頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三每個雙微體帶有2-4DHFR基因，雙微體可以復制，但它們沒有著絲粒，結(jié)果它們不能附著在有絲分裂的紡錘絲上，因此不能均等分離進入子細胞，是染色體外的微小染色體。第22頁，講稿共25頁，2023年5月2日，星期三谷氨酰胺合成酶在ATP水解提供能量時,利用細胞內(nèi)的氨和谷氨酸合成谷氨酰胺,在缺乏細胞外谷氨酰胺的培養(yǎng)條件下,加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亞砜(methioninesulphoximine,MSX),可使GS基因及與之相連的目的基因擴增,達到提高目的基因表達水平的目的。由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程中不必使用GS缺陷型的受體細胞，而且在正常MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。主要哺乳細胞株為NS