第11章核酸的生物合成第一節DNA的生物合成第二節RNA的生物合成6/13/20231主要內容：DNA復制：DNA復制的半保存方式；DNA復制的起始點和方向；DNA復制的酶類和蛋白質；DNA復制的根本過程；DNA的修復：DNA的損傷修復，突變；RNA的生物合成：不對稱轉錄；RNA聚合酶；轉錄過程；轉錄后加工過程；RNA復制和逆轉錄：RNA復制；逆轉錄；重點：1.DNA復制；2.轉錄；難點：DNA復制和轉錄過程。6/13/20232DNA是生物遺傳的主要物質根底，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現為特定的核苷酸排列順序(三聯體密碼)，并通過DNA的復制由親代傳遞給子代。在后代的生長發育過程中，遺傳信息自DNA轉錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質，以執行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。DNA是生物遺傳的物質根底——遺傳信息的載體6/13/20233中心法那么1964-1970勞氏肉瘤病毒的遺傳方式致癌RNA病毒、植物RNA病毒病毒（復制）復制轉錄DNARNA蛋白質翻譯逆轉錄1958年，遺傳信息的單向遺傳信息的傳遞6/13/20234

復制：親代DNA或RNA在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原那么將其所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的AA順序的過程。逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。Reversetranscription6/13/20235第一節DNA的生物合成

DNA的復制〔DNA指導下的DNA合成〕逆轉錄〔RNA指導下的DNA的合成〕DNA突變DNA的損傷與修復(修復合成)6/13/20236DNA的存在形式染色體與質粒嚴緊控制質粒單拷貝質粒：每個細胞內只有一個或少數幾個拷貝松弛控制質粒多拷貝質粒：每個細胞內含有許多拷貝〔20以上〕1DNA的復制6/13/20237病毒與細菌的DNA6/13/20238真核細胞的染色體6/13/202391.1DNA的半保存復制(一)定義和實驗證據：由親代DNA生成子代DNA時，每個新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈那么是新合成的，這種復制方式叫半保存復制。半保存復制的實驗證據:1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保存復制。6/13/202310細胞在15N標記培養基中〔NH4Cl〕連續培養15代，使所有DNA分子均標記上15N，轉入14N標記的培養基CsCl密度梯度離心浮力密度

15N－DNA1.742g/ml14N－DNA

1.710g/ml15N/14NDNA1.717g/ml6/13/202311原核細胞DNA的半不連續復制復制過程復制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5′RNA引物3′3′DNA連接酶復習6/13/202312DNA的半保存復制的生物學意義：DNA的半保存復制說明DNA在代謝上的穩定性，保證親代的遺傳信息穩定地傳遞給后代。

DNA在代謝上的穩定性并非指DNA是一種惰性物質:在細胞內外各種物化因子均可導致DNA損傷，需要修復；在復制和轉錄過程中DNA會發生損耗，必須進行更新；在發育和進化過程中DNA可能進行修飾、刪除、擴增和重排；在進化的角度上，DNA更是處在不斷的變異和開展中。6/13/2023131.2復制起點、方向和方式復制起點〔origin，ori或o，復制原點〕原核生物染色體DNA〔或真核生物的細胞器DNA〕——單復制起點，即整個染色體只有一個復制單位。真核生物染色體DNA:多復制起點——一個genome中有多個復制單位復制起點：復制開始處DNA分子的特定位置復制子(Replicon)〔復制單位〕：從一個起點到一個終點所包含的DNA區域，是基因組獨立進行復制的單位。許多生物的復制起點都是富含A、T的區段6/13/202314復制叉〔Replicationfork〕：DNA復制進行時，在眼的兩側出現兩個叉子狀的生長點(growthpoint)，叫復制叉。在復制叉上分布著各種與復制有關的酶和蛋白因子，它們構成的復合物稱為復制體〔replisome〕大多數復制是雙向的，形成兩個復制叉；復制眼〔replicationeye〕：電子顯微鏡下觀察正在復制的DNA，復制的區域形如一只眼睛1.2.2復制方向及方式6/13/202315復制方式雙向復制(bi-directional)

：大多數復制從起點開始向2個方向復制2個復制叉(replicationfork)單向復制(unidirectional)

：少數復制從起點向1個方向復制1個復制叉或生長點(growingpoint)6/13/202316真核染色體DNA線環狀雙鏈E.coli染色體DNA環狀雙鏈6/13/2023171.3與DNA復制有關的酶和蛋白質1.3.1DNA聚合酶拓撲異構酶1.3.3DNA解旋酶單鏈結合蛋白引發酶及引發體1.3.6DNA連接酶目前已發現30多種酶及蛋白質因子參與DNA復制6/13/202318DNA聚合酶(DNApolymerase):延長子鏈DNA聚合酶不能從頭合成子鏈，只能延長DNA聚合酶：多種類、多種活性6/13/2023196/13/2023201〕DNA聚合反響條件〔1〕底物dNTP〔dATP，dGTP，dCTP，dTTP〕〔2〕聚合酶〔3〕模板單鏈的DNA母鏈〔4〕引物寡核苷酸引物〔RNA)〔5〕其他：解鏈酶，解旋酶，單鏈結合蛋白，連接酶6/13/2023212〕聚合機制〔1〕DNA聚合酶：5′→3′的聚合活性需引物鏈6/13/202322〔2〕DNA聚合酶：核酸外切酶活性①3′→5′外切酶活性②5′→3′外切酶活性6/13/202323在大腸桿菌中發現主要有三種DNA聚合酶，分別為：

DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ

E.coliDNA聚合酶DNA聚合酶IV和V：1999年發現，當DNA嚴重損傷時，誘導產生。6/13/202324原核生物中的DNA聚合酶在大腸桿菌中發現有三種DNA聚合酶〔用突變株研究其功能〕：⑴DNA聚合酶Ⅰ:單體酶,多肽鏈內含一個鋅原子〔其鰲合劑是O-二氮雜菲〕，多功能酶。它具有53聚合酶功能〔對脫氧核苷酸的選擇〕；35外切酶活性〔對雙鏈無作用，校對功能。但在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈〕及53外切酶活性〔雙鏈有效，主要是對DNA損傷的修復，以及在DNA復制時RNA引物切除及其空隙的填補〕；在DNA鏈的3形成焦磷酸解〔生理意義不大〕；無機焦磷酸鹽與dNTP之間的焦磷酸基交換。⑵DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，但聚合活力很低；具有35外切酶活性。其它生理功能尚不清楚，可能在修復紫外光引起的DNA損傷中起作用。

6/13/202325⑶DNA聚合酶Ⅲ：是原核生物DNA復制的主要聚合酶，該酶由10種亞基組成，其中、、形成全酶的核心酶。具有53DNA聚合酶活性〔亞基，速率高〕；具有35外切酶〔亞基〕的校對功能，提高DNA復制的保真性；還具有53外切酶活性〔單鏈有效，其意義未知〕。〔4〕DNA聚合酶IV和V：1999年發現，當DNA嚴重損傷時，誘導產生。6/13/202326DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ亞基數目1〔單體酶〕多亞基酶多亞基酶5′→3′聚合活性+中+很低+很高3′→5′外切活性+++5′→3′外切活性+——主要是對DNA損傷的修復；以及在DNA復制時切除RNA引物并填補其留下的空隙。修復紫外光引起的DNA損傷DNA復制的主要聚合酶，還具有3′-5′外切酶的校對功能，提高DNA復制的保真性6/13/202327拓撲異構酶?：使DNA一條鏈發生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反響不需要能量。主要集中在活性轉錄區，同轉錄有關。

拓撲異構酶Π：使DNA兩條鏈發生斷裂和再連接。當引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，同復制有關。二者共同控制DNA的拓撲結構。1.3.2拓撲異構酶：催化DNA的拓撲鏈環數發生變化的酶，在DNA重組修復和其他轉變方面起重要作用。除鏈環數不同外其它性質均相同的DNA分子稱為拓撲異構體，引起拓撲異構體反響的酶稱為拓撲異構酶(Topo，解超螺旋酶)6/13/202328TopoⅠ：切開DNA中的一條鏈，與另一條鏈解纏繞或再纏繞→連接TopoⅡ同時切開DNA雙鏈解旋或再螺旋→連接6/13/202329本質：切斷DNA磷酸二酯鍵改變DNA的鏈環數，再連接兼具DNA內切酶、連接酶的性質斷裂、連接反響相互耦聯不能連接事先已經存在的斷裂DNA6/13/2023306/13/2023316/13/2023321.3.3解螺旋酶〔解鏈酶〕：通過水解ATP將DNA兩條鏈翻開。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個ATP分子。1.3.4單鏈結合蛋白(SSB-single-strandbindingprotein)：穩定已被解開的DNA單鏈，阻止復性和保護單鏈不被核酸酶降解。6/13/202333引發酶及引發體引發前體:它由多種蛋白質dnaA、dnaB、dnaC、n、n′、n′′和i組成。引發酶：此酶以DNA為模板合成一段RNA,這段RNA作為合成DNA的引物〔Primer)。實質是以DNA為模板的RNA聚合酶。引發前體再與引發酶結合組裝成引發體。引發體可以沿模板鏈5’3’方向移動,具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發RNA引物的合成。移動和引發均需要ATP提供能量，引發體的移動與復制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。以DNA為模板合成一段RNA,作為合成DNA的引物。6/13/202334DNA中一條鏈有切口，切口一端是3′-OH，另一端是5′-磷酸基，連接酶可催化這兩端形成磷酸二酯鍵，使切口連接。不能將兩條游離的DNA單鏈連接起來。DNA連接酶大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量，在高等生物和噬菌體中，那么要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能在模板鏈上連接DNA和DNA鏈之間的切口，而且能連接無單鏈粘性末端的平頭雙鏈DNA。

6/13/2023356/13/202336連接酶的反響機制：酶+NAD+(ATP)酶-AMP+煙酰胺單核苷酸〔PPi〕酶-AMP+P-5‘-DNA酶+AMP-P-5’-DNADNA-3’-OH+AMP-P-5’-DNADNA-3’-O-P-5’-DNA+AMPDNA連接酶在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用作用6/13/202337酶-AMPAMP-P-5’-DNA磷酰胺鍵以焦磷酸活化磷原子6/13/202338拓撲異構酶解鏈酶單鏈結合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發體DNA連接酶引物DNA雙鏈′5′3′5′3DNA復制有關的酶和蛋白質6/13/202339拓撲異構酶解鏈酶單鏈結合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發體DNA連接酶引物拓撲異構酶與DNA雙鏈結合，解開超螺旋。′5′3′5′3DNA復制有關的酶和蛋白質6/13/202340拓撲異構酶解鏈酶單鏈結合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發體DNA連接酶引物解鏈酶解開DNA雙螺旋′5′3′5′3DNA復制有關的酶和蛋白質6/13/202341拓撲異構酶解鏈酶單鏈結合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發體DNA連接酶引物單鏈結合蛋白防止復螺旋′5′3′5′3DNA復制有關的酶和蛋白質6/13/202342拓撲異構酶解鏈酶單鏈結合蛋白DNA聚合酶引物酶及引發體DNA連接酶引物引物酶合成引物′5′3′5′3DNA復制有關的酶和蛋白質6/13/2023431.4

DNA的半不連續復制

1968年由岡崎通過實驗證明DNA復制是半不連續的6/13/202344岡崎片段的發現〔1968〕：同位素實驗，3HdT短時間內為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當用DNA連接酶的變異株時，檢測到大量DNA片段的積累——證明DNA復制中有小片段合成。由于U替代dT，被尿嘧啶-DNA-糖苷酶切除。測定DNA小片段，遠遠大于合成DNA的一半。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，檢測到一半3H標記出現在小片段〔岡崎片段〕中。后兩個實驗說明：在DNA復制時只有一條鏈是不連續的！6/13/202345領頭鏈—在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向一致并連續合成的鏈〔前導鏈〕。隨后鏈—在DNA復制時，合成方向與復制叉移動的方向相反，形成許多不連續的片段，最后再連成一條完整的DNA鏈〔滯后鏈〕。這些不連續的片斷，稱為岡崎片斷。每個岡崎片段的合成也都需要引物。岡崎片段：真核生物中100-200個核苷酸〔核小體的DNA單位〕。原核生物中1000-2000個核苷酸。半不連續復制〔semidiscontinuousreplication〕—在DNA復制時，領頭鏈是連續合成的,而隨后鏈的合成是不連續的，這種復制方式稱為半不連續復制。

6/13/2023463‘5‘3‘5‘1.4.2半不連續復制6/13/202347岡崎片段合成后由DNA聚合酶Ⅰ切除RNA引物并催化合成一段DNA填補留下的空隙。再由DNA連接酶把他們連成一條完整的子代鏈，稱為滯后鏈。6/13/2023481.5

E.coli.染色體DNA復制過程

起始延伸終止6/13/202349解鏈引發延長復制起點RNA前體復制的起始6/13/202350大腸桿菌復制的起點由245個bp構成，其序列很保守，有兩組短的重復：3個13bp的序列和4個9bp的序列6/13/20235120個DnaA結合在四組9bp重復區，形成起始復合物，DNA環繞此復合物。三組13bp重復區依次變性，產生開放型復合物。DnaB〔解螺旋酶〕在DnaC協助下與開放復合物結合，進一步解鏈。解鏈時帶來的扭曲張力還需DNA旋轉酶〔屬DNA拓撲異構酶Ⅱ〕引入負超螺旋消除。6/13/202352單鏈結合蛋白(SSB〕結合在單鏈區，阻止復性和保護單鏈DNA不被核酸酶降解引發體：引物合成酶與各種蛋白質因子構成的復合體〔引發體〕，以DNA為模板合成RNA引物〔6-10個堿基〕——引發6/13/202353復制叉拓撲異構酶解螺旋酶引物單鏈結合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA的復制原點，雙股螺旋解開，成單鏈狀態，分別作為模板，合成其互補單鏈。解鏈6/13/202354引發體在復制叉上移動，識別合成的起始位點，引發RNA引物的合成。領頭鏈先引發開始合成，以原來一條DNA單鏈為模板〔3’5’),按5’3’的方向合成一段RNA引物鏈。領頭鏈開始合成后，隨后鏈也開始合成其引物。在引物的3’端為游離的羥基。復制叉拓撲異構酶解螺旋酶引物單鏈結合蛋白（SSB)引物合成酶引物RNA引物合成DnaB蛋白活化引物合成酶。引物長度約為幾個至10個核苷酸，與復制叉移動的方向相同，〔引物酶的底物是核苷三磷酸〕5’端含3個磷酸殘基，6/13/202355大腸桿菌復制原點起始復制所需蛋白質SSB解鏈酶引物引物酶拓撲異構酶打開DNA超螺鏈打開雙螺旋合成防止復螺旋6/13/202356復制叉拓撲異構酶解螺旋酶引物單鏈結合蛋白（SSB)引物合成酶引物在DNA聚合酶Ш的催化下，以脫氧核糖核苷酸為底物，在RNA引物的3′端加上脫氧核糖核苷酸。

1.5.2DNA鏈的延伸6/13/202357DNA鏈的延伸以復制叉向前移動的方向為標準，一條模板鏈是3′5′走向，與之互補的DNA能以5′3′的方向連續合成，稱為前導鏈（領頭鏈）。另一條模板鏈是5′3′走向，與其互補的DNA也是5′3′方向合成，與復制叉移動方向正好相反，隨復制叉的移動，形成許多不連續的片斷，稱為岡崎片斷。每個岡崎片段的合成也都需要引物。6/13/202358延伸前導鏈只需要一個RNA引物，隨后鏈的每一個岡崎片段都需要一個RNA引物。鏈的延長反響由DNApol.Ⅲ催化。復制體：在DNA合成的生長點〔既復制叉上〕分布著許多與復制有關的酶和輔助因子，它們在DNA的模板鏈形成離散的復合物，彼此配合進行高度精確的復制。6/13/202359α、ε和θ三種亞基組成核心酶,核心酶形成二聚體β-亞基猶如一個夾子夾住DNA分子，并向前滑動，使DNA聚合酶在完成復制前不再脫離DNA6/13/202360復制體沿著復制叉方向前進，同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。一分子的DNApolIII.協同合成前導鏈和滯后鏈，因此滯后鏈必須繞成一個突環。5’3’3’5’6/13/202361DNA合成的終止E

E.coli有兩個終止區域，分別結合專一性的終止蛋白——

tus序列一：terEterDterA序列二：terFterBterC共6個終止位點。6/13/202362每個區域只對一個方向的復制叉起作用Tus蛋白-ter復合物阻止一個方向的復制叉前移(通過抑制DNA解旋酶而發揮終止作用)終止兩個復制叉向前移動，最后在終止區相遇并停止復制，由DNA聚合酶Ⅰ填補空隙，最后由連接酶封口。結果形成兩個DNA雙股螺旋分子。6/13/202364原核細胞DNA的半不連續復制復制過程復制叉的移動方向解旋酶DNA聚合酶III解鏈酶RNA引物引物體DNA聚合酶ISSB3′3′5′前導鏈隨后鏈3′5′復制的起始DNA鏈的合成與延長DNA鏈合成的終止5′RNA引物3′3′DNA連接酶6/13/2023651.6真核生物染色體DNA的復制

真核和原核DNA復制比較α、β、γ、δ、εδ負責核DNA的復制γ負責線粒體DNA的復制較慢較快6/13/202366在真核細胞內有五種DNA聚合酶〔與細菌DNA聚合酶的性質根本相同：底物、模板、引物、方向〕αβγδε定位細胞核細胞核線粒體細胞核細胞核3-5外切--+++酶活性功能引物合成修復作用線粒體DNA的復制核DNA的復制修復作用6/13/202367真核生物中DNA的復制特點1、真核生物染色體有多個復制起點，多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp.3、真核生物DNA復制速度比原核慢。4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核中，起點可以連續發動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。5、真核生物有多種DNA聚合酶。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結構，防止染色體間的末端連接。由端粒酶負責新合成鏈5端RNA引物切除后的填補，以保持端粒的一定長度。6/13/202368真核生物染色體DNA復制過程中組蛋白的裝配核小體的結構〔200bp左右〕在真核生物的復制子上，親代染色體的核小體被逐個翻開，組蛋白以完整的八聚體形式直接轉移到子代DNA的前導鏈上，新合成的組蛋白與后隨鏈組裝成核小體。因此，DNA的復制是半保存的，而組蛋白那么是全保存的。6/13/202369真核生物染色體DNA末端復制的問題真核生物線狀染色體在復制最后，5′末端RNA引物被切除后，無法向原核那樣填補空缺，如果沒有特殊的機制合成末端序列，將造成5′末端序列縮短，染色體就會在細胞傳代中變得越來越短。通過端粒酶催化形成端粒結構來解決原核生物染色體DNA是環狀的，其隨后鏈的5‘最末端岡崎片斷的RNA引物被切除后可借助另半圈DNA連向前延伸來填補，6/13/202370復制叉復制叉終止區端粒結構3535端粒結構端粒酶是含RNA的逆轉錄酶端粒酶與細胞老化有關端粒〔telomeres〕：是真核細胞染色體末端所特有的結構，有許多串〔1000串或更多〕短的重復序列組成，通常3′末端鏈是富含G的短序列。端粒酶:含有RNA和蛋白質〔起DNA聚合酶的作用〕兩種組分，RNA分子約150b，含有與重復端粒結構互補的一個片斷，可作為端粒鏈合成的模板。6/13/2023711.7確保DNA復制忠實性的機制1、采用DNA聚合酶催化聚合反響2、依賴DNA聚合酶核酸外切酶活性3、使用RNA引物4、依賴核苷酸代謝庫調節系統(保證dNTP的正常水平),多種修復系統6/13/2023721.8DNA復制的其它方式大腸桿菌雙鏈環狀DNA的復制〔一個復制起點，雙向復制〕真核細胞線狀染色體DNA的復制方式〔多個復制起點，雙向復制〕單向滾環式復制〔噬菌體X174DNA—單鏈環狀〕3D-環式復制方式〔線粒體雙鏈環狀DNA：兩條鏈的復制起點不同位置，且復制不同步；或同步為2-D環〕切開正鏈，以負鏈為模板開始復制6/13/2023732.1DNA的損傷某些理化因子〔紫外線、電離輻射和化學誘變劑等〕作用于DNA，造成其結構和功能的破壞，從而引起生物突變和致死的效應——DNA的損傷常見的DNA損傷方式——嘧啶二聚體的形成2DNA的損傷與修復6/13/2023741、DNA分子的自發損傷1〕堿基錯配：盡管DNA聚合酶具有校對修復功能仍存在極少量的錯配〔10-10〕2〕自發性化學變化：堿基異構堿基脫氨基脫嘌呤、脫嘧啶堿基修飾鏈斷裂3〕物理因素引發的損傷紫外線電離輻射

DNA鏈斷裂交聯4〕化學因素引發的損傷

烷化劑對DNA的損傷：堿基烷基化、堿基脫落斷鏈、交聯

堿基修飾劑、類似物對DNA的損傷人工促變劑、抗癌藥物亞硝酸鹽、黃曲霉毒素6/13/2023752、DNA損傷的后果1〕DNA分子的改變：點突變、缺失、插入、倒位、易位、鏈斷裂2〕DNA損傷的結果：〔1〕致死性〔2〕喪失某些功能〔3〕改變基因型而不改變表現型〔4〕發生有利于物種生存的結果，生物進化6/13/2023766/13/202377在一定條件下，生物體能使DNA的損傷得到修復:暗修復2.1光裂合酶修復2.2切除修復2.3重組修復2.4誘導修復〔SOS修復〕2.5錯配修復2.2DNA的損傷6/13/202378

光復活：400nm左右的光激活光復活酶，專一分解紫外光照射引起的同一條鏈上TT〔CCCT〕二聚體。〔包括從單細胞生物到鳥類，而高等哺乳動物無〕切除修復：將DNA分子中的受損傷局部切除，以完整的那條鏈為模板再重新合成。特異內切酶、DNA聚合酶、DNA外切酶、DNA連接酶均參與。〔發生在DNA復制前〕重組修復〔發生在復制后〕：復制時，跳過損傷部位，新鏈產生缺口由母鏈彌補，原損傷部位并沒有切除但在后代逐漸稀釋。P318誘導修復：造成DNA損傷或抑制復制的處理均能引起一系列復雜的誘導效應，稱為應急反響〔SOSresponse〕。此過程誘導產生切除修復和重組修復中的關鍵蛋白和酶，同時產生無校對功能的DNA聚合酶。所以會有2種結果：修復或變異〔進化〕。6/13/202379光復合酶特異地和嘧啶二聚體結合2.1DNA紫外線損傷的光裂合酶修復

〔光復活作用—直接修復〕酶被可見光激活解聚二聚體后酶被釋放6/13/202380

2.2切除修復一般DNA的兩條鏈只有一條受損傷，在一系列酶的作用下可將損傷局部切除，根據互補鏈的序列對其進行修復。6/13/2023812.3DNA的重組修復是復制后的修復DNA鏈的損傷并未除去一直只存在母鏈上！！假設干代后相當于被稀釋。胸腺嘧啶二聚體6/13/202382

2.4SOS修復

為DNA的損傷所誘導，而產生缺乏校對功能的DNA聚合酶，它能在DNA損傷部位進行復制而防止了死亡，可是卻帶來了高的突變率〔所以會有2種結果：修復或變異〔進化〕，這屬于傾向過失的修復。6/13/202383

2.5錯配修復

DNA在復制中發生錯配，如果新合成的鏈被校對，基因編碼信息可得到恢復；但如果模板鏈被校對，突變就被固定。

生物體內存在錯配修復系統：能夠識別“新〞“舊〞鏈！(依據甲基化)

6/13/202384

3DNA的突變

概念：DNA分子中的核苷酸序列發生突然而穩定的改變，從而導致DNA的復制以及后來的轉錄和翻譯產物隨之發生變化，表現出異常的遺傳特性，稱為DNA的突變。產生：DNA在復制中可能產生錯配，但自然條件下發生的突變率非常低某些物理化學因素，如紫外線、電離輻射和化學誘變劑〔烷化劑、堿基類似物、嵌入染料〕等6/13/202385自然條件下發生的突變成為自然突變，突變率非常低，能提高突變的物理或化學因子稱為誘變劑。堿基類似物(baseanalog〕：5-溴尿嘧啶堿基修飾劑(basemodifier)：亞硝酸嵌入染料(intercalationdye)：吖啶橙、溴化乙錠紫外線(ultraviolet)和電離輻射(ionizingradiation6/13/202386誘變因素及突變類型6/13/202387堿基對的置換(substitution)轉換：兩種嘌呤或兩種嘧啶之間互換〔常見〕顛換：嘌呤與嘧啶或嘧啶與嘌呤之間互換移碼突變(framesshiftmutation)突變分子改變的類型6/13/202388轉換野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-顛換堿基對的置換(substitution)

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C--T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-點突變〔HNO2、NH2OH、烷化劑等〕插入或缺失1-2個堿基

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T移碼突變(framesshiftmutation)6/13/202389移碼突變由插入或缺失單個或2個堿基而改變整個基因序列、閱讀框架的突變，稱為移碼突變。6/13/202390DNA的合成方式：DNA的復制：以DNA為模板合成DNA。逆轉錄：以RNA為模板合成DNA。修復合成〔DNA聚合酶I、連接酶、修復酶系統等〕6/13/202391第二節RNA的生物合成轉錄〔transcription〕：以DNA的一條鏈為模板在RNA聚合酶催化下，按照堿基配對原那么，合成一條與DNA鏈的一定區段互補的RNA鏈的過程稱為轉錄。6/13/2023921958，Crick，中心法那么轉錄——DNA指導下RNA的合成6/13/202393DNA復制：以DNA為模板合成DNA，遺傳信息自上一代細胞向下一代細胞傳遞轉錄：以DNA為模板合成RNA，遺傳信息自DNA轉錄至RNA分子翻譯：以mRNA為模板合成蛋白質，遺傳信息表達至蛋白質逆轉錄：以RNA為模板合成DNA〔RNA病毒、真核細胞的端粒酶〕RNA復制：以RNA為模板合成RNA〔RNA病毒〕6/13/202394順式作用元件調節轉錄的DNA序列，如啟動子、終止子、增強子反式作用因子可與順式作用元件結合的調節蛋白；如啟動轉錄因子、終止因子RNA聚合酶幾個有關的概念轉錄的主要酶，即依賴DNA的RNA聚合酶加工轉錄產生的RNA的切割、加帽、加尾和化學修飾〔如形成稀有堿基〕DDDP：依賴DNA的DNA聚合酶DDRP：依賴DNA的RNA聚合酶6/13/202395轉錄的不對稱性(asymmetrictranscription)：在RNA的合成中，DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉錄的模板，稱為轉錄的不對稱性。反義鏈〔無意義鏈，負鏈〕：在RNA的轉錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈〔編碼鏈，正鏈〕在RNA的轉錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。6/13/202396轉錄產物：mRNA、rRNA、tRNA、各種小RNA基因表達的產物:RNA和蛋白質轉錄起始于DNA模板的一個特定位點，并在另一位點終止，此轉錄區域稱為一個轉錄單位。一個轉錄單位可以是一個基因〔真核〕——單順反子mRNA，也可以是多個基因〔原核〕——多順反子mRNA。6/13/2023971.1E.coliRNA聚合酶：大腸桿菌的RNA聚合酶只有一種,全酶由5種亞基α2ββ’σ組成，另有兩個Zn2+σ因子與其它局部的結合不是十分緊密，它易與α2ββ’別離，沒有σ、亞基的酶稱為核心酶——只催化鏈的延長，對起始無作用。五種亞基的功能分別為：α亞基：與啟動子結合功能。β亞基：含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。亞基：在全酶中存在，功能不清楚。β’亞基：與DNA模板結合功能。σ亞基：識別起始位點。

6/13/202398E.coli

RNA聚合酶的特點：反響底物：NTP(ATP/GTP/UTP/CTP)，DNA為模板、Mg2+促進聚合反響。RNA聚合酶不需要引物，合成方向53。6/13/2023991.2

E.coliRNA的轉錄過程：

起始位點的識別

轉錄起始鏈的延伸轉錄終止6/13/2023100起始位點的識別RNA的合成不需要引物。體外實驗證明，不含σ亞基的核心酶會隨機地在一個基因的兩條鏈上啟動，當有σ亞基時就會選擇正確的起點。σ亞基起著識別DNA分子上的起始信號〔啟動子——指RNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列〕的作用。啟動子的結構至少由三局部組成：-35序列提供了RNA聚合酶全酶識別的信號；-10序列是酶的緊密結合位點〔富含AT堿基，利于雙鏈翻開〕；第三局部是RNA合成的起始點。AACTGTATATTATTGACATATAAT+1轉錄起始點5’3’3’5’35序列

Sextama框10序列Pribnow框6/13/2023101轉錄起始RNA聚合酶全酶掃描解鏈區，找到起始點，然后結合第一個核苷三磷酸。參加的第一個核苷三磷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。完成最初的幾個〔2-9〕核苷酸連接后，σ亞基就會被釋放脫離核心酶。所形成的啟動子、全酶和RNA鏈復合物稱為三元起始復合物。因子僅與起始有關，RNA的合成一旦開始，便被釋放E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈6/13/2023102RNA鏈的延伸DNA分子和酶分子發生構象的變化，核心酶與DNA結合比較松弛，可沿DNA模板移動，并按模板順序選擇下一個核苷酸，將核苷三磷酸加到生長的RNA鏈的3’-OH端，催化形成磷酸二酯鍵。轉錄延伸方向從53轉錄泡RNA聚合酶DNA模板RNA

6/13/2023103RNA聚合酶催化的反響ACGACGUU模板DNA5′3′5′3′新合成RNA6/13/20231041.2.4轉錄終止〔終止子和終止因子〕在DNA分子上〔基因末端〕提供轉錄停止信號的DNA序列稱為終止子〔terminators),它能使RNA聚合酶停止合成RNA并釋放出RNA。〔RNA聚合酶只能感受已經轉錄的信號序列〕終止因子，協助RNA聚合酶識別終止信號的輔助因子〔蛋白質〕。終止因子ρ因子能與RNA聚合酶結合但不是酶的組分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移動，于是轉錄終止，并釋放出已轉錄完成的RNA鏈。大腸桿菌有兩類終止子：〔1〕不依賴于ρ因子的終止子〔強〕〔2〕依賴ρ因子的終止子〔弱終止子〕6/13/2023105不依賴于ρ因子的終止子有2個特征〔強終止子〕①在DNA中，在轉錄單位的終點之前都有一個回文結構，其轉錄本形成發卡結構，且柄部富含GC堿基對。②終點前大約有6個連續的A，它轉錄成U。模板鏈5335富含AT區CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTGGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAA回文結構富含GC區轉錄方向6/13/2023106寡聚U序列可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。依賴ρ的終止子，必需在ρ因子存在時，才發生終止作用。終止點前無寡聚U序列，回文對稱區不富含GC。6/13/2023107有些終止子的作用可被特異的因子所阻止，使酶得以越過終止子繼續轉錄，稱為通讀〔readthrough〕能夠引起抗終止作用的蛋白質稱為抗終止因子〔antiterminationfactors〕因子是一個堿性的蛋白,三個二聚體組成.與合成的RNA結合,移動到終止信號,再與RNA聚合酶結合,使之離開摸板.6/13/2023108RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區到達基因終點延長階段53RNA啟動子〔promoter)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開轉錄泡6/13/2023109根本原那么與原核相似，但真核基因的轉錄更復雜，RNA聚合酶不相同啟動子有三類，分別由RNA聚合酶I、II、III進行轉錄。真核生物的啟動子由轉錄因子，而不是RNA聚合酶識別〔沒有對應的因子〕轉錄因子：RNA聚合酶在進行轉錄時，常需要一些輔助因子〔蛋白質〕參與作用，此類蛋白質統稱為轉錄因子。多種轉錄因子和RNA聚合酶在起點形成前起始復合物，起始轉錄。1.3真核生物的轉錄6/13/2023110產物α-鵝膏蕈堿對酶的作用酶類分布反應條件ⅡIⅢ核仁核質核質rRNAmRNAtRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制低離子強度,要求Mg2+或Mn2+高離子強度高Mn2+濃度分子量都在50萬左右

真核生物RNA聚合酶6/13/20231111.4RNA生物合成的抑制劑1.4.1嘌呤和嘧啶類似物：人工合成的堿基類似物能夠抑制和干擾核酸的合成。如NH2SHSH作為代謝拮抗物抑制合成酶類或直接摻到核酸分子中，形成異常RNA或DNA。NH2NH2OHNFNH2SH6/13/2023112DNA模板功能的抑制物：可以與DNA模板結合，抑制其復制和轉錄〔1〕烷化劑：使DNA發生烷基化，發生在G-N7，A-N1、N3N7；C-N1。易引起嘌呤的水解，在DNA上留下空隙干擾復制或轉錄；或引起堿基錯配。〔2〕放線菌素：放線菌素D與DNA形成非共價的復合物，抑制其模板功能〔低濃度抑制轉錄，較高濃度抑制復制〕。具有類似作用的還有色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素。〔3〕嵌入染料：可插入雙鏈DNA分子相鄰的堿基對之間，一般具有芳香族發色團。吖啶類染料；溴化乙錠〔EB〕。EB是一種高靈敏的熒光試劑，常用來檢測DNA和RNA。與DNA結合后抑制其復制和轉錄。6/13/2023113嘌呤和嘧啶類似物：可通過抑制核苷酸的合成，抑制RNA生物合成。還能摻入核酸分子中去，形成異常DNA、RNA，影響核酸功能。人工合成的主要有：6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、8-氮鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶堿基類似物進入體內后需轉變成相應的核苷酸，才表現出抑制作用。烷化劑：氮芥〔二〔氯乙基〕胺的衍生物〕、磺酸酯、氮丙啶、乙撐亞胺類。它們帶有活性烷基，使DNA烷基化。烷化位點：鳥嘌呤N7，腺嘌呤N1、N3、N7，胞嘧啶N1烷基化后，堿基易被水解下來，留下的空隙可干擾DNA復制或引起錯誤堿基摻入。帶有雙功能基團的烷化劑，可同時與DNA兩條鏈結合，使雙鏈DNA交聯，從而失去模板功能。放線菌素D：有抗菌和抗癌作用。它可與DNA形成非共價復合物，使其多肽局部在DNA的“淺溝〞上如同阻遏蛋白一樣，抑制DNA的轉錄。6/13/2023114此類機理的放線菌素還有色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素。嵌入染料：扁平芳香族染料，可插入雙鏈DNA相鄰堿基對之間，使DNA在復制時缺失或增添一個核苷酸，從而導致移碼突變，并能抑制RNA鏈的起始及質粒的復制。溴化乙錠、吖啶類染料〔原黃素、吖啶黃、吖啶橙等〕。RNA聚合酶的抑制物〔1〕利福霉素包括其衍生物利福平，特異地抑制細菌RNA聚合酶的活性。強烈抑制革蘭氏陽性菌和結核桿菌，它主要抑制RNA合成的起始。〔2〕

利鏈菌素與細菌RNA聚合酶β亞基結合，抑制轉錄過程中鏈的延長。〔3〕

α-鵝膏蕈堿主要抑制真核RNA聚合酶Ⅱ和Ⅲ，對細菌的RNA聚合酶作用極小。6/13/20231151.4.3RNA聚合酶抑制物〔1〕利福霉素：抑制細菌RNA聚合酶活性。利福平可以高效抑制結核桿菌，殺死麻瘋桿菌，在體外有抗病毒作用。〔2〕利鏈霉素：與細菌RNA聚合酶亞基結合，抑制轉錄過程中RNA鏈的延長反響。〔3〕-鵝膏蕈堿：抑制真核生物RNA聚合酶活性。6/13/20231162RNA的轉錄后加工(post-transcriptionalprocessing)在細胞內，由RNA聚合酶合成的原初轉錄物〔primarytranscript〕往往需要一系列的變化，包括鏈的裂解、5和3末端的切除和特殊結構的形成、核苷的修飾、以及拼接和編輯等過程，才轉變為成熟的RNA分子。此過程總稱為RNA的成熟或稱為RNA的轉錄后加工。6/13/20231172.1mRNA前體的加工〔真核〕：原核生物的mRNA轉錄后一般不需要加工，轉錄的同時即進行翻譯〔半壽期短〕。亦有少數多順反子的mRNA需要核酸酶切成小單位，然后再翻譯。真核生物mRNA〔半壽期較長〕原初轉錄物很大，在加工過程中形成許多分子大小不等的中間物，它們被稱為核內不均一RNA〔heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)，其中大約25%需要進一步進行加工修飾轉化為mRNA。加工包括：〔1〕3’端添加polyA“尾巴〞；〔2〕5’端連接“帽子〞結構〔m7G5ppp5NmpNp-〕；〔3〕hnRNA被剪接，把內含子〔DNA上非編碼序列〕轉錄序列剪掉，把外顯子〔DNA上的編碼序列〕轉錄序列拼接上(真核生物一般為不連續基因)。〔4〕分子內部的核苷酸甲基化修飾。6/13/20231186/13/20231192.2tRNA前體的加工：原核與真核生物的tRNA轉錄后都需要加工。包括：〔1〕由核酸內切酶切除前體上3和5端上多余的核苷酸；〔2〕由核酸外切酶逐個在3切去附加序列，進行修剪。〔3〕3端添加CCAOH序列，由核苷酰轉移酶催化。〔接受活化AA〕〔4〕核苷的一些特定的堿基和戊糖進行修飾。

6/13/20231206/13/2023121原核與真核生物的rRNA轉錄后也都需要進行加工。原核：剛轉錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上進行甲基化〔核糖2-羥基〕修飾，后逐步裂解〔核酸酶的切割〕。真核：45S〔哺乳動物〕、38S〔果蠅〕、37S〔酵母〕P16P23P516S23S5S〔一般不含甲基化〕28S18S5.8S2.3rRNA前體的加工：45S或38S37S26S17S5.8S真核rRNA的甲基化程度比原核高〔核糖2-羥基〕rRNA原初轉錄物30S研究四膜蟲rRNA前體的拼接時發現ribozyme6/13/20231226/13/20231231.模板：DNA2.原料：核苷酸3.合成方向：5′→3′4.酶：依賴DNA的RNA聚合酶5.堿基互補配對規律6.產物：多聚核苷酸鏈相同點：2.4轉錄和復制的區別6/13/2023124不同點：復制轉錄模板兩股鏈均作為模板模板鏈作為模板原料dNTPNTP聚合酶DNA聚合酶RNA聚合酶產物子代DNA雙鏈mRNA;tRNA;rRNA配對A-T；G-CA-U；T-A;G-C引物RNA引物不需要引物方式(特點)半保存復制不對稱轉錄6/13/2023125兩個階段〔1〕其單鏈RNA可充當mRNA，利用寄主中的核糖體合成外殼蛋白和復制酶的β亞基。〔2〕復制酶的β亞基可與來自寄主細胞的亞基αδ自動裝配成RNA復制酶，可進行RNA的復制，以分子中單鏈RNA為模板〔正鏈〕，復制出一條新的RNA鏈〔負鏈〕，再復制出正鏈，與外殼蛋白組裝成新的噬菌體顆粒。

3RNA的復制〔噬菌體Qβ和灰質炎病毒〕某些RNA病毒可以以自身RNA為模板進行復制。5RNA-533RNA+釋放釋放353355RNA+RNA+RNA-RNA-及

RNA+的合成方向均為5‘3’不同的RNA病毒復制方式不同P333。6/13/2023126病毒RNA復制的主要方式單鏈〔+〕RNA病毒的復制方式〔噬菌體Qβ和灰質炎病毒〕(只含病毒正鏈RNA)

單鏈〔-〕RNA病毒的復制方式〔狂犬病毒〕(病毒負鏈RNA+復制酶)；雙鏈RNA病毒的復制方式〔呼腸狐病毒〕(雙鏈RNA+復制酶)；致癌RNA病毒6/13/2023127不同RNA病毒合成mRNA的途徑可以分4類逆轉錄病毒噬菌體Qβ狂犬病毒〔帶有復制酶〕呼腸孤病毒〔帶有復制酶〕逆轉錄酶6/13/20231281、正鏈RNA病毒〔mRNA〕：噬菌體Qβ、灰質炎病毒等。進入寄主細胞后，利用寄主的翻譯系統，首先合成復制酶及有關的蛋白質，然后進行病毒RNA的復制，最后由病毒RNA〔+〕和蛋白質裝配成病毒顆粒。

2、負鏈RNA病毒〔帶有復制酶〕：狂犬病毒等此類病毒帶有復制酶，侵入后，復制酶首先合成出正鏈RNA〔mRNA〕，再以正鏈RNA為模板，合成