實驗二培養基配制相關器皿的包扎及消毒滅菌第一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六實驗內容一

培養基及無菌水的制備第二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六一、培養基的相關知識介紹1、培養基的定義和組成培養基：指由人工配制的、適合微生物生長繁殖或產生代謝產物用的混合營養基質（反映出培養基的2個作用？）。包括六大營養要素：碳源、氮源、無機鹽、生長因子、能源、水。第三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六2、培養基制備原則和方法四個原則：目的明確；營養協調；物理化學條件適宜；經濟節約。C/N：指在微生物培養基中所含的碳源中碳原子摩爾數與氮源中的氮原子摩爾數之比。四種方法：生態模擬；參閱文獻；精心設計；試驗比較。第四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六3、物理化學條件適宜的說明pH值：滲透壓和水活度（aw）：

在同溫同壓下，某溶液的蒸氣壓（P）與純水蒸氣壓（P0）之比。氧化還原電位：

針對厭氧菌分離特別需要注意（不常加入半胱氨酸、巰基乙醇酸鈉等？）。第五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六4、培養基的分類⑴按成分分——對成分種類、量是否清楚

天然培養基合成培養基（組合培養基）半合成培養基（也稱半組合培養基）⑵按物理狀態分

固體培養基（凝固劑的使用；固體基質的使用）半固體培養基（凝固劑使用量較低）液體培養基（工業生產中的重要性）脫水培養基（也稱預制干燥培養基）第六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六（3）按培養基對微生物的功能分基礎培養基：含有一般微生物生長繁殖需要的基本營養物質。選擇性培養基：根據某種微生物的特殊營養要求或其對某化學、物理因素的抗性而設計的培養基，具有使混合菌樣中的劣勢菌變成優勢菌的功能，廣泛用于菌種篩選等領域。“投其所好、取其所抗”。——高通量篩選的建立。鑒別性培養基：在培養基中加入有能與目的菌的無色代產物發生顯色反應的指示劑，從而達到只須用肉眼辨別顏色就能方便地從近似菌落中找出目的菌菌落的培養基。——直觀、專一性（伊紅美蘭培養基，EMB）第七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六大腸桿菌在EMB培養基上的形態第八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六二、培養基的配方一個實驗班共配置3種固體培養基：牛肉膏蛋白胨培養基高氏1號培養基馬丁氏培養基按照老師的劃分進行，每個實驗小組都要準備，幾個實驗小組配1種培養基，供全班使用。第九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六1、牛肉膏蛋白胨培養基

——500ml/組

（分離、培養細菌用）牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000ml瓊脂15～20gpH7.4～7.6第十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六

可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31.0gK2HPO4·3H2O

0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g

瓊脂15～25g

水1000mlpH7.4～7.6

臨用時無菌操作在500ml培養基中加入3%的K2Cr2O7溶液0.7ml。2、高氏1號培養基——500ml/組

（分離、培養放線菌用）第十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六KH2PO41gMgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g瓊脂20g水1000mlpH自然配好后在此培養基中，按1000ml加入1%孟加拉紅水溶液3.3ml。臨用時以無菌操作在100ml培養基中加入1%的鏈霉素0.3ml，使其終濃度為30ug/ml。3、馬丁氏培養基——500ml/組

（分離、培養真菌用）第十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六三、培養基配制的步驟1、計算按照配方要求（一般為1000ml的量）和實際配制培養基的量，計算出不同組分需要的量。第十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六2、稱量、溶解按培養基配方在三角瓶中先加水（如無加入后大幅度改變原體積的物質，可以把水加足），然后依次準確稱取各藥品并分別逐一溶解于其中（瓊脂需加熱溶解），最后補充水到所需體積。（注意：各成分之間發生化學反應產生不溶的沉淀；培養基成分中有影響pH試紙的顯色的物質，調pH值后再加入）第十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六3、調pH

用5~10%NaOH、1~5%HCl溶液將培養基的pH調到所需范圍，根據需要用精密pH試紙或pH計來確定。

4、包扎（有一定規范要求）

5、滅菌（高壓蒸汽滅菌：121.3℃,15～30min）第十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六四、培養基配制過程中需注

意的事項先加水——易產生沉淀逐一溶解——易產生沉淀調節pH——容易忘記加塞滅菌（或過濾除菌）——及時滅菌煮過或加熱過的培養基，注意水的蒸發損失——容量補足第十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六五、培養基配制中的2點說明1、量微的藥品（學生實驗使用的天平精準度低，無法稱量準確），可以溶液的形式加入（先配制成一定濃度的溶液）；2、粘稠的藥品和物品，稱好后與稱量紙一起放入溶液中，待藥品溶解后取出稱量紙；或利用減稱量法完成（從總藥品量中以減量稱出所需要的量）。第十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六六、無菌水的準備經滅菌處理后的蒸餾水或自來水。1、量取90mL蒸餾水在250mL三角瓶，內加玻珠（10粒左右）1瓶2、吸取9mL蒸餾水在18*180試管中

6～7支包扎后滅菌。第十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六注意！！1、標記（記號筆）寫在器皿壁或外包裝紙上（如還需要高壓蒸汽滅菌，只能寫在外包裝紙上）；2、不要直接寫在瓶（管）塞或包裝棉布上。第十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六實驗內容二

消毒與滅菌第二十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六一、消毒、滅菌的定義和常見方法1、消毒：指消滅病原菌和有害微生物的營養體。2、滅菌：指殺滅一切微生物的營養體、芽孢和孢子。常見的滅菌方法：

加熱法：包括干熱滅菌和濕熱滅菌過濾除菌輻射滅菌化學藥品滅菌第二十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六高溫滅菌或消毒的方法第二十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六過濾除菌技術（正壓和負壓之分）濾膜過濾器——微孔濾膜（醋酸纖維、硝酸纖維、火棉膠、有機大分子物質），孔徑0.22和0.45um。玻璃濾器——玻璃粉燒結板（G1~G6）蔡氏（Seitz）濾器——多層石棉纖維板（整體為金屬制成）其它（不常見）——陶瓷、硅藻土制濾燭形：

——張伯倫（Chamberland）濾器

——伯克菲爾德（Berkefeld）濾器

——曼德勒爾（Mandler）濾器第二十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六膜過濾裝置第二十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六不耐熱的液體培養基的除（滅）菌第二十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六膜過濾裝置第二十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六細菌截留于膜過濾器濾膜表面第二十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六二、加熱滅菌的方法1、干熱滅菌法：火焰灼燒法烘箱內熱空氣滅菌法2、濕熱滅菌（消毒）法：常壓下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；間歇滅菌法。加壓下：常規加壓滅菌法；連續加壓滅菌法。第二十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六三、干熱滅菌火焰灼燒滅菌和熱空氣滅菌兩種方法。通常所說的干熱滅菌是在電熱干燥箱內利用高溫干燥空氣（160~180℃）進行滅菌，此法適用于玻璃器皿（吸管、培養皿等）的滅菌。第二十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六干熱滅菌需要注意的事項1、不能對塑料器皿和培養基滅菌；2、控制好溫度和時間（160~180℃，2小時），防止包扎的報紙焦糊；3、滅菌過程（未完全冷下來，60℃以下）不要打開烘箱門，防止報紙著火或玻璃器皿遇冷爆裂。第三十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六四、高壓蒸汽滅菌鍋的

結構及使用第三十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六高壓蒸汽滅菌的原理高壓蒸汽滅菌器是利用加壓的飽和蒸汽（潛熱）對物品、器械、藥液等滅菌的設備，適用于科學研究、醫療衛生、食品等實驗室或工廠使用——造成蛋白質等變性失活。潛熱是指當1g100℃的水蒸汽變成1g100℃水時，釋放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的熱量。各種高壓蒸汽滅菌器之間的區別只在于自動化程度的高低（水位控制、溫度恒定控制、時間控制、自動排放冷空氣、程序化顯示）飽和蒸汽壓壓力指示溫度直接利用溫度探測器指示溫度第三十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六典型的高壓蒸汽滅菌鍋縱剖面結構壓力調節器安全閥排氣口控制柄記錄儀門墊圈放電器蒸汽閥蒸汽夾層阻板蒸汽供給蒸汽供應閥溫度感應器蒸汽凝汽瓣廢汽冷凝器蒸汽通入夾層蒸汽由夾層到滅菌室夾層冷凝水收集口蒸汽由夾層進入滅菌室和蒸汽排出口第三十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六臥式滅菌鍋示意圖（簡圖）蒸汽進口滅菌過程出氣口（冷空氣和蒸汽）滅菌時間到排汽口壓力表蒸汽排氣閥溫度計閥蒸汽供應閥門消毒室夾套（層）第三十四頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六

立式壓力滅菌器第三十五頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六手提式滅菌鍋第三十六頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六臥式矩型和圓型壓力蒸汽消毒器第三十七頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六第三十八頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六高壓蒸汽滅菌過程：

1、取出內筒，檢查水位；2、加水至淹過電發熱管和內筒支架；3、放入內筒，并在其中放入需滅菌物品（要求松散）；4、加蓋（對稱旋緊），打開放汽閥；5、加熱（有內外兩種），升溫；6、排除冷空氣——由放汽閥冒汽3~5分鐘；7、關閉放汽閥（有些滅菌鍋滅菌過程中一直保持較小排氣或到一定溫度自動關閉），加壓升溫至所需溫度或壓力；8、保溫定時至所需時間；9、不再加熱，降溫至壓力表為“0”，打開放汽閥；10、開蓋取物（注意蒸汽燙傷）。第三十九頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六空氣排除度對滅菌溫度的影響壓力表讀數鍋內溫度（℃）kg/cm2磅/吋2MPa飽和蒸汽排除1/2空氣不排除空氣0.3550.031108.894720.70110.076115.6110901.05150.108121.31121001.40200.142126.21181091.75250.172130.01241152.10300.213134.6128121第四十頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六一些細菌芽孢濕熱滅菌所需時間第四十一頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六消毒、滅菌的生物指示菌嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillusstearothermophilus）結核分枝桿菌——致病菌指示菌（Mycobacteriumtuberculosis沙門氏菌——致病菌指示菌（通用檢測）（Salmonellaspp）第四十二頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六高壓蒸汽滅菌效果的監測方法

（3種）1、工藝（程序）監測——壓力表、溫度計等，最常見，每次都使用；2、化學指示監測——特定化合物熔點（熔化前后晶體形態不同，硫磺熔點115℃、乙酰替苯胺116℃、脫水琥珀酸120℃、苯甲酸122.4℃等結晶）、滅菌指示膠帶（變色反應）；3、生物指示劑監測——特定微生物（需經培養）。第四十三頁，共五十頁，編輯于2023年，星期六五、實驗室常用滅菌方法1、高壓蒸汽滅菌——常用121.3℃，20min和115℃，10min兩種條件進行；適用于耐熱性溶液、培養基、水和高糖、高蛋白質培養基的滅菌；2、熱空氣干熱滅菌——160~180℃，2hr；適用于玻璃器皿和金屬工具的滅菌；3、灼燒滅菌——酒精