藥物靶標發現與篩選詳解演示文稿目前一頁\總數一百零六頁\編于十九點（優選）藥物靶標發現與篩選目前二頁\總數一百零六頁\編于十九點EST是從一個隨機選擇的cDNA克隆進行5’端和3’端單一次測序獲得的短的cDNA部分序列,代表一個完整基因的一小部分,在數據庫中其長度一般從20到7000bp不等,平均長度為360±120bp。EST來源于一定環境下一個組織總mRNA所構建的cDNA文庫,因此EST也能說明該組織中各基因的表達水平。首先從樣品組織中提取mRNA,在逆轉錄酶的作用下用oligo(dT)作為引物進行RT-PCR合成cDNA,再選擇合適的載體構建cDNA文庫,對各菌株加以整理,將每一個菌株的插入片段根據載體多克隆位點設計引物進行兩端一次性自動化測序,這就是EST序列的產生過程。目前三頁\總數一百零六頁\編于十九點IdentificationofPD-relatedgenes目前四頁\總數一百零六頁\編于十九點Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286Quantitativereal-timeRT-PCRofupregulatedordownregulatedgenesrandomlyselectedfromthelibrariesofhumannormalSN(黑質)andPD'sSN目前五頁\總數一百零六頁\編于十九點Copyrightrestrictionsmayapply.Kim,J.-M.etal.DNARes200613:275-286;doi:10.1093/dnares/dsl016ImmunohistochemicalstainingforTHandalpha-tubulinintheSNofanMPTPmicemodelTHalpha-tubulin目前六頁\總數一百零六頁\編于十九點Copyrightrestrictionsmayapply.CelldeathactivityofdifferentiallyexpressedgenesinPDUpregulatedgenesDownregulatedgenes目前七頁\總數一百零六頁\編于十九點一、基因靶標2、基因芯片技術（1）普通基因芯片（2）ChIP-DSL（couplingChIPwithaDNAselectionandligationstrategy），染色質免疫沉淀/DNA選擇連接技術目前八頁\總數一百零六頁\編于十九點基因芯片（GeneChip）通常指DNA芯片，其基本原理是將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量?；蛐酒母拍瞵F已泛化到生物芯片（biochip）、微陣列（Microarray）、DNA芯片（DNAchip），甚至蛋白芯片。目前九頁\總數一百零六頁\編于十九點INH(異煙阱)-inducedmRNAexpressionprofilesmonitoredbymicroarrayhybridizationanalysis.用INH處理INH敏感的結核菌株(紅:INH處理的;綠:INH未處理的)PNAS1999;96(22):12833-12838.

用INH處理INH耐藥的結核菌株用乙硫異煙胺處理INH耐藥的結核菌株目前十頁\總數一百零六頁\編于十九點TemporalprofileofINH-inducedexpressionofselectedgenes.PNAS1999;96(22):12833-12838.目前十一頁\總數一百零六頁\編于十九點RolesofINH-inducedgenesinthecontextofaproposedpathwayformycolicacid(結核環脂酸)biosynthesis.PNAS1999;96(22):12833-12838.

目前十二頁\總數一百零六頁\編于十九點TheChIP-DSLschemePNAS2007;104（2):4852-4857

目前十三頁\總數一百零六頁\編于十九點E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

目前十四頁\總數一百零六頁\編于十九點E2-inducedgeneexpressionandthebiologicalrelevanceofdirectERtargetgenesPNAS2007;104（2):4852-4857

目前十五頁\總數一百零六頁\編于十九點一、基因靶標3、基因敲除（knock-out)技術目前十六頁\總數一百零六頁\編于十九點Luoetal.,StemCells2010目前十七頁\總數一百零六頁\編于十九點Zhangetal.,JNeurosci2010目前十八頁\總數一百零六頁\編于十九點一、基因靶標4、檢測報告基因把靶基因表達的調控序列與編碼某種酶活性的基因相連轉導入細胞內,通過簡單地檢測酶活性的變化,就可以反映化合物對轉錄因子和基因表達的作用性質和程度。這種能間接反映基因轉錄水平的編碼某種酶活性的基因稱為報告基因。目前十九頁\總數一百零六頁\編于十九點StructureofSB247464Science.1998;281(5374):257-259

目前二十頁\總數一百零六頁\編于十九點ActivityofG-CSF(粒細胞集落刺激因子)andSB247464

inNFS60cellluciferaseassaysScience.1998;281(5374):257-259

目前二十一頁\總數一百零六頁\編于十九點PhosphorylationofsignalingproteinsincellstreatedwithSB247464

orG-CSF.Science.1998;281(5374):257-259

目前二十二頁\總數一百零六頁\編于十九點ThemurineG-CSFreceptorconfersresponsivenesstoSB247464.Science.1998;281(5374):257-259未轉染受體轉染CSF受體目前二十三頁\總數一百零六頁\編于十九點GranulocyticcolonyformationinresponsetoSB247464

invitro.GranulopoieticactivityofSB247464

invivo.Science.1998;281(5374):257-259目前二十四頁\總數一百零六頁\編于十九點一、基因靶標5、低等生物功能基因組篩選目前二十五頁\總數一百零六頁\編于十九點

DrugentryrouteintoC.elegans(秀麗隱桿線蟲)NatRevDrugDiscov2006;5:387-398目前二十六頁\總數一百零六頁\編于十九點TheserotonergicsynapseofC.elegans.NatRevDrugDiscov2006;5:387-398目前二十七頁\總數一百零六頁\編于十九點OverviewoftheRNAinterferencesupportedtargetidentificationprocessNatRevDrugDiscov2006;5:387-398目前二十八頁\總數一百零六頁\編于十九點

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398目前二十九頁\總數一百零六頁\編于十九點

ChemicalgeneticsasatoolfortargetsiteidentificationNatRevDrugDiscov2006;5:387-398目前三十頁\總數一百零六頁\編于十九點二、核糖核酸靶標1、核酶技術

目前三十一頁\總數一百零六頁\編于十九點

核酶(ribozyme)

核酶:用于描述具有催化活性的RNA,即化學本質是核糖核酸(RNA)，卻具有酶的催化功能。

目前三十二頁\總數一百零六頁\編于十九點

核酶的發現:1981年，ThomasCech和他的同事在研究四膜蟲的26SrRNA前體加工去除基因內含子時獲得一個驚奇的發現∶內含子的切除反應發生在僅含有核苷酸和純化的26SrRNA前體而不含有任何蛋白質催化劑的溶液中，可能的解釋只能是:內含子切除是由26SrRNA前體自身催化的，而不是蛋白質。目前三十三頁\總數一百零六頁\編于十九點

核酶的證實為了證明這一發現，他們將編碼26SrRNA前體DNA克隆到細菌中并在無細胞系統中轉錄成26SrRNA前體分子。結果發現這種人工制備的26SrRNA前體分子在沒有任何蛋白質催化劑存在的情況下，切除了前體分子中的內含子。這種現象稱為自我剪接(self-splicing)，這是人類第一次發現RNA具有催化化學反應的活性，具有這種催化活性的RNA稱為核酶。ThomasCech因發現了核酶而獲得1989年諾貝爾化學獎。目前三十四頁\總數一百零六頁\編于十九點雞的卵清蛋白基因初始RNA轉錄物的剪接

目前三十五頁\總數一百零六頁\編于十九點核酶種類:發卡狀核酶錘頭狀核酶I型內含子核酶RnaseP核酶丁型肝炎病毒核酶目前三十六頁\總數一百零六頁\編于十九點RelativegrowthrateofstrainsexpressingribozymeswithDTAsequencesasthe3′exonNucleicAcidsRes.2002;30(24):e141目前三十七頁\總數一百零六頁\編于十九點二、核糖核酸靶標2、反義寡核苷酸

目前三十八頁\總數一百零六頁\編于十九點

反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,asON)人工合成的，與靶基因或mRNA某一區段互補的核酸片斷，可以通過堿基互補原則結合于靶基因/mRNA上,從而封閉基因的表達。包括：反義DNA，反義RNA，其來源可有人工合成和體內表達兩類。

目前三十九頁\總數一百零六頁\編于十九點

反義寡核苷酸可用于基因沉默，所以是一種研究基因功能的重要工具。大多數藥物屬于靶標基因（或疾病基因）的抑制劑，因此反義寡核苷酸模擬了藥物的作用，這功能丟失（LOF)的研究方法比傳統的功能獲得（GOF)方法更具優勢。同時，那些在靶標實驗中證明有效的反義寡核苷酸本身還可以被進一步開發成為反義寡核苷酸藥物。目前四十頁\總數一百零六頁\編于十九點

Table1.

PS-ODNstargetingtheM.tuberculosis30,32A,and32Bprotein(分枝?；D移酶)genetranscripts

mRNAtarget5'

3'PS-ODN5'

3'30-kDaprotein

30:1–24AATCTTTCGGCTCACGTCTGTCAT

30:HP2/HP1GCGCATATGCGCAATCTTTCGGCTCACGTCTGTCATGCGCGCGC

30:1–24-MMAtTCaTTtGGtTCtCGaCTcTCtT

30:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtTCaTTtGGtTCcCGaCTcTCtTGCGCGCGC32A-kDaprotein

32A:1–24ACGAACCCTGTCAACAAGCTGCAT

32A:HP2/HP1GCGCATATGCGCACGAACCCTGTCAACAAGCTGCATGCGCGCGC

32A:1–24-MMAgGAtCCtTGaCAtCAtGCaGCtT

32A:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCAtGAtCCaTGcCAgCAtGCaGCtTGCGCGCGC32B-kDaprotein

32B:1–24TCGCACCTGTTCGAAGAACGTCAT

32B:HP2/HP1GCGCATATGCGCTCGCACCTGTTCGAAGAACGTCATGCGCGCGC

32B:1–24-MMTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtT

32B:HP2/HP1-MMGCGCATATGCGCTgGCtCCaGTaCGtAGtACcTCtTGCGCGCGCPS-ODNs:antisensephosphorothioateoligodeoxyribonucleotides;MM:錯配的核苷酸HPS-ODNs:5`-,3`-hairpin-modifiedPS-ODNs發夾修飾的反義寡核苷酸目前四十一頁\總數一百零六頁\編于十九點InhibitionofM.tuberculosisgrowthbyantisenseHPS-ODNsspecificforthe30/32-kDaproteingenecomplex.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204目前四十二頁\總數一百零六頁\編于十九點SpecificinhibitionofproteinsynthesisbyantisenseHPS-ODNs.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204目前四十三頁\總數一百零六頁\編于十九點Inhibitionof30,32A,and32BproteingenetranscriptsynthesisProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204目前四十四頁\總數一百零六頁\編于十九點HPS-ODNinhibitionofM.tuberculosismultiplicationinhumanmacrophagesProcNatlAcadSciUSA.2007;104(17):7199-7204目前四十五頁\總數一百零六頁\編于十九點二、核糖核酸靶標3、RNA干擾技術

目前四十六頁\總數一百零六頁\編于十九點轉錄后基因表達抑制現象的發現＋CHSGene矮牽?；?Jorgensen,R,1990)CHS:與色素合成相關的酶,以加深花的顏色目前四十七頁\總數一百零六頁\編于十九點RNAi現象的發現線蟲（C.elegans)(AndrewFire,1998)+Par-1GeneDisruptionExpressionDownDoubleStrandRNA線蟲，果蠅微生物，植物

失敗的原因:在合成反義RNA時存在技術問題,用于注射的正義和反義RNA中都混有少量雙鏈RNA目前四十八頁\總數一百零六頁\編于十九點dsRNADicercleavageofdsRNAsiRNARNAi抑制基因表達的機理siRNAassociatedWithRISCcomplexCellMembrane5’POH3’TargetmRNADicer:是一種核酸酶,將雙鏈RNA降解成21-23bp的小干擾RNARISC:RNA誘導的沉默小體,他是由單鏈siRNA與一些蛋白形成的復合體目前四十九頁\總數一百零六頁\編于十九點RNA干擾(RNAinterference,RNAi)RNAi是將一段雙鏈的RNA序列導入機體或細胞中,機體或細胞中與之有同源序列的基因的表達將會受到抑制,甚至表達受到完全抑制目前五十頁\總數一百零六頁\編于十九點Luoetal.,StemCells2010目前五十一頁\總數一百零六頁\編于十九點DecreasedhumanMKexpressioninPC-3cellstransfectedwithvarioussiRNAsCancer.2006;107(4):864-873

MK:肝素結合細胞因子目前五十二頁\總數一百零六頁\編于十九點EffectoftreatmentwithMKsiRNAcombinedwithPTX(紫杉醇)onPC-3cellviabilityandanchorage-independentgrowthCancer.2006;107(4):864-873

PTX:siRNA-SCR:亂序siRNS目前五十三頁\總數一百零六頁\編于十九點DeterminationofasuitabledoseandthedurationofthesiRNAtodownregulateMKinPC-3xenograftsCancer.2006;107(4):864-873

目前五十四頁\總數一百零六頁\編于十九點AntitumoreffectofMKsiRNAinPC-3xenografts.Cancer.2006;107(4):864-873

目前五十五頁\總數一百零六頁\編于十九點三、蛋白質靶標1、抗體和胞內抗體

目前五十六頁\總數一百零六頁\編于十九點目前五十七頁\總數一百零六頁\編于十九點抗體除對組織和細胞中特異性抗原進行定位外，尚有強大的中和能力阻斷蛋白質功能。對于細胞內的靶分子，需要以合適的方式將抗體導入細胞。顯微注射是一種將抗體注入細胞的方式，但是這種方式難以做到高通量，影響了藥物靶標發現驗證的速度。為了滿足高通量研究的需要，Moris創建了一套化學試劑方法將抗體導入細胞，而抗體的功能和細胞的活性不受影響。另一種將抗體導入細胞的方式是讓抗體在細胞內表達(intrabodies)，其中包括使用滅活病毒的方法。目前五十八頁\總數一百零六頁\編于十九點Abispecific,tetravalentintradiabodyJBiolChem.2003;278(48):47812-47819目前五十九頁\總數一百零六頁\編于十九點IntrabodyandTie-2/VEGF-R2colocalizationonHUVECJBiolChem.2003;278(48):47812-47819目前六十頁\總數一百零六頁\編于十九點A,kineticsofsurfaceexpressionofTie-2andVEGF-R2aftergenetransferoftheintradiabodyandconventionalscFvintrabodiesonHUVECusingrecombinantadenoviruseswithanMOIof10B,genetransferofintrabodiesdirectedtohumanTie-2,VEGF-R2,orTie-2/VEGF-R2byrecombinantadenovirusesonday6afterinfectionJBiolChem.2003;278(48):47812-47819目前六十一頁\總數一百零六頁\編于十九點Inhibitionofcapillarytubeformationinvitro

JBiolChem.2003;278(48):47812-47819

目前六十二頁\總數一百零六頁\編于十九點三、蛋白質靶標2、生色團輔助激光滅活(chromophore-assistedlaserinactivation,CALI)

目前六十三頁\總數一百零六頁\編于十九點CALl能夠直接對蛋白質進行操作，而不是通過對蛋白質量的變化進行檢測。將標記有孔雀綠染料的非功能滅活抗體與特異性蛋白質結合，然后對蛋白質復合物進行激光照射。染料受激光激發短暫的產生活性分子，對結合的蛋白質造成破壞而起到滅活作用，但不影響其他蛋白質組分。目前六十四頁\總數一百零六頁\編于十九點AlentiviralsystemforsimultaneousknockdownandrescuewithafunctionalEGFP-fusioncomplement.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707目前六十五頁\總數一百零六頁\編于十九點CALIofEGFP-CPinducestheformationofdorsalrufflesandfilopodiaonlyintheknockdown/rescuebackground.ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707目前六十六頁\總數一百零六頁\編于十九點CALIofEGFP-CPinKDRcellsgeneratesalocalincreaseinbarbedendsofactinfilamentsanddorsalF-actin.

ProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707目前六十七頁\總數一百零六頁\編于十九點CALIofEGFP-MenainMena/VASP-deficientcellsinducesmorestablelamellipodialprotrusionsProcNatlAcadSciUSA.2007;104(16):6702-6707目前六十八頁\總數一百零六頁\編于十九點三、蛋白質靶標3、蛋白質組技術

目前六十九頁\總數一百零六頁\編于十九點基因基因是一段DNA（脫氧核糖核酸分子）雙鏈。－堿基成對出現:ATCGGCCTAGCCGG目前七十頁\總數一百零六頁\編于十九點基因表達中的信息流中心法則（TheCentralDogma）目前七十一頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質翻譯目前七十二頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質結構的層次一級結構

-氨基酸序列二級結構

-主要由氫鍵穩固的局部構象，如-helix,-sheet等三級結構

-三維構象四級結構

-多個多肽鏈的組合目前七十三頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質結構的圖形描述分子表面-分子可視化-分子對接-基于結構的藥物設計-…目前七十四頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質組分析的首要要求將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質進行分離、檢測和分析。2-DE技術依然是大多數蛋白質組研究中分離復雜蛋白質混合物的首選技術。目前七十五頁\總數一百零六頁\編于十九點生物學問題的提出實驗模型的設計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質的消化質譜的多肽指紋圖、微測序分析質譜結果的生物信息學分析和比對新蛋白質的發現其它實驗的進一步驗證蛋白信息的初步獲得目前七十六頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質組研究的基本技術路線蛋白質樣品的制備雙向電泳圖像分析轉印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質質量N端測序肽序列質譜數據肽指紋圖數據搜索新的或已知蛋白蛋白轉錄后修飾的鑒定目前七十七頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質二維電泳：蛋白質提取樣品前處理一向等電聚焦二向SDS—PAGE凝膠銀染及掃描雙向電泳分析軟件分析差異蛋白質點的質普分析生物信息數據查詢、建立蛋白質數據庫目前七十八頁\總數一百零六頁\編于十九點雙向電泳分析中的樣品制備制備原則：應使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態（包括多數疏水性蛋白），且制備方法應具有可重現性。防止樣品在聚焦時發生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發生樣品的抽提后化學修飾（如酶性或化學性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。目前七十九頁\總數一百零六頁\編于十九點可溶性樣品

固體組織樣品

細胞不同樣品的基本處理方法樣品的分級處理通過采用亞細胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質樣品進行分級處理，可降低樣品的復雜性并富集低豐度蛋白質。當前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進行分離。目前八十頁\總數一百零六頁\編于十九點樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質的最關鍵因素之一。溶解的目標：1、樣品中非共價結合的蛋白質復合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結合牢固的蛋白復合物可能使2-DE中出現新的蛋白點，相應的表示單個多肽的點的強度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態。目前八十一頁\總數一百零六頁\編于十九點增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變溶液中的氫鍵結構使蛋白質充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經過變性劑處理而暴露蛋白質的疏水基團后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯用條件下，加用還原劑可使已變性的蛋白質展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦（TBP）進行還原。目前八十二頁\總數一百零六頁\編于十九點起載體作用的兩性電解質：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態，否則這些蛋白質在其處于PI點時會發生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質的溶解性。應用時，兩性電解質的濃度應小于0.2％（w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應使兩性電解質的pH值與之相符合。目前八十三頁\總數一百零六頁\編于十九點樣品中核酸的去除對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質形成復合物后會出現假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內切酶進行降解，或是利用合成載體兩性電解質（SCA）同核酸結合形成復合物的能力，再通過超速離心來去除復合物。目前八十四頁\總數一百零六頁\編于十九點亞蛋白質組樣品的制備用超離心技術分離出細胞器、質膜和細胞核等成分，再用適當的蛋白質溶解液進行溶解。其優點是不僅大大減少樣品的復雜性，而且可對分離的蛋白質進行亞細胞定位。但該法需要專業儀器，有時會出現假陽性。順序抽提法：根據細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽提的方法。第一步：用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標準IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。目前八十五頁\總數一百零六頁\編于十九點特殊樣品的制備

低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量，但同時增加了高豐度蛋白的負荷，且造成蛋白的疊加效應而影響分離?，F常用預分級＋窄pH膠的微制備技術進行分離：即將總蛋白組分成蛋白質組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進行窄pH范圍的分離。

目前八十六頁\總數一百零六頁\編于十九點強堿性蛋白質（如核糖體）的處理：先將蛋白預處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續積累濃縮，與小分子量的蛋白質發生對流混合，產生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質復合物變成了多肽，或者可能是大分子。目前八十七頁\總數一百零六頁\編于十九點垂直板凝膠電泳裝置加樣樣品遷移方向目前八十八頁\總數一百零六頁\編于十九點電泳過程中分子遷移的規律，小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的一個帶孔膠粒?；旌蠘悠穾Э啄z

按分子大小分離電泳方向

電泳

小分子大分子目前八十九頁\總數一百零六頁\編于十九點夾在兩塊玻璃板之間的凝膠

電泳緩沖液

電泳緩沖液

加在槽中的經SDS處理的樣品分子量小分子量大電源目前九十頁\總數一百零六頁\編于十九點電泳后的凝膠經考馬斯亮籃染色、脫色后的凝膠照片目前九十一頁\總數一百零六頁\編于十九點標準蛋白分子量未知蛋白在一定的凝膠濃度下，多肽鏈分子量的對數與多肽鏈的相對遷移率成線性關系，所以可以通過標準曲線求未知多肽鏈分子量。

相對遷移率目前九十二頁\總數一百零六頁\編于十九點水平式電泳裝置電泳緩沖液凝膠目前九十三頁\總數一百零六頁\編于十九點B.等電聚焦電泳（IFE）

利用聚丙烯酰胺凝膠內的緩沖液在電場作用下沿電場方向在凝膠內制造一個pH梯度。每種蛋白質都將遷移至與它的pI相一致的pH處。凝膠中加有兩性電解質溶液（pH9-3）

加電場后在凝膠內形成一個穩定pH梯度

加樣品，然后繼續電泳凝膠染色表明樣品按照各自pI值沿著pH梯度分布目前九十四頁\總數一百零六頁\編于十九點等電聚焦電泳進行過程中等電聚焦電泳結束后（＋）（＋）（－）（－）高pH高pH低pH低pH目前九十五頁\總數一百零六頁\編于十九點C.雙向電泳第一向：等電聚焦電泳第二向：SDS雙向電泳后的凝膠經染色后蛋白呈現二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異，垂直方向反映出它們在分子量上的差別。第一向電泳：等電聚焦電泳聚焦后凝膠放置在SDS凝膠上，進行第二向電泳第二向電泳：SDS分子量大分子量小pH9pH3pH9pH3目前九十六頁\總數一百零六頁\編于十九點大腸桿菌全蛋白提取液雙向電泳凝膠染色后照片目前九十七頁\總數一百零六頁\編于十九點蛋白質的膠內酶切包括感興趣蛋白點的挖取、含蛋白質凝膠的脫色、膠內蛋白質的酶切等過程目前九十八頁\總數一百零六頁\編于十