基因工程制藥簡介張義浜2017-05-20概述目的基因的獲得基因的表達基因工程菌的培養基因工程藥物的分離純化傳統制藥（生化制藥）存在的問題:1.材料來源或制造技術困難而無法研制出產品；

2.從動物臟器中提取易感染病毒；

3.存在免疫原性，使用受限制。基因工程制藥的優點大量生產過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽提供足夠數量的生理活性物質發現更多的內源性生理活性物質利用基因工程和蛋白質工程對生理活性物質進行修飾和改造，提高藥效價值獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源基因工程技術所生產的藥物

用傳統方法很難生產的，主要是藥用活性蛋白質/多肽，包括：（1）免疫相關蛋白各種抗原、單克隆抗體。（2）細胞因子如IFN、IL、CSF、EGF、VIII、EPO（3）激素胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素。（4）酶類尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、SOD、a-淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑。早期部分基因工程產品的研制、開發、上市時間產品研制國家用途上市國家人生長激素釋放抑制素(SRM)1977日本巨人癥人胰島素1978美國糖尿病1982歐洲人生長激素（HGH）1979美國侏儒癥1985美國人α-干擾素（IFN）1980美國病毒1985歐洲乙肝疫苗1983美國乙肝1986歐洲人白細胞介素（IL）1984美國腫瘤1989歐洲人促紅細胞生成素（EPO）日本貧血1988歐洲人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)白血病1991美國人組織纖溶酶原激活劑（t-PA）血栓癥1987美國我國批準上市的部分生物技術藥物批準年份藥品批準年份藥品1989IFN-α1b1999125AlaIL-2、人胰島素、Anti-CD3鼠源單抗1992IFN-α2a2000人堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表皮生長因子（EGF）、EGF衍生物霍亂疫苗（rBS-WC）1994白介素2（IL-2）2001抗IL-8鼠源單抗凝乳劑1995乙肝疫苗（酵母）2003IL-11、腫瘤細胞細胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（r-SAK）1996IFN-α2b，乙肝疫苗（CHO）粒細胞集落刺激因子（G-CSF）2004重組人p53腺病毒注射液抗EGFR人源單抗1997粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）重組鏈激酶（γ-SK）、EPO2005重組人腦利鈉肽、重組人血管內皮抑素重組人5型腺病毒注射液（H101）、rhTNF-α、rhTPO1998IFN-γ、125SerIL-2、生長激素（GH）痢疾疫苗、牛堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）2006重組TNFR-Fc融合蛋白

什么是基因工程技術？ 基因工程（geneticengineering）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體DNA技術，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質——基因，在體外進行剪切、組合和拼接，使遺傳物質重新組合，然后通過載體（質粒、噬菌體或病毒等）轉入微生物、植物或動物細胞內，進行無性繁殖，并使所需要的基因在細胞中表達，產生出人類所需要的產物或組建成新的生物類型。制備基因工程藥物的基本過程

獲得目的基因

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構建重組質粒

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組建基因工程菌(或細胞)

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培養工程菌

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產物分離純化

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除菌過濾

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半成品檢定

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成品檢定

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包裝上游階段選擇表達系統主要考慮：必須保證所表達的蛋白質具有生物活性考慮基因工程蛋白質表達量的多少蛋白質分離純化的難易程度下游階段基因的克隆工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等反轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基目的基因的獲得一、反轉錄法二、反轉錄PCR三、化學合成法常用的方法:一、反轉錄法為了克隆編碼某種特異蛋白質多肽的DNA序列，可以從產生該蛋白質的真核細胞中提取mRNA,以其為模板，在反轉錄酶的作用下，反轉錄生成該蛋白質mRNA互補DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA第一鏈為模板，在DNA聚合酶Ⅰ作用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈DNA序列。cDNA克隆示意圖DNA聚合酶ImRNA

反轉錄酶ss-DNAds-cDNAds-cDNA核酸酶S1二、反轉錄PCR

提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA第一鏈，直接以其為模板（不需要合成cDNA第二鏈）進行PCR擴增，獲得目的基因，用于重組、克隆。三、化學合成法前提：核苷酸序列已知；或已知其蛋白質的氨基酸序列，再推導出核苷酸序列限制性：

1）不能直接合成太長的基因；

2）遺傳密碼的簡并性可導致中性突變；

3）成本較高DNA合成儀基因的克隆與表達基因表達：基因在生物體中的轉錄、翻譯及所有加工過程。基因高效表達：外源基因在某種宿主細胞中的表達活動，即剪切下一個外源基因片段，重組到另一個基因表達體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產的表達產物。基因表達研究的主要問題：目的基因的表達產量、表達產物的穩定性、產物的生物學活性和表達產物的分離純化。建立最佳的基因表達體系，是基因表達設計的關鍵一、宿主菌的選擇宿主菌應滿足以下要求：具有高濃度、高產量、高產率；能利用易得廉價原料；不致病、不產生內毒素；發熱量低，需氧低，適當的發酵溫度和細胞形態；容易進行代謝調控；方便重組DNA操作；產物容易提取純化。1.原核細胞（1）大腸桿朗菌表達產侮物的形逗式：細口胞內不滲溶性表仇達(包涵體)、胞內堅可溶性蠅表達、荒細胞周競質表達弱，極少開數情況擁下也可第分泌到舉細胞外級。不同棟的表達之形式具朋有不同鋤的表達嗽水平及靈完全不估同的雜系質。大腸桿菌狗表達外源基崖因的優翼勢全基因場組測序推，遺傳捐背景清紋楚（共4405ORF）基因克隆倘表達系統財成熟完善繁殖迅老速、培抵養簡單錢、操作草方便、鴨遺傳穩搬定被美國FDA批準為安閉全的基因忽工程受體生物缺陷缺乏對壘真核生惕物蛋白扔質的復異性功能缺乏對怒真核生油物蛋白扮質的修協飾加工銅系統內源性霞蛋白酶摩降解空辰間構象駕不正確讀的異源聰蛋白細胞周質世內含有種煙類繁多的案內毒素（2）枯草芽嗎孢桿菌分泌能遣力強，敘可將蛋慘白質產類物直接獵分泌到戚培養液蓋中，不起形成包涵體；不能樣使蛋白奏質糖基盤化，另漆外由于杠它有很喘強的胞隨外蛋白俱酶，會邁對產物頂進行不價同程度盡的降解（3）鏈霉菌重要的索工業微灑生物。煩不致病臭、使用漸安全，萍分泌能金力強，姿可將表現達產物弦直接分掉泌到培頓養液中乒，具有一失定的糖基化能力2、真核村細胞（1）酵母特點：真核生物雪細胞，表租達產物能態糖基化；基因組場小，僅振為大腸憶桿菌的4倍；世代時窗間短，蹲繁殖迅揪速；基因操嚇作與原貌核生物紗相似；建立了射有分泌肯功能的銜表達系追統，將遷產物分聲泌出胞洗外，分悼離純化編工藝相椒對簡單姜。（2）絲狀預真菌特點：有很強的磁蛋白分泌旱能力；能正確進獅行翻譯后熊加工，包籃括肽剪切損和糖基化龍等;其糖基化按方式與高喪等真核生畢物相似；絲狀真富菌（如煩曲霉等公）等被個確認是慈安全菌寶株，有更成熟的命發酵和瞞后處理劍工藝。真核生物半和原核生抬物基因表達過程示意旋圖克隆載體:克隆了外源DNA后，轉入爬宿主細胞起中進行繁度殖，使克隆的DNA片段數量掩大大增加表達載體:將外源基因妥或DNA片段在宿備主細胞中蜓表達蛋白質插入型眠載體:將外源萌基因或DNA插入其施中置換型泰載體:切除載體部分DNA，代之予以外源再基因或DNA。載體（vec頌tor）質粒（plas秩mid）質粒是侍生物細滿胞內固畝有的、銅能獨立宰于寄主醋細胞染忍色體外籍而自主糕復制、利并被穩今定遺傳產的一類倘核酸分鍬子。絕大答多數質粒是DNA型的，天澡然DNA質粒具有糊共價、封俊閉、環狀趣的分子結乳構，即ccc饑DNA。基因克隆界的載體質玩粒DNA分子都具論有復制子啞、選擇性廈標記、克默隆位點。原核細禁胞表達載議體非融合型pKK2歉23-3分泌型PIN板Ⅲ-o恩mpA冊1融合蛋白碎表達載體pGE時X結構包涵體型pBV泥220結構融合蛋白為表達載體非融合型盤表達載體分泌型表均達載體包涵體杯型表達殼載體（一）表昌達載體表達載體栽必須具備臨的條件：載體能嶼夠獨立漢的復制字；具有靈活臨的克隆位鉤點和方便叼的篩選標妙記,且克隆位蝴點應在啟掩動子序列其后，以便粗外源基因勻表達；具有很欣強的啟保動子，劣能為大追腸桿菌際的RNA聚合酶料識別；具有阻遏么子，使啟鉤動子受到將控制，只嶺有當誘導土時才能進勵行轉錄；具有很吊強的終糟止子，婚使RNA聚合酶艷集中力冤量轉錄不克隆的嬌外源基參因，而敵不轉錄唇無關的掉基因；所產生灑的mRN旁A必須具郊有翻譯羨的起始跪信號，版即起始融密碼AUG和SD序列，以儲便轉錄后曬能順利翻川譯。（二）影稈響目的基治因在大腸養桿菌中表心達的因素外源基因鑄的劑量外源基貨因的表漢達效率蚊：A、啟動子煉的強弱：精將目的基歡因插入大殺腸桿菌RNA聚合酶令能識別麥的強啟叼動子下廚游B、核糖腫體結合磁位點的真有效性C、SD序列和起黃始密碼的列間距D、密碼親子組成逮：設計制引物或承合成基舒因時選換擇大腸匆桿菌“梢偏愛”椒的密碼閱子表達產物霜的穩定性繞：A、組建系融合蛋限白；B、利用強信號肽桃將真核時基因產燃物搬至腰周質空油隙中；C、位點灑特異性填突變，哄增加蛋聽白的穩窗定性；D、采用特蛋白酶袋缺陷型星大腸桿韻菌，減池弱降解大作用細胞的缸代謝負拐荷：A、宿主腹細胞的圓生長與黎外源基節因的表據達分開杏；B、宿主牢細胞的戶生長與匆重組質麻粒的復袋制分開樣；C、形成不蔥溶性的包壇涵體工程菌的興培養條件（三）德真核基眠因在大拔腸桿菌怨中表達杠的形式1.以融合厚蛋白的浙形式表臉達藥物計基因其氨基矮端是原跳核序列點，羧基規端是真較核序列術，以原繁核多肽坊和真核早蛋白結鑒合在一倍起，稱宏融合蛋旁白。優點：操零作簡便，伍表達蛋白鞏在菌體內扒穩定，不濤易被細菌酶類談降解；易爬實現高效掛表達；缺點：紛有免疫尋原性，總需切除詢原核多鋼肽2.以非融合轟蛋白的形含式表達藥賞物基因非融合懶蛋白指讓在大腸振桿菌中甜表達的牌蛋白質貴以真核槳蛋白的mRN艦A的AUG為起始慕，在其絹氨基端斃不含細酸菌多肽武序列。優點：保捉持原有蛋對白活性；缺點：結易被蛋悠白酶破零壞；可浪能引起剖人體免埋疫反應3.分泌型表借達蛋白藥芽物基因將外源基佩因融合到扇編碼信號者肽序列的胡下游。常用的信鑄號肽有：較堿性磷酸受酶信號肽侮；膜外周線質蛋白信號肽守；霍亂陣弧菌毒仍素B亞單位支；優點：居在周質雞中穩定軟，有活嗎性，不茄含甲硫便氨酸殘陶基；缺點：產零量不高，信號肽不被切宴割或不持在特定遷位置上程切割。酵母中的基因表疏達（一）表瓶達載體1.載體的復丘制序列（1）YEp類（酵母俯附加體質器粒）（2）YRp類（酵躁母復制追型質粒矩）（3）YCp類（酵母還著絲粒質伸粒）（4）YIp類（酵母整合廁型質粒）2.克隆載騙體向酵母俊載體中煌引入大覆腸桿菌肝質粒pBR3秒22的ori部分和Ampr或Tetr部分，這煌樣構成的斑克隆載體性同時帶有細菌和海酵母的復販制原點和蔑選擇標記牽。酵母常用她的選擇性舅標記：氨源基酸或核則苷酸合成鍋酶系基因羨，對抑壺制酵母駁生長的討藥物具債有抵抗活力的抗姿性基因3.表達載尿體普通表達若載體：只嚼能方便地僑引入外源駝基因并進糾行表達，對表嘗達產物的隱組成，特生別是對其N末端氨派基酸是否增汁減并無池嚴格要宴求。精確表達劃載體：要尼求在啟動驅子或前導難肽編碼序團列的適當部劫位有內營切酶位峽點，以圈利于接殊入外源枯基因，觸并使它在光表達和浸加工后N末端氨基沫酸序列與投天然產物相同，既發無多余的撓氨基酸，土也無缺失懶的氨基酸電。（二）畜影響目純的基因憑在酵母兇菌中表嘩達的因喝素1.外源基因斗的劑量：櫻質粒拷貝幫數及其在閃宿主細胞切內的穩定夸性2.外源基因嚴的表達效晨率：A、啟動子B、分泌砍信號的踏效率C、終止蔽序列的攀影響3.外源蛋白濟的糖基化4.宿主菌株鬧的影響：A、菌體生根長力強；B、菌體內統源蛋白酶罰要弱；C、菌株性沃能穩定；D、分泌題能力強基因工澇程菌的唯培養基因工程奸菌發酵的爬基本操作識方式有：分批培粱養分批培養若操作簡單鴿，但因不鏈能控制生馬長，獲得監的菌體密敵度也有限半連續培決養（補料固分批）在一次投愿料發酵邊的基礎妹上，流肆加一定攻量的營哪養，使暈細胞進低一步的生長，或得到澤更多的代扁謝產物連續培養不斷地繡流加營撈養，并脫不斷地逮取出發話酵液。放連續培旺養則多刃用于動余力學特址性和穩做定性等典研究。透析培養固定化培撐養基因工厘程菌培奮養方式補料分批擠培養補料分腿批培養決是將種稱子接入脈發酵反慶應器中覺進行培騰養，經鐘過一段先時間，喇間歇或體連續地菠補加新將鮮培養披基，使絮菌體進那一步生禁長的培墻養方法預。在分批管培養中樣，為保貪持基因慮工程菌皇生長所榴需的良貍好微環夜境，延云長其生炭長對數圓期，獲伐得高密燦度菌體御，通常誦把溶氧都控制和帽流加補板料措施吳結合起匆來，根腹據基因記工程菌鎮的生長輪規律來效調節補放料的流位加速率智。連續培養連續培壯養是將廣種子接匙入發酵恥反應器灑中，攪覺拌培養仔至菌體滴濃度達壟到一定匹程度后堆，開動是進料和妥出料蠕爭動泵，桿以一定師稀釋率季進行不海間斷培晴養。連續培談養可以炕為微生汁物提供走恒定的鏟生活環有境，控筐制其比掛生長速烏率，為搖研究基煌因工程沿菌的發湊酵動力曾學、生前理生化震特性、瘡環境因鎮素對基押因表達謹的影響堤等創造廢了良好刻的條件尚。但由于基什因工程菌任的不穩定孝性，連續年培養比較叔困難。為顧了解決這聽一問題，薯人們將工利程菌的生饑長階段和粱基因表達葛階段分開煌，進行兩圈階段連續票培養。在套這樣的系丟統中關鍵兔的控制參國數是誘導修水平、稀依釋率和細哀胞比生長母速率。優鄰化這三個邊參數以保撇證在第一建階段培養踏時質粒穩傻定，菌體求進入第二交階段后可區獲得最高蒸表達水平薦或最大產革率。透析培灣養透析培暈養技術江是利用莖膜的半段透性原哪理使培摸養物和寄培養基很分離，巨其主要震目的是乎通過去堆除培養車液中的藍代謝產喚物來解峽除其對戚生產菌懂的不利逐影響。采用膜起透析裝永置是在盜發酵過沾程中用勉蠕動泵轉將發酵暈液抽出勇打入罐傻外的膜傅透析器授的一側疲循環，冬其另一辰側通入精透析液窗循環，解在補料熄分批培粘養中，翅大量乙川酸在透銷析器中距透過半膽透膜，愚降低培沉養基中科的乙酸深濃度，窮并可通要過在透噸析液中銅補充養別分而維遍持較合狀適的基帽質濃度各，從而金獲得高鳴密度菌介體。膜的種類虛、孔徑、燦面積，發軋酵液和透青析液的比律例，透析站液的組成沉，循環流粥速，開始范透析的時摘間和透析拉培養的持閱續時間段渴都對產物醒的產率有私影響固定化培愚養基因工程慮菌培養的梅一大難題鴉是如何維患持質粒的雨穩定性。擦有人將固魂定化技術螞應用到這儉一領域，蛛發現基因曲工程菌經漁固定化后絲式，質粒的羞穩定性大賭大提高，氏便于進行帆連續培養畝，特別是仁對分泌型重菌更為有自利。由于吳這一優點倡，基因工栽程菌固定蓬化培養研互究已得到赴迅速開展寶。基因工程興菌發酵中斬試基因工程美菌中試應移考慮的問們題：適宜掩商品化生屯產的工程蔥菌，設計小發酵反應妥器，選擇艙反應過程注，發酵培殿養基組分姥，維持生杯產工藝最取佳化的方險法，工藝矛監測方法撇，工藝控冬制方法，裹工藝自動每化使用方衰法，生物幼催化劑使鐘用，產品業提取方法叼的選擇，集分離精制呢技術的選圖擇。基因工程派菌的不穩艱定性主要表現在艦重組質哪粒的不失穩定性伐，兩種表現形節式：1）結構不穩債定性重組DNA分子上征某一區烤域發生廢缺失、倚重排、澆修飾，貼導致其美表觀生啄物學功襯能的喪還失2）分配不穩斧定性整個重組DNA分子從宮受體細浪胞中逃逸基因工程辣菌不穩定洋性的可能刻產生機制：受體細胞中限制修構飾系統對外源重卵組DNA分子的邪降解外源基因臣的高效表季達嚴重干凍擾受體細暈胞正常生給長代謝能量、物質的匱規乏和外源燈基因表達減產物的毒排性誘導受粗體細胞產樂生應激反穗應：關閉道合成途徑必，啟動降丑解程序重組質陷粒在受腿體細胞冤分裂時位的不均貍勻分配重組質吉粒逃逸的乘基本原香因受體細胞絨中內源性率的轉座元亡件促進重銜組分子的間缺失重排培養基比生長速旗率限制性基質溫度pH和溶氧外源基因表達遺傳特性影響基因交工程菌穩嫁定性的因狀素載體的選朗擇宿主的膚選擇外源基因短整合到宿杯主染色體傷上發酵工盟藝1.培養基一些基誓因重組姨菌在復此合培養暈基中顯鴨示較高含的質粒話穩定性微生物在柳含有有機盟氮源如酵男母抽提物害、蛋白胨積等營養豐祥富的復合農培養基中些培養時，院由于培養遲基提供了段生長必須劑的氨基酸觸和其他物畝質，微生互物的生長老較基本培杠養基快。培養條丙件對基因工嗓程菌穩定性的教影響2.比生長靈速率基因重桃組菌的羅比生長筒速率對添質粒穩棉定性有鞏很大影冷響。提核高比生配長速率險有助于循提高質為粒穩定口性。基因重撥組菌的務比生長節速率與坑培養環率境有關腐，如溫懂度，pH，溶氧，豪限制性營貝養物質濃籠度，有害陷代謝產物泰濃度等。受在一定的態溫度和pH下，限制晴性基質濃岸度往往是搞決定比生駐長速率的禮主要因素減。3.限制性基零質一般培捕養基中憑各成分諸并不是方完全平楊衡的，第經過一炊段時間豈的培養伶，微生者物的生邪長通常皂會受到垂一種或墊幾種物額質的限晉制。限譜制性基營質的種貌類對重刑組菌有租不同的斬影響4.p知H和溶解氧pH和溶氧是洽影響微寇生物生紐奉長的重驚要參數食，在發聯酵罐培厘養基因少重組菌唇時，通秩常都需的要維持回一定的pH和溶氧水秒平。在基那因重組菌算的高密度淡培養時，孤為了維持職所需的溶均氧水平，鏟除了提高材攪拌轉速慎和通氣量魯，往往還女要在通入事的空氣中橫補充氧氣火，以提高徐發酵罐的用供氧能力芳。5.外源基怕因的表話達外源基盞因的表水達會引牲起重組食質粒的媽不穩定扎；尤其沸當外源坑基因高田效表達裂時，有迫可能因般競爭利躬用物質丘、能量宰、核糖蹄體等干描擾宿主短細胞的憑正常代菊謝活動堆，并造擺成質粒范不穩定紹。例如，吲飲哚丙烯酸輪（IAA）是trp操縱子血阻遏物瘡的部分樓去阻遏死劑，在乎培養大肢腸桿菌MV12（pVH5）時，收在培養驕基中加擺入不同幫量的IAA，發現隨IAA量的增加鞋，pVH邊5帶有的儉分支酸棄合成酶逮和色氨博酸合成樓酶基因舞的表達掘水平有找很大提獸高，同戀時比生毒長速率鬧下降，叉培養液逝中Trp－的比例上窗升。電泳飾分析表明60%～70%色氨酸箏合成能篩力喪失木是由于籌質粒結肚構的變遠化，其四余是由障于質粒謀丟失造聯成。1、改進載體受類體系統以增加質粒坐穩定性為講目的的構塌建方法包毀括：1）將R1質粒上駱的parB基因引借入表達申型載體枝中，其夜表達產丙物可以根選擇性館地殺死塘由于分費配不均窮勻所產柳生的無窩質粒細聞胞2）正確液設置載心體上的諷多克隆摟位點，墨禁止DNA片段插騎在穩定間區內3）將受體惱細胞的致畜死性基因正安裝在載事體上，同粘時構建條克件致死性毒的相應受蠻體系統，起如大腸桿啄菌的ssb基因（DNA單鏈結合挪蛋白編碼專基因）提高基碑因工程堆菌穩定悲性的策暢略2、施加選擇壓飾力根據載體叉上的抗藥睜性標記，浴向培養系屆統中添加大相應的抗邪生素藥物和食牲品生產時警禁止使用麗抗生素；競加入大量框的抗生素填會使生產廁成本增加煉；添加一隔些容易被磨水解失活軌的抗生素膏，只能維插持一定時片間；添加去抗生素選穗擇壓力對萌質粒結構園不穩定無旦能為力載體上的辦營養缺陷捆型標記，共向培養系必統中添加曠相應的營氏養組份培養基復喜雜，成本易較高提高基因車工程菌穩自定性的策庫略3、分階段控塵制培養因外源葬基因表頸達造成槽質粒不屋穩定時壟，可以摔考慮將濤發酵過典程分階絨段控制在生長叨階段使之外源基賠因處于殲阻遏狀且態，避稱免因表敲達造成學不穩定焰性問題望的發生手；在獲茂得需要傳的菌體販密度后既，再去將阻遏或丘誘導外刑源基因貴表達。連續培農養時可方以考慮糠采用多抄級培養遍，如在罷第一級猾進行生蟲長，維照持菌體累的穩定脫性，在三第二級宏進行表包達。提高基綠因工程黃菌穩定滾性的策擾略4、控制目的基陣因的過落量表達使用可控癢型啟動子魄控制目的桐基因的定橋時表達及印表達程度使用可榮控型復娛制子控袋制質粒白的定時錦增殖或址降低質腰粒的拷西貝數5、優化基因工撐程菌的糖培養工酸藝培養基進組成：讓限制培荷養基比牽豐富培裕養基更季有利于古穩定培養溫度：等較低的培養溫堪度有利于屋重組質粒贊的穩定提高基裹因工程事菌穩定巨性的策卸略6、控制培養條肌件有些含質粒的晨菌對發酵港環境的改窯變比不含御質粒的菌獨反應慢，啊因而采用憲間隙改變北培養條件誕的方法以濃改變這兩蔑種菌的比顫生長速率刊，從而改有善質粒的淋穩定性。挑通過間隙彼供氧的方崖法和通過傍改變稀釋配速率的方膏法都可提喊高質粒的叢穩定性。例如研究表笑達干擾素的大腸桿菌W311并0(pE票C901剩)在不同比劉生長速率碼下的質粒曠穩定性，怕隨著稀釋蝕率的增加蒸，質粒穩陪定性明顯誘增加，干刑擾素的比中效價也明釀顯增大.提高基因麥工程菌穩抽定性的策戀略7、固定化培養固定化可嚴以提高基炭因重組大撫腸桿菌的笛穩定性基因重芬組大腸習桿菌進糕行固定征化后，和質粒的孤穩定性鎖及目的拘產物的羊表達率俗都有了摧很大提遵高。糊在游離燒重組菌鉗系統中學常用抗揉生素，稿氨基酸覆等選擇耳性壓力鑼穩定質潮粒的手塵段，往播往在大牛規模生波產中難殺以應用握。而采唐用固定祝化方法注后，這景種選擇景壓力則貝可被省顧去。不倦同的宿漆主菌及甲質粒在臟固定化仗系統中抹均表現菜出良好希的穩定秒性。提高基因親工程菌穩導定性的策倍略基因工咸程藥物詞的分離找純化目的產物在溪初始物悠料中的褲含量較疼低；含目的熟產物的封初始物衣料組成裝復雜，盒除目的菌產物外炎，還有畫大量的后細胞、斑代謝物階、殘留獄培養基朗、無機也鹽等，洽特別是錫產物類炊似物對編目的產馳物的分胖離純化玻影響很欺大；目的產物貢的穩定性燦差，具有木生物活性灣的物質對pH、溫度、術金屬離子皆、有機溶漫劑、剪切序力、表面政張力等十仆分敏感，字容易失活爺、變性；種類繁多增，包括大區、中、小寶分子、結躺構簡單或縮慧復雜的有冶機化合物朝，以及結純構和性質謎復雜又各讀異的生物販活性物質然；應用面廣擋，對其質儲量、純度晨要求高，乘甚至要求哈無菌、無淺熱原。基因工程過藥物或生抱物技術產幅品特點一、建述立分離傾純化工甚藝需了越解的各朋種因素1.含目的仔產物的爛初始物蘿料的特絮點（1）菌種類型及逗其代謝肝特性（2）原材撤料和培遇養基的葡來源及院質量是煎否穩定（3）生產薦工藝和鄙條件（4）初始物料的絡物理、么化學和就生物學色特性2.物料中志雜質的參種類和覺性質3.目的產偵物特性4.產品質歸量的要具求二、分離竟純化的基宗本過程基因工程凱藥物的分侮離純化主栗要分為5個步驟，包括細坊胞破碎咽、固液彩分離、權濃縮與僻初步純靜化、高似度純化直拒至得到披純品，杠以及成際品加工培。分離純除化目的給產物主蜜要依賴菜于色譜釘分離技狡術。色譜技衡術分為扔：離子交驗換色譜親和色譜凝膠過陷濾色譜高效液仇相色譜林等三、重組蛋白質的寶分離純化產物的獄主要特檢性及在府分離純絹化中的涂作用基因工程激藥物生產夫中常用的恭分離純化踏方法基因工程榜藥物制造幻玉實例干擾素存是真核喉細胞對火各種刺孕激作出蔥反應而鏡自然形飛成的一派組復雜環的蛋白摧質。干寸擾素除但具有廣座譜抗病夸毒活性椅，還具補有抑制耐細胞分沒裂，特衡別是抑佩制腫瘤允細胞生筍長和免黎疫調節樓等功能鑼，作為贊一種生穴物活性補蛋白有同著良好境的臨床要應用價耗值。干擾素納在我國精已經批輔準上市害的基因絞工程藥漆物。早期獲脆得方法厭：用病川毒誘導俘人白血鏟球(白細胞)產生，顏產量低毛，價格圖貴。300L人血才齡提取1mg（一）干厲擾素200腹3年抗非司典期間用，江南耍大學與走麗珠集觀團蘇州墾新寶制巨藥廠合額作攻關啊，通過甘發酵工黃程和生薦物制藥丈工程研驕制成功喬了重組序人α-2b干擾素口霧鼻腔噴霧階劑，解決瓣了干擾素于常溫保存汪穩定性問逃題。在疫鮮區特殊人諷群捐贈使同用，效果贊顯著。誘生的夸白細胞幟或者成任纖維細這胞提取撲核酸↓通過寡dT-纖維素柱僻提取mRNA梳pB箏R322質粒↓純↓5%-2撞3%蔗糖密度爪梯度離心栽提取12S-準mRN稼A內切酶切適割↓↓由mRN鼓A轉錄成cDNA切割段位視于β內酰胺府基酶基至因內↓頑結留果導致內腦酰胺基酶呼失活，不吳抗青霉素雙鏈cDN肝A用末端Pst-柴I酶切割↓再用DNA轉移酶除接上dT或者dG在pBR3終22質粒DNA的切割段葵加上dA或者dC+++悟+++婆+++鎮+++刺+++艷+退火獲乘得雜交斗質粒已↓灶轉化大磁腸桿菌K-1肺2擴增雜交笑質粒不↓篩選能姿夠抗四節環素、遲但是對伯氨芐青邪霉素敏楊感的細易菌克隆疼株↓采用雜交趣翻譯法挑避選含有干家擾素cDN丟A的克隆愁↓期將干冊擾素cDNA克隆進表銳達載體斃↓貼在陪大腸桿菌喪中進行高賣效表達↓（進入下關游工藝）工程菌轎構建工程菌溪的發酵托生產人干擾素a-2b的基因工伐程菌為SW-堤IFN占a-2雷b/E爸.co堵li—銷DH5勒a。

質錯粒使用PL啟動子，遺含有氨芐服青霉素抗肆性基因。繡種子培兵養液含1%蛋白胨、0.5%酵母提駛取物、0.5%無NaCl。繪↓

基上因工程辨菌接種毫到4個1000蝴ml三角燒壇瓶之中客，每個兼燒瓶內副裝有250m嚇l種子培既養基，30℃搖床培榮養10小時，作末為發酵罐股的種子。唐↓

用15L發酵罐末進行發潔酵，裝盡發酵培拘養基10L發酵培凍養基組推成如下皇（1%蛋白胨、0.5%酵母提取料物、0.0腎5%N竭aCl、0.0宵1%N睡H4Cl、0.6%恒Na2HPO4、0.0王01%暈CaC棕l2、0.3百%KH2PO4、0.01宇%MgS略O4、0.4昆%葡萄糖定、50m肆g/m利l氨芐青佛霉素、仿少量防延泡沫劑插。pH=捷6.8。）利↓

攪拌曠轉速500滔r/m脊in、通氣量漁為1：1v/途v*m忌in、溶氧量囑為50%導30曬℃發酵8小時（細充菌增殖階愿段）42℃誘導2-3小時（避產物生謊產階段術）熟↓[監控手賞段：每魄隔不同霸時間，盯取2毫升發酵葛液，1000盤0r/m飾in離心除槳去上清涌液，稱舍量菌體蚊濕重。]發酵物羽質4000賴r/mi枝n離心30mi社n，除去上備清液。得礎濕菌，從叼其中取100孔g。懸浮于20m蟲mol吵/L磷酸緩沖陶液（pH=7疾.0）500m息l之中，冰冰浴條件下所進行超聲趁破碎。幸↓400貪0r/廟min離心30m銹in，除去緣瑞上清液份。沉淀學部分用100池ml抽提液在口室溫條件機下，進行謀攪拌抽提2小時，抽方提液組成格配方[8m告ol/駕L尿素、20mm脫ol/L磷酸緩沖覺液（pH=7逢.0）、0.5裙mmo樣l/L密DT服T]。

↓傾抽提弱液1500仆0r/m毒in離心30m服in，下層妨棄去。如取上清耳液，用20m恒mol做/L磷酸緩饅沖液（pH=