維生素D臨床知識&產品培訓第一頁，共一百一十七頁。目錄博暉維生素D試劑盒介紹123維生素D檢測臨床意義維生素D檢測指南與方法第二頁，共一百一十七頁。一、維生素D檢測臨床意義1、維生素D簡介2、維生素D生理功能3、維生素D與疾病第三頁，共一百一十七頁。（1）理化性質（2）代謝過程41、維生素D簡介第四頁，共一百一十七頁。維生素D是一種脂溶性維生素，維生素D與動物骨骼的鈣化有關,故又稱為鈣化醇。也被看作是一種作用于鈣、磷代謝的激素前體，它與陽光有密切關系，所以又叫“陽光維生素”。維生素D是一族A、B、C、D環結構相同，但側鏈不同的一類復合物的總稱，目前已知的維生素D至少有10種，但最重要的是維生素D2（麥角骨化醇）和維生素D3（膽鈣化醇）。維生素D易被紫外光破壞，因此，含維生素D的試劑均應避光保存。（1）理化性質第五頁，共一百一十七頁。維生素D2是紫外線照射植物中的麥角固醇產生，在自然界存在較少。維生素D3則由大多數高級動物的表皮和真皮內含有的7-脫氫膽固醇經紫外線照射轉變而成。維生素D2維生素D3（1）理化性質第六頁，共一百一十七頁。含量較多的食物有魚肝油、含油脂的魚類如（三文魚、沙丁魚,魚肝油）、奶油、雞蛋黃、雞鴨肝等動物肝臟以及牛奶。另外，維生素D可由人體經紫外線照射后生成，所以日光浴是取得維生素D的可靠來源，所以提倡多做戶外活動。VitD主要來源（2）代謝過程第七頁，共一百一十七頁。（2）代謝過程第八頁，共一百一十七頁。機體主要的調節因子：1,25(OH)2D3本身甲狀旁腺激素血清鈣和磷的濃度維生素D的分解代謝主要在肝臟，代謝物進入膽汁入腸，隨糞便排出。在體內，維生素D主要儲存在脂肪組織與骨骼肌中，肝臟、大腦、肺、脾、骨骼和皮膚中也存在少量。（2）代謝過程第九頁，共一百一十七頁。維生素D肝臟25-羥化酶25（OH）D腎臟1-羥化酶1，25（OH）2D

血P↑（—）（—）血Ca↑（—）（—）（+）血P↓PTH（+）血Ca↓(—)CT（+）(+)（2）代謝過程第十頁，共一百一十七頁。（1）調節鈣磷代謝（2）調節細胞分化（3）調節免疫力112、生理功能第十一頁，共一百一十七頁。調節鈣磷代謝：維生素D與甲狀旁腺素共同作用，維持血鈣水平穩定。這對正常骨骼的礦化、肌肉收縮、神經傳導以及體內所有細胞的功能都是必需的。生理循環圈起點為甲狀旁腺內鈣受體對鈣的識別。當血鈣水平下降時，甲狀旁腺分泌PTH，刺激腎25-OH-D-12-氧化酶從25-OH-D3儲存池中轉化更多的1,25-(OH)2D3。隨PTH水平的升高，1,25-(OH)2D3增加，導致腸、骨和腎中鈣轉運增多，促進鈣在腎小管的重吸收，將鈣從骨骼中動員出來，在小腸促進結合蛋白質的合成，增加鈣吸收，最終使血鈣恢復正常水平。（1）調節鈣磷代謝第十二頁，共一百一十七頁。調節鈣磷代謝：這個過程均由甲狀旁腺的鈣受體進行識別。PTH分泌減少不僅是由鈣活性反饋，也可由與1,25-(OH)2D3有關短反饋環路直接抑制甲狀旁腺分泌PTH。當血鈣過高時，促進甲狀旁腺產生降鈣素，阻止鈣從骨髓中的動員，增加鈣磷經尿中排出。維生素D缺乏將導致25-(OH)D3和1,25-(OH)2D3的合成減少，鈣內環境出現失衡,并且要不斷地提高PTH的水平，表現為繼發性甲狀旁腺功能亢進。（1）調節鈣磷代謝第十三頁，共一百一十七頁。與細胞生長和分化的關系：近年來的研究資料表明，正常皮膚成纖維細胞和表皮細胞都有VD受體，VD缺乏大鼠的皮膚顆粒細胞層變薄，角蛋白改變和細胞內酸性磷酸酶活性降低等。VD3可抑制培養的小鼠角化細胞和正常人表皮細胞的增殖，并誘導其分化。也有資料表明VD3有抑制白血病細胞株M1增殖并誘導使之分化為成熟的單核細胞，延長動物存活時間的作用。VD3對其他腫瘤細胞也有明顯的抗增殖和誘導分化的作用。（2）調節細胞生長和分化第十四頁，共一百一十七頁。對免疫系統功能的調節：單核/巨噬細胞是非特異性免疫反應的主要防御機制。體外實驗證明VD3可促使白血病細胞、骨髓干細胞和外周血單核細胞向巨噬細胞轉化，并增強單核細胞和巨噬細胞的吞噬活性及殺菌能力。VD缺乏的人和動物對非特異性炎癥刺激的反應能力有明顯的降低，而且有吞噬活性和趨化功能障礙。（3）調節免疫第十五頁，共一百一十七頁。維生素D的各種功效都是由其受體調節的。維生素D受體除了在腸和骨中表達外，還在腦、前列腺、乳房、結腸、免疫細胞、血管平滑肌和心肌細胞中表達。參考文獻1)HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed2007;357;266-812)WangTJetal.VitaminDdeficiencyandriskofcardiovasculardisease.circulation2008;117;503-511第十六頁，共一百一十七頁。體內維生素D水平不足與非骨骼性疾病的風險增加有相關性，包括：心血管疾病、高血壓、癌癥、糖尿病、多發性硬化癥、類風濕性關節炎、傳染性疾病等。參考文獻1)HolickMF.VitaminDdeficiency.NEnglJMed2007;357;266-812)WangTJetal.VitaminDdeficiencyandriskofcardiovasculardisease.circulation2008;117;503-511第十七頁，共一百一十七頁。3、維生素D與疾病（1）佝僂病、手足搐搦癥（2）骨軟化病（3）骨質疏松（4）維生素D中毒第十八頁，共一百一十七頁。病因1、日光照射不足—主要病因2、VitD攝入不足

3、生長速度快4、藥物等5藥物影響（1）佝僂病、手足抽搐癥第十九頁，共一百一十七頁。20第二十頁，共一百一十七頁。VitD→Ca×P→骨樣組織鈣化障礙且繼續增殖骨骺端鈣化障礙骺線參差不齊→鈣化帶增厚或毛刷樣、杯口樣改變骨樣組織堆積→骨骺端膨出肋骨串珠手鐲、腳鐲骨干鈣化障礙→骨質疏松→彎曲變形（郝氏溝、“O”、“X”腿）病理性骨折扁平骨鈣化障礙→顱骨軟化骨樣組織堆積→方顱病理（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十一頁，共一百一十七頁。胸部：多見于1歲左右小兒.肋骨串珠雞胸郝氏溝漏斗胸上述畸形均使胸腔變小，影響呼吸功能.臨床表現（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十二頁，共一百一十七頁。

四肢腕踝6個月以上小兒手鐲、腳鐲下肢

1歲以上小兒“O”“X”型腿（1）佝僂病、手足抽搐癥（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十三頁，共一百一十七頁。全身肌張力下降，骨骼肌：（坐、站、走晚）腹肌肌張力下降，呈蛙腹（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十四頁，共一百一十七頁。神經興奮性改變：腦皮層功能減低的表現條件反射形成慢表情淡漠語言發育落后

免疫力低下：易合并感染、且易遷延、反復（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十五頁，共一百一十七頁。血生化改變明顯血Ca稍下降血P明顯下降25（OH）D31，25（OH)2D3X線改變：[長骨]

骨骺軟骨明顯增寬→>2mm

干骺端鈣化帶消失，呈毛刷樣、杯口樣改變

骨質普遍稀疏，密度減低

骨干可有彎曲或骨折Ca×P明顯下降

AKP明顯升高輔助檢查（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十六頁，共一百一十七頁。輔助檢查（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十七頁，共一百一十七頁。治療（一）維生素D制劑：

口服法維生素D2000~4000IU/d（50~100ug/d)

1,25(OH)2D3(羅鈣全)0.5~2.0ug/d（20~80IU/d）一個月后改為預防量(400IU/d)

肌注法：適合重癥、不能口服者VitD3：20~30萬IU初期：1次激期：2~3次，間隔2~4周2~3月后給預防量。注意同時用鈣劑（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十八頁，共一百一十七頁。（二）鈣劑治療

肌注VitD時

有搐搦者

食物中鈣量不足者

適應癥（三）矯形治療治療（1）佝僂病、手足抽搐癥第二十九頁，共一百一十七頁。3、嬰兒期：口服400~800IU/d（不可間斷）

4、幼兒期：夏季增加戶外活動，可不用VitD冬季（10月中旬）

南方：10~20萬IU（肌注）北方：20~40萬IU（肌注）（1）佝僂病、手足抽搐癥第三十頁，共一百一十七頁。31（2）骨軟化病骨軟化病由于成人缺乏維生素D及鈣質引起骨基質礦化障礙，以骨質軟化和骨骼畸形為特征。病人多為女性。第三十一頁，共一百一十七頁。臨床表現骨痛活動常受限，步態搖擺、步行困難，病理性骨折，長骨、肋骨、骨盆和脊柱骨均可發生胸廓兩側內陷，胸腔縮小兩側肋緣可及髂嵴或其間距明顯縮短。骨盆三葉畸形，身高縮短，可達１０cm以上。（2）骨軟化病第三十二頁，共一百一十七頁。骨質軟化癥X線表現早期普遍性骨質疏松，密度減低，骨皮質變薄，嚴重者呈線條狀。髓腔透亮度增加。骨小梁先是模糊，最終消失，可出現多個囊狀透光區。（2）骨軟化病第三十三頁，共一百一十七頁。2.假骨折是骨質軟化癥的X線特點（稱為Looser帶）。表現為橫越骨皮質的透明線，其邊緣密度略高，常呈對稱而多發。多見于肩胛骨、肋骨、坐骨、恥骨等。骨折處無骨痂形成和錯位，日久可出現骨骼彎曲畸形。（2）骨軟化病骨質軟化癥X線表現第三十四頁，共一百一十七頁。骨質軟化癥X線表現假骨折，Looser帶（2）骨軟化病第三十五頁，共一百一十七頁。雙凹征骨質軟化癥X線表現（2）骨軟化病第三十六頁，共一百一十七頁。治

療維生素D缺乏補充維生素D維生素D3400—800IU一般不超過每日4000IU增加鈣磷攝入（2）骨軟化病第三十七頁，共一百一十七頁。VDDRI1,25雙羥維生素D3（羅鈣全）1.0μg/日維生素D220,000-100,000U/日或25羥維生素D（0.1-1.0mg/日）增加鈣磷攝入：鈣劑1-1.5克/日（2）骨軟化病第三十八頁，共一百一十七頁。

正常骨 骨質疏松骨以骨強度受損

導致骨折危險性升高為特征的骨骼疾病。骨強度主要反映了骨密度和骨質量兩個方面的綜合特征。NIHConsensusDevelopmentPanelonOsteoporosis.JAMA285(2001):785-95（3）骨質疏松第三十九頁，共一百一十七頁。40（3）骨質疏松第四十頁，共一百一十七頁。（3）骨質疏松第四十一頁，共一百一十七頁。臨床表現骨痛（腰背酸疼痛）骨折身高縮短，骨骼畸形功能障礙（活動受限）（3）骨質疏松第四十二頁，共一百一十七頁。骨質疏松常見骨折椎體骨折橈骨遠端骨折髖部骨折肱骨外科頸骨折38%19%19%（3）骨質疏松第四十三頁，共一百一十七頁。防治藥物骨吸收抑制劑骨形成促進劑鈣劑氟化物維生素D甲狀旁腺素二膦酸鹽維生素D降鈣素合成類固醇雌激素選擇性雌激素受體調節劑（3）骨質疏松第四十四頁，共一百一十七頁。發病機理：血漿中25（OH）D3水平過高，而不是1,25（OH）2D3水平升高造成。高維生素D血癥病人血中25（OH）D濃度可比正常個體高15倍，但是他們的1,25（OH）2D3水平沒有顯著變化。短期多次大劑量維生素D治療維生素D預防劑量過大誤診佝僂病錯誤治療45（4）維生素D中毒第四十五頁，共一百一十七頁。診斷：維生素D過量病史早期血鈣升高：高于3mmol/LX線檢查：軟組織鈣化46（4）維生素D中毒第四十六頁，共一百一十七頁。二、維生素D檢測指南與方法1、維生素D檢測指南2、維生素D檢測方法第四十七頁，共一百一十七頁。1、維生素D檢測指南（1）維生素D缺乏診斷程序（2）建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（3）維生素D治療和預防策略第四十八頁，共一百一十七頁。內分泌學會2011年6月6日發表《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》全文見《JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism》與《內分泌學》該指南針對不同年齡段、不同疾病背景的維生素D缺乏高危、低危人群，進一步明確了維生素D缺乏的有效評估、飲食補充和藥物預防治療的具體實施方法，指明了維生素D在非血鈣受益上的不確定性，旨在達到維生素D缺乏防治的最優化第四十九頁，共一百一十七頁。內分泌學會2011年6月6日發表《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》指南認為。維生素D缺乏的高危人群（例如西班牙裔、黑種人、妊娠婦女和肥胖個體等）應當接受維生素D水平篩查。外周血血清25-羥基維生素D水平低于20ng/ml者應被診斷為維生素D缺乏。全文見《JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism》與《內分泌學》第五十頁，共一百一十七頁。內分泌學會2011年6月6日發表《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》全文見《JournalofClinicalEndocrinologyandMetabolism》與《內分泌學》指南中寫道，現有的所有證據均表明，兒童和成人預防佝僂病或骨軟化的最低血25-羥維生素D水平應為20ng/ml，但為了增強維生素D對鈣、骨骼以及肌肉代謝的積極影響，血25-羥維生素D的水平應高于30ng/ml。第五十一頁，共一百一十七頁。《指南》推薦的維生素D缺乏的診斷程序：推薦對于有維生素D缺乏危險者，采用可靠方法檢測其血清循環25-羥維生素D[25（OH）D]水平，以評價患者體內的維生素D狀況。維生素D缺乏定義為25（OH）D水平低于20ng/ml（50nmol/L）。不推薦使用血清1，25二羥維生素D[1，25（OH）2D]檢測評價維生素D缺乏，僅在監測特定情況如獲得性和遺傳性維生素D和磷酸鹽代謝紊亂時應用

52（1）維生素D缺乏診斷程序第五十二頁，共一百一十七頁。

25（OH）D是血液循環中維生素D最主要的存在形式，半衰期2~3周，是監測維生素D狀態的最佳指標。

1,25（OH）2D在血液中濃度比25（OH）D低1000倍，半衰期約4小時，且對PTH、鈣、磷的調控非常敏感，1,25（OH）2D不能反映維生素D的儲備水平，血清1,25（OH）2D在維生素D缺乏時經常是正常的甚至升高，因此檢測其濃度對于監測病人的維生素D的狀態沒有幫助。（1）維生素D缺乏診斷程序第五十三頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D第五十四頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D第五十五頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D第五十六頁，共一百一十七頁。建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D年齡/人群最低需求理想需求0~1歲400IU/d1000IU/d1~18歲600IU/d19~50歲1000IU/d1500~2000IU/d50~70歲600IU/d1500IU/d70歲以上800IU/d1500IU/d妊娠/哺乳600IU/d1500IU/d肥胖兒童和成人以及服用抗驚厥藥、糖皮質激素類藥、抗真菌藥如酮康唑和接受AIDS治療的兒童和成人至少需要相同年齡組的2或3倍維生素D量以維持機體的維生素D需求每IU=25ng第五十七頁，共一百一十七頁。建議維生素D缺乏危險人群飲食補充維生素D（2）建議補充維生素D維生素D可耐受維持量的上限：----即除醫生建議外均不可超過的限量年齡組VD上限注：高水平的維生素D可能是糾正維生素D缺乏所必須：0~1歲4000IU/d1~18歲4000IU/d19~成人10000IU/d小于6月1000IU/d6~12月1500IU/d1~3歲2500IU/d4~8歲3000IU/d大于8歲4000IU/d第五十八頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》治療和預防策略（3）治療和預防策略第五十九頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》治療和預防策略（3）治療和預防策略第六十頁，共一百一十七頁。《維生素D缺乏評估、治療和預防的臨床實踐指南》治療和預防策略（3）治療和預防策略第六十一頁，共一百一十七頁。（3）治療和預防策略年齡/人群補充類型治療預防方案維持量0~1歲VD2或vd32000IU/d400~1000IU/d50000IU/周6周1~18歲VD2或VD32000IU/d至少6周600~1000IU/d50000IU/周6周成人VD2或VD36000IU/d1500~2000IU/d50000IU/周8周

建議肥胖、吸收不良綜合征和服用影響VD代謝藥物者，采用同年齡組2~3倍（至少6000~10000IU/d），使血25（OH）D高于30ng/ml,維持劑量為3000~6000IU/d

對于腎外產生1,25（OH）2D的患者，同時監測血清鈣，防高鈣血癥對于原發性甲狀旁腺功能亢進癥合并維生素D缺乏者，同時監測血清鈣第六十二頁，共一百一十七頁。2、維生素D檢測方法（1）體內維D水平含量與意義（2）檢測維生素D的方法第六十三頁，共一百一十七頁。64體內血中25-羥維生素D水平含量與意義缺乏<10ng/ml1-25nmol/L不足10-30ng/ml25-75nmol/L充足30-100ng/ml75-250nmol/L中毒>100ng/ml>250nmol/L據估計，全世界大約10億人未達到維生素D足量濃度的最低限30ng/ml（1）體內維D水平含量與意義第六十四頁，共一百一十七頁。臨床常見方法幾種方法學對比ELISA的兩種產品對比65檢測維生素D的方法（2）檢測維生素D的方法第六十五頁，共一百一十七頁。（1）酶聯免疫法（ELISA）：IDS、BH（2）化學放光免疫法（CLIA）：雅培、索靈、貝克曼等（3）電化學發光法（ECLI）：羅氏661、臨床常見方法（2）檢測維生素D的方法第六十六頁，共一百一十七頁。酶聯免疫法使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。672、幾種方法學對比（2）檢測維生素D的方法第六十七頁，共一百一十七頁。化學發光標記免疫分析：又稱化學發光免疫分析(CLIA),是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常用于標記的化學發光物質有吖啶酯類化合物——acridiniumester(AE),其通過起動發光試劑作用而發光,強烈的直接發光在一秒鐘內完成,為快速的閃爍發光。靈敏度和精確度比酶免法、熒光法高幾個數量級，可以完全替代放射免疫分析、徹底淘汰酶聯免疫分析。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑價格低廉、試劑穩定且有效期（6-18個月）、方法穩定快速、檢測范圍寬、操作簡單自動化程度高等優點。682、幾種方法學對比（2）檢測維生素D的方法第六十八頁，共一百一十七頁。電化學發光技術：在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，用電化學發光劑三聯吡啶釕[Ru(bpy)3]2+標記Ab，通過Ag-Ab反應和磁珠分離技術，根據三聯吡啶釕在電極上發出的光強度對待測的Ag或Ab進行定量/定性。高度敏感，可達pg／ml或pmol水平；特異性強，重復性好，CV＜5％。測定范圍寬，可達7個數量級。試劑穩定，無毒害，無污染，有效期長，達數月至數年。操作簡單，耗時短，易于自動化。在對環保很重視的國家，CLIA成了取代RIA的首選方法。692、幾種方法學對比（2）檢測維生素D的方法第六十九頁，共一百一十七頁。方法靈敏度(檢出限)批內變異系數批間變異系數線性范圍放免法0.1ng/ml3.8~4.1%6.4~9.5%5個數量級酶聯免疫法ng/ml10-13mol/L4.5~6.4%5.64~6.5%2個數量級免疫熒光法10-15mol/L5%5%4個數量級膠體金層析法ng/ml<10%<10%化學發光法pg/ml3.1%3.5~4.6%3~6個數量級電化學發光pg/ml10-12~10-18mol/ml<5%<5%7個數量級時間分辨熒光免疫法pg/ml10-19mol/ml3.8~4.3%4.9~5.8%4~5個數量級70免疫標記檢測技術對比（2）檢測維生素D的方法第七十頁，共一百一十七頁。IDSvsBH：.exl重復性：批內、批間時間：713、ELISA的兩種產品對比對比項目BHIDS線性范圍5~100ug/L9.3～151.2nmol/L批內CV≤10%5.3~6.7%批間CV≤15%4.6~8.7%回收率±20%101%靈敏度5ug/L5nmol/L標本量5ul25ul測量時間超過75min超過3h（2）檢測維生素D的方法第七十一頁，共一百一十七頁。三、博暉維生素D試劑盒介紹博暉公司維生素D3檢測原理維生素D3檢測試驗準備與流程維生素D3檢測試驗步驟與數據分析維生素D3檢測操作規范及注意事項第七十二頁，共一百一十七頁。（1）ELISA簡介（2）維生素D3檢測中競爭法應用原理731、博暉公司維生素D3檢測原理第七十三頁，共一百一十七頁。

定義與原理

ELISA又叫酶聯反應，是一種免疫測定。基礎:抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。（1）酶聯反應簡介第七十四頁，共一百一十七頁。在這種測定方法中有三個必要的試劑：1、固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）2、酶標記的抗原或抗體（標記物）3、酶作用的底物（顯示計）可設計出各種不同類型的檢測方法ELISA檢測法必要試劑（1）酶聯反應簡介第七十五頁，共一百一十七頁。常用ELISA類型夾心法競爭法雙抗體夾心法雙抗原夾心法BH100檢測原理為：雙抗體夾心法25-OH-維生素D3檢測：競爭法（1）酶聯反應簡介第七十六頁，共一百一十七頁。

競爭法：是利用待測抗原和酶標抗原與特異性抗體競爭結合，或待測抗體和酶標抗體與特異性抗原競爭結合而進行測定的一種方法競爭法示意圖（2）維生素D3檢測中競爭法應用原理第七十七頁，共一百一十七頁。25-OH-VD3試劑盒（酶聯免疫法-競爭法），定量測定人體血清中的25羥基維生素D3，校準品、質控品、樣品均被樣品稀釋液稀釋，稀釋后的樣品和辣根標記的25羥基維生素D3抗原在包被了鼠單克隆抗體的微孔中溫育1小時后洗版，然后利用TMB顯色。終止反應后利用酶標儀讀取吸光度值。顏色的強度和25-OH-VD3的濃度成反比。北京博暉公司研發的25-OH-VD3試劑盒原理概述（2）維生素D3檢測中競爭法應用原理第七十八頁，共一百一十七頁。792、維生素D3檢測試驗準備與流程（1）BH公司VD3檢測試劑盒（2）自備材料與設備（3）試劑準備（4）維生素D3檢測實驗流程第七十九頁，共一百一十七頁。25-羥基維生素D3檢測試劑盒包含內容材料規格和裝量制備狀態主要組分包被板96人份/盒48人份/盒鋁鉑袋裝鼠單克隆抗體定標血清1瓶1瓶凍干粉牛血清、25羥基維生素D3質控血清高中值各1瓶高中值各1瓶凍干粉牛血清、25羥基維生素D3樣本稀釋液30ml15ml液體磷酸鹽底物液A7ml4ml液體含過氧化氫底物液B7ml4ml液體含四甲基聯苯胺酶工作液7ml4ml液體辣根酶標記的25羥基維生素D3抗原終止液7ml4ml------2M硫酸洗板液30ml20ml液體吐溫磷酸鹽封口膠2個2個------------注：試劑盒在2-8攝氏度，有效期一年（1）BH公司VD3檢測試劑盒第八十頁，共一百一十七頁。0.5ml及以上的玻璃或聚丙烯微量離心管；

注意：聚苯乙烯試管不適合，不要重復使用試管。高精度加樣器（10ul、和200ul）以及對應槍頭旋渦震蕩器；自動洗板機（可選擇）；酶標儀和數據分析裝置；適用于具有450nm、630nm波長的所有全自動和半自動酶標儀恒溫培養箱或恒溫水浴箱。（2）自備材料與設備第八十一頁，共一百一十七頁。定標血清和質控血清：定標血清和質控血清以凍干品的形式提供，使用前復溶于500ul蒸餾水中。蓋緊瓶蓋，室溫下放置10-15min，期間顛倒搖晃幾次，使其充分溶解，保存于2-8℃一周。工作洗滌液：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍后備用。其他試劑直接使用-所有試劑使用之前應該平衡至室溫并反復顛倒混勻。（3）試劑準備第八十二頁，共一百一十七頁。1-6-試劑與樣本配制與準備；7-13-實驗操作步驟14-15-數據檢測1：復溶干粉2：標準品母液配制3：質控品配制4：樣品配制5：標準品五系列配制6：酶標板排版7：加標準品8：加質控品9：加血清樣品10：加酶（粉色）恒溫孵育-1小時11：洗板12：加底物TMB（淡藍色）恒溫孵育-15分鐘13：加終止液14：上機檢測15：計算結果（4）維生素D3檢測實驗流程第八十三頁，共一百一十七頁。樣品N孔，質控2孔，定標血清5孔6：酶標板排版5：標準品五系列配制10uL樣品血清+400稀釋液（41倍稀釋）4：樣品配制10uL復溶質控血清+400稀釋液（41倍稀釋）3：質控品配制25uL復溶定標血清+1000uL稀釋液。（41倍稀釋）2：標準品母液配制復溶：定標血清、質控高、中值血清干粉+500ul蒸餾水1：復溶干粉（4）維生素D3檢測實驗流程濃度（μg/L）804020041倍稀釋的定標血清（μL）16080400樣本稀釋液（μL）40120160200第八十四頁，共一百一十七頁。7：加標準品按預設孔位，每孔加入50uL（標準品5個梯度定標血清）8：加質控品按預設孔位，每孔加入50uL（已稀釋質控血清）9：加血清樣品按預設孔位，每孔加入50uL已（41倍）稀釋好血清樣品10：加酶各孔加入酶結合物50uL，封口恒溫37度，1小時恒溫孵育37度水浴箱或恒溫箱溫育，1小時11：洗板洗液，洗板5次，拍干12：加底物TMB加入50uL底物A，加入50uL底物B，恒溫孵育恒溫水浴箱10MIN，或恒溫培養箱37度溫育10分鐘13：加終止液加入50uL終止液。14：上機檢測5分鐘內上酶標儀，雙波長檢測15：計算結果建立標準曲線，換算出報告結果（4）維生素D3檢測實驗流程第八十五頁，共一百一十七頁。863、維生素D3檢測試驗步驟與數據分析（1）維生素D3檢測實驗步驟（2）維生素D3檢測數據分析第八十六頁，共一百一十七頁。試劑的復溶或準備見“試劑準備”。1）準備玻璃管或聚丙烯管并做好標記，每個定標血清、質控血清和樣本對應一個管。a．定標血清的稀釋：將對應的試管中加入1000ul樣本稀釋液，然后加入25ul復溶的定標血清（濃度100ug/L），即用樣本稀釋液41倍稀釋，置于旋渦混合器上混合10秒。其余4個定標點80ug/L、40ug/L、20ug/L、0ug/L用40倍稀釋好的100ug/L的定標血清按表1進行稀釋：濃度（ug/L）100804020040倍稀釋的定標血清（ul）-16080400樣本稀釋液（ul）-40120160200（1）檢測試驗操作步驟第八十七頁，共一百一十七頁。質控血清和樣本的稀釋：用樣本稀釋液分別將質控血清和樣本41倍稀釋，例如每個試管中加入400ul的樣本稀釋液，然后分別加入對應編號的10ul質控血清和樣本，置于旋渦混合器上混合10秒。如稀釋的總量不同，可參照表2進行稀釋：稀釋后總量（ul）4106158201025質控血清或樣本（ul）10152025樣本稀釋液（ul）4006008001000（1）檢測試驗操作步驟第八十八頁，共一百一十七頁。2）于相應的酶標板微孔中加入50ul已稀釋好的定標血清、質控血清或樣本，再加入50ul的酶工作液。貼上封口膠，于37℃條件下孵育1小時。（粉色）孵育工具加酶工作液后反應時間加顯色液后反應時間恒溫水浴箱1小時10分鐘恒溫培養箱或鼓風干燥箱1小時15分鐘（1）檢測試驗操作步驟第八十九頁，共一百一十七頁。圖示：加酶后顯色（1）檢測試驗操作步驟第九十頁，共一百一十七頁。3）用工作洗滌液洗板5次，a．手動洗版：迅速將板顛倒倒出孔內物，每孔加入300ul工作洗滌液，b．自動洗版：設置洗板機分配每孔至少300ul工作洗滌液。注：在進入下一步前，于吸水紙上用力拍打倒置的板以除去多余的工作洗滌液（1）檢測試驗操作步驟第九十一頁，共一百一十七頁。洗板機清洗包被板示意圖（1）檢測試驗操作步驟第九十二頁，共一百一十七頁。4）每孔加入50ul的底物液A和50ul的底物液B，貼上封口膠，于37℃下孵育，恒溫水浴箱中反應時間為10分鐘，恒溫培養箱或恒溫鼓風干燥箱中反應時間為15分鐘。圖示：加底物液后顏色變為藍色（1）檢測試驗操作步驟第九十三頁，共一百一十七頁。圖示：酶標儀檢測讀數5）每孔加入50ul終止液。在加入終止液后立即于450nm、630nm波長處讀取吸光度。（1）檢測試驗操作步驟第九十四頁，共一百一十七頁。維生素D3檢測試驗數據案例濃度=LN(OD值/3.3317)/-0.0165中控=39.60482高控=79.63643（2）實驗數據分析第九十五頁，共一百一十七頁。數據記錄和計算方法數據處理軟件人工處理數據人工數據處理步驟和方法1、excel抄錄酶標儀數據2、選中全部數據，插入散點圖（2）實驗數據分析第九十六頁，共一百一十七頁。鼠標點擊曲線—右鍵-選擇添加趨勢線（2）實驗數據分析第九十七頁，共一百一十七頁。第九十八頁，共一百一十七頁。X=LN(Y/5.4619)/-0.4244（2）實驗數據分析第九十九頁，共一百一十七頁。【參考值（參考范圍）】

本公司采用的參考值范圍：19-57.6ug/l（47.5-144nmol/L）每個實驗室應建立自己的參考范圍，本試劑盒檢測結果僅作為輔助診斷手段之一，供臨床醫生參考。（2）實驗數據分析第一百頁，共一百一十七頁。【檢驗結果的計算與解釋】

根據5個定標液數值，繪制標準曲線：以OD值為縱坐標，25-OH-D3濃度為橫坐標，進行指數曲線擬合。R不小于0.990，質控數值波動在正負20%。根據標準曲線和每個樣本檢測的OD值，在標準曲線上找到對應的25-OH-D3濃度值（ug/l或nmmol/L）。1、<19ug/l（47.5nmmol/L），說明25-羥基維生素D3不足，2、>57.6ug/l（144nmmol/L），說明25-羥基維生素D3充足。（2）實驗數據分析第一百零一頁，共一百一十七頁。【檢驗方法的局限性】1、本試劑盒測定范圍為5-100ug/l（12.5-250nmmol/L）。超出試劑盒測定范圍的測定結果是通過校準品曲線外延得出的計算結果，不作為準確定量數據。使用前應先對樣本進行稀釋。診斷結果應結合患者的臨床癥狀和醫師其他的實驗室檢查進行分析。2、加完終止液后應立即在酶標儀450nm、630nm處讀數（2）實驗數據分析第一百零二頁，共一百一十七頁。（1）維生素D3檢測操作規范（2）維生素D3檢測注意事項4、維生素D3檢測操作規范及注意事項第一百零三頁，共一百一十七頁。

實驗前復溫：將試劑及所需數量的微孔反應條和凍在冰箱內的血清標本置室溫平衡（20-25℃）十分鐘以上。儀器準備：洗板機、酶標儀、恒溫設備開啟（37度）洗滌液準備：蒸餾水配制洗滌液1：19稀釋標本：血清或血漿（當天最好）（1）維生素D3檢測操作規范第一百零四頁，共一百一十七頁。實驗中復溫：將試劑及所需數量的微孔反應條置室溫平衡，試劑樣品使用前必須達到室溫（20℃-25℃）后才能使用，未用完的板條應立即用封片封好，避光冷藏保存；復溶：質控品、定標品凍干粉用500ul蒸餾水復溶五濃度標準品配制：五個系列定標品濃度的配制(見說明書)41倍稀釋：41倍血清樣本的稀釋和質控品的稀釋微孔板上排序有序，設好標準位，樣品位，質控位加樣：加稀釋后的樣品，質控品，定標品50uL（1）維生素D3檢測操作規范第一百零五頁，共一百一十七頁。實驗中加酶液：加入酶液50微升，加入酶液時避免吸頭接觸孔壁及孔內樣本，即垂直而不碰避。如有接觸，請更換吸頭；最后并加貼封片孵育：恒溫培養箱或恒溫水浴箱均為1小時洗板：在第一步孵育結束后，小心將封片揭下并棄掉，用洗板機洗滌5次，拍干。或手洗（手洗前先倒掉孔中液體，洗5次，每次放置30秒，每次倒掉液體后需拍干包被板）（1）維生素D3檢測操作規范第一百零六頁，共一百一十七頁。實驗中加顯色液：每孔中加入50微升顯色液A，再每孔加入50微升顯色液B。恒溫培養箱孵育15分鐘或恒溫水浴箱中10分鐘，第二次孵育結束后，小心將封口膠揭開。加入終止液：加液過程中避免碰到小孔邊緣或其中的試劑，盡量避免污染。在5分鐘內上機（酶標儀）檢測，時間太久，會有沉定生成，影響檢測結果。（1）維生素D3檢測操作規范第一百零七頁，共一百一十七頁。一、標本的采取和保存影響因素血清：標本采集管選用，標本采用普通干燥管、普通生化管、速凝生化管，靜脈穿刺法采集靜脈血，不能采用有分離膠的管，因分離膠含某些蛋白質，干擾抗原抗體反應，引起假陽、假陰性結果。（2）維生素D3檢測注意事項第一百零八頁，共一百一十七頁。一、標本的采取和保存影響因素樣品采集后應盡快分離血清，應注意避免溶血。一般說來，標本放置于2-8℃冰箱可保存3天，