實驗三：豚鼠、家兔的基本實驗操作一、實驗目的通過實際操作，掌握豚鼠和家兔的一般操作方法，包括豚鼠的抓取和固定、性別鑒定、腹腔注射、心臟采血、處死、解剖等操作技術。通過實際操作，掌握家兔的抓取和固定、灌胃、耳緣靜脈采血、耳緣靜脈注射、耳中央動脈采血、處死（耳緣靜脈空氣栓塞法注射）、家兔解剖。了解豚鼠和家兔的各臟器解剖學位置。二、實驗材料1、實驗動物：豚鼠1只、新西蘭兔1只2、實驗器械及試劑：鼠籠、鼠板、兔固定器、兔板、灌胃針、頭皮針、5ml注射器、眼科剪、彎頭鑷、導尿管、10%水合氯醛、生理鹽水、手術剪、三、實驗步驟（一）豚鼠1、抓取和固定右手食指和中指輕輕家住豚鼠頸部，拇指和食指抓住左前肢，中指和無名指抓住右前肢，手掌抓住背部，拿起豚鼠，左手托住豚鼠臀部，并固定其后肢。左手拇指和食指抓住豚鼠兩耳后和頸部大部分皮膚。2、性別鑒定將豚鼠抓取后使其腹面朝上，用手按壓豚鼠的會陰部，觀察是否有陰莖出現即可判斷雌雄。雄性豚鼠可觀察到陰莖，雌性豚鼠可觀察到會陰部。3、腹腔注射左手抓取固定豚鼠后使其腹面朝上，右手持針，于豚鼠腹部呈30度沿腹白線兩側進針，刺入腹肌，穿過腹肌進入腹膜腔，當針尖穿過腹肌進入腹膜腔后有落空感。固定針頭，保持針尖不動，回抽，如無回血、腸液和尿液后即可注射生理鹽水4、心臟采血左手抓取固定豚鼠后使其腹面朝上，用右手手指觸摸搏動最劇烈處，通常在比較中間的位置，不要偏向左右，以確定豚鼠心臟的位置。右手持注射器，在波動最強處，以30度角向左上刺入2.5cm左右，邊進針邊回抽針管，可見血液借心臟搏動的力量進入注射器內。此時固定針管及心臟的位置，繼續(xù)采血。采血完成后拔出針頭，用干棉球按壓住針頭的位置。（每次采血量可達4~5ml）。5、處死使用頸椎脫臼法處死，左手拇指和食指按住頭頸部，右手抓住豚鼠的后肢，用力向后上方拉，注意快速有力，減輕動物的痛苦。6、豚鼠解剖將豚鼠放至在解剖版板上，仰臥位放置，充分暴露頸部、胸部和腹部。用濕毛巾潤濕體表。用手術剪沿腹中線將豚鼠腹部和胸部的皮膚剪開，然后用手術剪將腹腔和胸腔剪開，暴露豚鼠腹部的內臟器官，先找到豚鼠的結腸，沿著結腸帶尋找盲腸。仔細觀察豚鼠腹腔和胸腔的各內臟器官。內部臟器觀察：胸腔1）肺：共七葉，右肺四葉，左肺三葉；2）心臟：呈圓錐狀，位于近胸骨端，心尖位于第六肋間；3）胸腺：在頸部皮下氣管兩側，位于下頜骨角到胸腔入口中間，有2個光亮、淡黃色、細長呈橢圓形、充分分葉的腺體，附著不牢固。腹腔1）肝：緊鄰隔下，呈暗紅色，分四個主葉和四個小葉，可見一光亮的膽囊附著于肝下；2）胃：胃壁非常薄。分兩部，賁門部和幽門部，胃容量約20-30ml；3）腸：分小腸和大腸。小腸包括回腸、空腸和十二指腸，大腸包括結腸、盲腸和直腸。盲腸特別發(fā)達，占腹腔容積的1/3,占體重的15%；4）脾：脾斜臥在胃的左側，呈深紅色，長條扁平狀；5）胰：一端緊貼脾臟，一端鄰近十二指腸，不規(guī)則狀且呈粉紅色；6）腎：為黃豆大小，右腎比左腎位置稍高，腎臟前方有腎上腺（米粒大小），腎上腺較大；7）卵巢和子宮：在腎臟前方見肉色帶有顆粒樣突起的腺體為卵巢，兩側卵巢下方各連有一條輸卵管，輸卵管連接于下方子宮，兩側子宮結合形成“V”字形，經陰道開口于體外。（二）新西蘭兔1、抓取和固定用右手把兩耳輕輕地壓于手心內，抓住頸背部被毛與皮膚，左手托住其臀部，將其大部分重量落左手手掌上。用兔盒將家兔的頭部及四肢固定，使其頭部無法向后縮即為固定成功。2、耳緣靜脈米血用兔盒固定家兔后，先拔去耳緣靜脈注射部位的被毛，用手指輕彈兔耳使靜脈充盈，或者用酒精棉擦拭耳緣靜脈注射區(qū)使靜脈充盈后，用左手拇指和中指捏住兔的耳尖部，食指墊在兔耳注射處的下面，右手持靜脈取血針頭在耳緣靜脈末端刺破血管，待血液漏出或將針頭逆血流方向刺入耳緣靜脈取血，取血完畢用棉球壓迫止血。一次最多可采5-10ml。3、耳中央動脈采血兔耳中央有一條較粗、顏色較鮮紅的中央動脈，左手固定兔耳，右手持注射器，在中央動脈的末端，沿著動脈平行地向心方向刺入，即可見到動脈血進入針筒，取血完畢后注意止血。此法一次抽血可達15ml。4、灌胃給藥灌胃需要兩個人共同完成，一人將兔及兔固定器直立，一人插管。將導尿管從兔犬齒缺失處緩慢沿上顎插入食道?；爻獒樄?，判斷導尿管確實插在食管內以后，取注射器接在導尿管上，將生理鹽水推入。一般量可達5-20ml/kg。5、麻醉即耳緣靜脈注射。以耳緣靜脈采血的方式在耳緣靜脈處進針，回抽針管后若有回血，則可將適量麻醉劑（按10%水合氯醛4ml/kg的用量）。等待幾分鐘后觀察家兔反應。若兔全身癱軟幾乎不動為麻醉成功。6、處死（空氣栓塞法）以耳緣靜脈采血的方式在耳緣靜脈處進針，向耳緣靜脈中注入一定量的空氣（5ml*2即可），使之發(fā)生空氣栓塞而致死。注射完空氣后立刻將兔從固定器中取出，觀察其體征，包括心跳節(jié)律。呼吸頻率、鼻孔煽動、口唇黏膜顏色、瞳孔大小及身體其他部位體征，記錄從注射到死亡的時間。7、家兔解剖將通過空氣栓塞法處死后的家兔放至在兔板上，仰臥位放置，充分暴露頸部、胸部和腹部。用水將家兔的胸腹部的被毛充分潤濕。用手術剪沿腹中線將家兔腹部的皮膚剪開，然后用手術剪將腹腔打開，仔細觀察家兔腹腔的各內臟器官。再打開胸腔，注意不要從正中打開胸腔，以免影響后續(xù)觀察。內部臟器觀察：胸腔：胸腔中間有縱膈將胸腔分為左右兩部，互不相通。肺被肋胸膜隔開，心臟又被心包膜隔開。1）肺：共七葉，右肺四葉，左肺三葉。2）心臟：呈圓錐狀，位于近胸骨端，由左心房、左心室、右心房、右心室組成。腹腔：1）肝：緊鄰隔下，呈暗紅色，可見一墨綠色的膽囊附著于肝下。2）胃：單室胃，胃底特別大。分為前小彎和后大彎3）腸：分小腸和大腸，其總長度為體長的10倍。盲腸非常大，長約0.5米，容積占腹腔的1/3以上，與所有家畜相比兔的盲腸比例最大。在回腸和盲腸相接處膨大呈一個后壁，呈圓形，為圓小囊。4）脾：脾斜臥在胃的左側，呈深紅色，長條扁平狀。5）胰：一端緊貼脾臟，一端鄰近十二指腸，為分布零散而不規(guī)則狀且呈粉紅色，與脂肪相似但顏色不同。6）腎：為扁豆大小，右腎比左腎位置稍高，腎臟前方有腎上腺（米粒大?。?，每腎內側各有一根輸尿管，開口于膀胱背側。7）雌兔有兩個完全分離的子宮，左右子宮部分子宮體和子宮角，子宮頸分別開口于單一的陰道。四、實驗結果及注意事項（一）豚鼠豚鼠性情溫順，膽小怕驚，對外界的環(huán)境刺激敏感，注意不要使動物受驚。抓時不能太粗野，更不能用力抓腰腹，否則容易造成肝破裂而引起死亡。解剖時可發(fā)現，豚鼠的腸道長度為體長的10倍，盲腸特別發(fā)達，占腹腔容積的1/3。心臟取血：（1）很難精確定位在3-4肋間，主要靠指尖觸摸心臟搏動來確定位置，需區(qū)分心臟搏動和呼吸的起伏，前面較快且范圍小，后者較慢，可根據鼻翼煽動節(jié)律來辨別；（2）確定穿刺位置，針頭突破胸壁后，應一邊回抽一邊進針，不可進一點針再回抽一次，防止兩次回抽間的進針已穿透心臟，而采不到血；（3）進針時避免反復上下，避免損傷肺臟；（4）豚鼠的最大安全采血量為5ml，最小致死采血量為10ml，采血時應注意采血量，避免造成豚鼠死亡。（二）家兔家兔比較馴服，不咬人，但爪尖利，不正確的抓取容易被其抓傷。抓取時不要抓其兩耳，也不要托拉四肢或提握腰部。根據實驗需要進行固定。兔的盲腸比例亦大，回腸和盲腸相接處膨大形成一個厚壁的圓囊，稱為圓小囊，實質為淋巴球囊，為兔所特有。給兔灌胃時要注意：（1）兔的反應，插入氣管的話兔會劇烈掙扎和呼吸困難，也可以將導尿管的外端插入水中，如有氣泡冒出，表示插在氣管內，應拔出重插。要從兔的犬齒缺失處進針，以免兔將導尿管咬爛；向外拔導尿管的時候注意用手指捏緊外端再拔出。耳緣靜脈采血是給兔采血的最常用的方法，常多次反復使用，因此要注意保護耳緣靜脈，防止發(fā)生栓塞。幾個人輪流練習時要注意從遠端向近端逐漸推進。兔的處死。用空氣栓塞法將兔處死后要立刻從籠中取出，放置在地面或者水槽中，因為可能會有抽搐、尿失禁等反應，本實驗中從注射至死亡約4分鐘。圓小囊：色較黃、壁厚，具有發(fā)達的肌肉組織，內壁呈六角形蜂窩狀，囊壁內富含淋巴濾泡，其粘膜不斷分泌堿性液體，可以中和盲腸中微生物分解纖維素所產生的各種有機酸，有利于消化吸收功能。實驗四：小鼠無菌剖腹取胎、近交系小鼠皮膚移植及

小鼠卵巢和睪丸切除手術技巧操作一、實驗目的1、小鼠的睪丸及卵巢切除是目前實驗動物手術操作中最基礎的技巧，要求初步掌握手術操作的基本流程、術中的細節(jié)及了解術后護理；2、了解皮膚移植實驗是一種用于鑒定近交系動物組織相容性基因是否一致的簡單而可靠的方法，掌握近交系小鼠檢測中常用的尾-背植皮和尾-尾植皮兩種操作方法，初步掌握和分析植皮的結果與現象；3、通過實際操作，了解通過剖腹取胎術得到幼鼠的基本原理、操作和用途；二、實驗材料1、實驗動物：孕鼠、KM小鼠（雌雄各一只）；2、實驗器械與試劑：鼠籠、鼠板、5ml注射器、眼科剪、彎頭鑷、10%水合氯醛、手術剪、干棉球、酒精棉球；三、實驗內容1、小鼠的睪丸切除手術小鼠常規(guī)麻醉，采用仰臥位，置于固定臺上，輕壓腹腔將睪丸推回陰囊，沿白色的陰囊壁正中線做1cm的切口，在中線左側的隱囊包膜做5mm切口，向左側擠推睪丸，找出輸精管，用眼科鑷夾住，用止血鉗分離周邊脂肪組織，在睪丸近端1T.5cm處，穿兩根單股手術縫線，相距1-2mm分別打結，結扎輸精管，并在兩個結中間剪斷輸精管。對側重復同樣的操作。隨后縫合陰囊壁切口。2、小鼠卵巢切除手術（觀摩同組其他同學）小鼠卵巢切除術多采用背部切口。小鼠常規(guī)麻醉，采用俯臥或側臥位，置于固定臺上，以肋下0.5cm，脊柱處1cm為中心剪除或拔出長毛，常規(guī)消毒，切口約0.5cm，切開皮膚，一邊擴張一邊鈍性分離，用眼科鑷夾住創(chuàng)口看到的肌層，在離脊柱肋下剪開腰肌長約0.5cm切口，立即可見兩側包繞卵巢的脂肪組織及緊密相連的子宮角，用彎鑷帶環(huán)鑷輕輕夾住脂肪組織將其拉出創(chuàng)口，在子宮角上部及下部的輸卵管的部位做兩個結扎，結扎后用環(huán)形鑷或眼科剪切斷子宮角，將卵巢摘除，檢查有無出血，把脂肪組織推回腹腔內，將腹膜與肌層一起縫合，縫合皮膚。背部切口創(chuàng)傷小，直觀，視野清楚，易操作，不需牽拉其它臟器，手術時間短。3、近交系小鼠皮膚移植實驗與同組同學合作，選擇尾-尾移植的方法。麻醉動物，用75%的酒精棉球，消毒動物的尾部以及手術者的雙手，隨后用左手食指與中指夾住小鼠尾根，拇指與無名指夾緊鼠尾的尖部。右手用手術刀在尾皮上割一塊長約0.75cm長的尾皮，刀口深度應露出白色的健，但又不割壞血管。這樣即提供了一塊供體植皮，又得到一處受體植床。取下皮片后，將皮片手術刀從右手方向轉到左手方向，這樣皮片也就旋轉了180度，使皮片上的毛與尾部的毛長向相反，然后用眼科鑷將植皮鑲嵌到異體的尾部植床上，用濾紙輕輕地來回按幾下皮片，使其盡可能緊貼在上面，本次實驗由于時間限制，不進行結果觀察。4、孕鼠剖腹取胎實驗1）以頸椎脫臼法將孕鼠處死后，迅速以仰臥位固定小鼠于動物固定板上，暴露腹部手術部位進行酒精消毒；（注意處死動作要快，勿用力按壓腹部，防止胎兒受損。）2）用剪刀沿腹中線剪開腹部皮膚、腹肌和腹膜，打開腹腔可以看見串珠狀子宮，用止血鉗分別夾住子宮頸部和兩側卵巢韌帶，剪斷后取出子宮。剪開子宮，打開羊膜，剝除胎盤。3）用棉球擦拭幼鼠，將新生鼠放在手心快速震動促使新生鼠開始呼吸，待新生鼠呼吸，血循環(huán)正常后，以止血鉗扎斷臍帶。4）本組孕鼠經剖腹產手術得到14只小鼠。由于孕周未到，均未存活。四、實驗結果及注意事項1、近交系小鼠常用的皮膚移植試驗皮膚移植實驗是用于鑒定近交系動物組織相容性基因是否一致的簡單而可靠的方法。（1）尾-背移植：將小鼠尾部皮膚移植到同品系的異體小鼠的背部，通過觀察移植皮片和背部其他區(qū)域的毛發(fā)稀疏和皮膚光澤異同來鑒定二者的組織相容性。如果組織相容性好，植皮色澤與周圍一致，沒有充血或炎癥，移植皮片毛少而光澤。若組織相容性基因不純合，尾皮在術后1?3周內被排斥，植皮脫落，背部留下一塊傷痕。另外，供體皮片應略大于受體創(chuàng)面以充分吻合，以免因皮片邊緣缺血壞死而導致愈合后創(chuàng)面周邊皮膚不連續(xù)。（2）尾-尾移植：在一組近交系內，將小鼠尾部的皮膚輪換移植到另一個小鼠的尾部。此方法既可以同時做幾只，省時間；且有自體移植，還可以用于鑒定植皮的脫落是排斥反應還是手術失敗造成的。（3）自體尾-尾移植：可以鑒定植皮的脫落是否是手術失敗而造成。移植時應將皮片旋轉180°，以利于術后通過毛發(fā)生長的方向觀察植皮是否存活。皮膚移植結果的觀察及判斷（1）皮片在1-3周內蒼白、干癟、脫落，則為手術失敗。對照自體移植，手術失敗率不得大于10%；（2）皮片在2-3周內發(fā)炎、水腫、壞死、結痂直直脫落，則為急性排斥。遺傳污染通常引起急性排斥。（3）皮片在3-9周內逆毛逐漸脫落，直至無毛；或者因排斥留下凹陷瘢痕，都為慢性排斥。遺傳突變通常引起慢性排斥。皮膚移植實驗是一種驗證所培育的群體是否達到近交系，為進一步研究分析動物間的血緣關系和遺傳距離提供可靠的依據。小鼠卵巢切除術的切口在背部，原因在于其解剖特點。背部切口創(chuàng)傷小、直觀視野清楚、易操作，不需牽拉其他臟器，手術時間短。小鼠無菌剖腹產的實驗原理：由于胎盤屏障的作用，在一般情況下，因體內的正常微生物菌群及大多數病原微生物不能通過胎盤感染胎仔，因此胎仔不論體表還是體內都處于無菌狀態(tài)，通過無菌剖腹獲取胎鼠由無菌母鼠代乳，并維持仔鼠于無菌隔離器中，這是獲得無菌動物的唯一途徑。但由于條件所限，本實驗僅用于熟悉操作，對無菌操作無嚴格要求，實驗在實驗臺上完成即可。小鼠無菌剖腹取胎的成功率取決于時機（即將臨場為宜）及操作的技術，要注意速度快。實驗五大鼠陰道涂片、肺水腫模型及其它示教實驗一、實驗目的通過實際操作，掌握大鼠陰道涂片的制作方法及性周期的觀察；強化實驗動物疾病模型的基本概念，掌握誘發(fā)性急性肺水腫動物模型的建立方法，觀察肺臟的病理變化；通過試教初步了解裸鼠腫瘤接種的流程及操作技巧，C57BL/6小鼠、比格犬的年齡判斷、前肢背橈外側靜脈和后肢側皮下小靜脈的采血操作。二、實驗材料實驗動物：SD大鼠，裸鼠，C57BL/6小鼠，比格犬；實驗材料：毛細滴管、載玻片、酒精燈、生理鹽水、吉姆薩染色液、846合劑、手術剪、手術鑷、2ml注射器、5ml注射器、干棉球、酒精棉球、繃帶、橡皮綁帶、顯微鏡。三、實驗內容大鼠陰道涂片及性周期觀察大鼠急性肺水腫模型的建立裸鼠腫瘤接種的試教實驗比格犬年齡判斷比格犬前肢背橈外側靜脈、后肢側皮下小靜脈采血C57小鼠的觀察四、實驗方法與步驟大鼠陰道涂片及性周期觀察哺乳類動物在性成熟后出現動情周期變化，其中嚙齒類動物在動情周期不同階段引導粘膜發(fā)生比較典型的變化。因此可將陰道分泌物涂片染色，根據圖片的細胞學改變來鑒別性周期的不同階段。左手抓住大鼠，食指和中指卡緊大鼠頸部，無名指與小拇指握住胸部，小指壓住腹部，右手拉住尾巴稍用力向后拉，以充分暴露雌鼠陰道。用滴管吸生理鹽水1ml，然后插入大鼠陰道深部反復沖洗4-5次，吸出洗液滴一滴涂于載玻片上，用酒精燈將片子烘干。用吉姆薩染液染色30min，流水沖洗，在顯微鏡下觀察。實驗中觀察到聚集的有核細胞，無核細胞均有，且細胞量少，估計該大鼠處于發(fā)情間期。大鼠急性肺水腫模型的建立稱取大鼠重量為177g。左手抓住大鼠，食指和中指卡緊大鼠頸部，無名指與小拇指握住胸部，小指壓住腹部，右手拉住尾巴稍用力向后拉，腹腔注射2mL8%氯化銨溶液，觀察大鼠一般情況與呼吸狀況，存活時間。實驗中見6分鐘后大鼠出現輕微抽搐，15分鐘后全身僵直，伴有較為劇烈的抽搐，持續(xù)1-2分鐘后抽搐停止，保持全身僵直的狀態(tài)，但未死亡。大鼠死亡后進行解剖，打開胸腔，找到兩側肺組織，剪斷氣管，取出雙肺。實驗中觀察到雙肺腫脹但程度不是非常明顯，顏色變深，布滿暗紅色紋理，嚴重紅細胞浸潤。稱重為1.4g，肺重量系數為0.8。裸鼠腫瘤接種的試教實驗采用細胞懸液接種法。注射器吸取適量細胞懸液注射與裸鼠皮下，部位看實驗要求而定，一般在腋下或背部皮膚，每個接種部位注射0.1-0.2mL。將培養(yǎng)的細胞收集跳刀適宜濃度重懸于不含血清的培養(yǎng)液或PBS中，直接注射即可。裸小鼠較脆弱，注意操作溫柔，切勿用力，避免裸鼠死亡。比格犬年齡判斷及前、后肢采血實驗判斷狗的年齡，主要依靠狗牙齒的磨損和脫落情況。狗出生后十幾天即生出乳齒，兩個月后開始由門齒、犬齒、臼齒逐漸換為恒齒，六個月門齒長齊，8-10個月恒齒換齊，但需要1歲半以后牙齒才能生長堅實，年齡越大，牙齒磨損更嚴重，且顏色變深。實驗所用比格犬四顆門齒基本長齊，犬牙較尖較細，估計年齡為接近六月齡。比格犬前肢背橈外側靜脈、后肢側皮下小靜脈采血一人抓比格犬頸部皮膚固定頭部，另一人吸取狗麻醉劑846合劑，注射在其臀部。待狗較為萎靡時，用紗布固定其嘴部，紗布將比格犬嘴部緊密纏繞兩圈后系于而后頭部，以免被咬傷，因為注射了麻醉劑，為防止比格犬窒息，綁嘴部時與平時所用方法不同，紗布要經過口內，拉出舌頭。比格犬性情溫順，若對比較狂躁、性情不溫順的犬必須固定嘴部。前肢背橈外側靜脈位于前腳爪的上方外側正前位，用橡皮綁帶綁在比格犬前置上部，找到內側皮下靜脈，右手用6號或7號針頭迅速刺穿靜脈，左手放松將針固定，以適當速度抽血，以無氣泡為宜，抽血失敗時從遠心端向近心端扎針。后肢外側小靜脈位于后肢脛部下三分之一的外側淺表皮下，由前側方向后行走，將膠皮帶綁在狗股部，將抽血部位毛剪去，酒精消毒皮膚，找到靜脈采血即可。一只狗一般采10-20ml血并不困難。C57BL/6小鼠的觀察四、實驗結果及注意事項大鼠性周期觀察大鼠性周期為4~5天，由于大鼠有晝伏夜行的習性，一般在下午不能看到大鼠的發(fā)情期。本大鼠處于發(fā)情間期：顯微鏡下看到大鼠發(fā)情間期的部分改變:有核細胞和少量上皮細胞，也看到少量白細胞。大鼠的陰栓一般在24小時后脫落。所以觀察期間籠具必須保持整潔，不能放置刨木花。看到陰栓說明交配成功，受孕率為70?80%。大鼠性周期陰道脫落細胞變化情況如下表所示階段夏情前堪發(fā)情期探情后準發(fā)情問期第一階段第二階段陰遒脫落國院變化大崖圓形有核上皮鯽胞，少量角化上皮如胞大量角化上皮瓣胞｛無核)，無白細少量角化無.核上點細胞并褒集成塊角化上皮細胞周圍存在許多白堀胞白幻臆.有核、無核上虎細胞均有,但細胞星少，昆有黏液大鼠急性肺水腫模型的建立2ml0.8%的氯化銨劑量腹腔注射后，實驗中見6分鐘后大鼠出現輕微抽搐，15分鐘后