現(xiàn)代微生物遺傳學第三章質粒詳解演示文稿現(xiàn)在是1頁\一共有27頁\編輯于星期二優(yōu)選現(xiàn)代微生物遺傳學第三章質?，F(xiàn)在是2頁\一共有27頁\編輯于星期二一、質粒的發(fā)現(xiàn)F質粒(1946年)，第一個被發(fā)現(xiàn)的質粒20世紀50-70年代：抗性質粒的大量研究，以及其他質粒的發(fā)現(xiàn)20世紀70年代后，質粒廣泛應用于遺傳工程和分子生物學研究中。現(xiàn)在是3頁\一共有27頁\編輯于星期二二、質粒的命名原則最初發(fā)現(xiàn)的質粒由研究者根據(jù)表型、大小等特征自行命名。(F因子、R質粒、Col質粒等)1976年Novick提出了質粒命名原則：質粒名稱一般由三個英文字母及編號組成；第一個字母一律小寫p表示（plasmid）后兩個字母要大寫，可以采用發(fā)現(xiàn)者人名、實驗室名稱、表型性狀或其他特征的英文縮寫。編號為阿拉伯數(shù)字，用于區(qū)分同一類型的不同質粒。(pUC18,pUC19等)現(xiàn)在是4頁\一共有27頁\編輯于星期二第二節(jié)質粒編碼的遺傳表型大多數(shù)質粒均控制著宿主細胞的一種或幾種特殊性狀，具有一定的表型，質粒可依據(jù)其表型不同可劃分為以下幾類：1.致育質粒2.抗藥性質粒組成：轉移區(qū)和抗性決定子抗藥的機制：改變抗生素作用的靶點；修飾抗生素；組織抗生素進入；產(chǎn)生一種酶能代替宿主細胞中被抗生素作用的靶點。現(xiàn)在是5頁\一共有27頁\編輯于星期二3.產(chǎn)生抗生素的質粒細菌素：細菌產(chǎn)生的一般只能抑制或殺死種內不同亞種或菌株中敏感細菌的特殊多肽類代謝產(chǎn)物。Col質粒：10種，有非接合型和接合型之分。4.產(chǎn)生毒性的質粒(BT)5.降解質粒：假單胞菌屬是一類能廣泛利用有機化合物進行生長的細菌。其體內含有大量的降解質粒。6.致病性質粒：根癌土壤農(nóng)桿菌的Ti質粒；以及破傷風梭菌、肉毒梭菌和大腸桿菌等都存在致病性質?！，F(xiàn)在是6頁\一共有27頁\編輯于星期二7.共生固氮質粒根瘤菌普遍喊有該類質粒。包括共生質粒和非共生質粒，非共生質粒對共生作用可有正或負的調節(jié)作用。8.隱蔽質粒(crypticplasmid)酵母的2m質粒（p171）長為2m的6kb的環(huán)狀雙鏈DNA分子位于酵母細胞核內，50~100拷貝只攜帶與復制和重組有關的4個基因，無遺傳表型質粒上有兩個600bp長的IR，被一個2.7kb區(qū)域和一個2.3kb小區(qū)域所間隔兩個IR上都有一個專一重組位點(FRT)，經(jīng)過重組，可使質?；プ儺悩嫵葾型和B型?，F(xiàn)在是7頁\一共有27頁\編輯于星期二第三節(jié)質粒的檢測檢測質粒的方法主要根據(jù)質粒的（遺傳學特性）和（分子結構特性）。遺傳特性：獨特的表型、轉移、人為消除等。分子結構：cccDNA和染色體相比對理化因子有更強的抗性?，F(xiàn)在是8頁\一共有27頁\編輯于星期二一、質粒消除（理化因子和生物學方法）理化因子消除法消除劑：吖啶類，EB，某些抗生素，高溫，UV等如何判斷某一遺傳性狀的喪失是質粒消除的結果還是染色體基因突變的結果呢？回復突變情況突變率理化因子消除質粒的作用機制：對質粒本身的復制和分離產(chǎn)生抑制作用，在生長中被淘汰選擇性抑制帶有質粒的菌的生長?，F(xiàn)在是9頁\一共有27頁\編輯于星期二2.原生質體消除法使待消除質粒的菌株在一定條件下形成原生質體，在再生后生長的菌株中可出現(xiàn)高頻率質粒消除菌?，F(xiàn)在是10頁\一共有27頁\編輯于星期二二、遺傳轉移將質粒導入已經(jīng)消除了該質粒的原宿主細胞，比較導入前后表型性狀的差異或恢復程度。三、分子雜交在初步確定某菌株可能含有質粒的情況下，利用已知表型性狀的基因片段作探針進行分子雜交，來檢測其菌株是否含有該種質?！，F(xiàn)在是11頁\一共有27頁\編輯于星期二四、質粒的分離、檢測與純化質粒分離方法：堿變性法菌體的培養(yǎng)和收集溶菌堿變性處理離心分離有時為了快速提取質粒DNA，可以在提取液堿變性后，用pH4.8的醋酸鈉高鹽緩沖液調節(jié)pH到中性，這時染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結構，而即使變性的質?？梢曰謴偷皆瓉淼臉嬓?，再通過離心，這樣可以縮短提取質粒的時間。現(xiàn)在是12頁\一共有27頁\編輯于星期二純化和檢測方法瓊脂糖凝膠電泳(質粒3種構型泳動速度不同，瓊脂糖濃度，EB染色，分子量的判斷)氯化銫-EB密度梯度離心電鏡觀察現(xiàn)在是13頁\一共有27頁\編輯于星期二第四節(jié)質粒的復制與調節(jié)一、質粒的大小和拷貝數(shù)1.大小測定表示方式：MD或kb，1MD的雙鏈DNA≈1.65kb。測定方法：電泳、電鏡、測序。大小范圍：1~200kb，個別800~1000。2.質粒的拷貝數(shù)嚴緊型質粒(stringentplasmid)或低拷貝質粒；松弛型質粒(relaxedplasmid)或高拷貝質粒。（氯霉素可抑制細胞分離，終止染色體復制，但松弛型質粒可持續(xù)復制，其拷貝數(shù)可達到1000~3000）。現(xiàn)在是14頁\一共有27頁\編輯于星期二二、質粒的復制1.質粒復制的方式(P120)質粒的復制起點稱為oriV,大腸桿菌為oriC。復制主要通過型復制和滾環(huán)復制之一進行。其中以型復制為主（包括單向和雙向）。質粒只編碼一種或少數(shù)幾種與復制有關的蛋白質，其他復制蛋白都來自宿主。現(xiàn)在是15頁\一共有27頁\編輯于星期二2.復制起點區(qū)oriV的功能和pBR322質粒復制起點區(qū)oriV功能與質粒載體的構建、寄主范圍pBR322質粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白對質粒的復制負調控）區(qū)；pSC101的tetr；Tn3的ampr。屬中等拷貝質粒，10~30個/細胞pUC類：高拷貝質粒（100~300個/細胞），也是pMB1的ori，但是沒有rop?，F(xiàn)在是16頁\一共有27頁\編輯于星期二質粒的寄主范圍和質粒的拷貝數(shù)均決定于質粒的ori區(qū)域?，F(xiàn)在是17頁\一共有27頁\編輯于星期二三、質粒復制的調控質粒的調控一般采用直接或間接的負調控機制。負調控因子可是蛋白質、RNA或DNA重復序列。調控類型可分兩類：抑制物-靶位調控(inhibitor-targetregulation)重復子-競爭結合調控(iteron-bindingregulation)現(xiàn)在是18頁\一共有27頁\編輯于星期二1.抑制物-靶位調控依賴一小段反向轉錄的RNA作為抑制物，通過它與質粒DNA復制引物或編碼Rep蛋白（復制蛋白）的mRNA的互補結合以阻止質粒復制的起始。(1)ColE1質粒復制調控（P122圖5-7）現(xiàn)在是19頁\一共有27頁\編輯于星期二抑制物（負調控因子）：反義RNA、Rop蛋白靶位：質粒復制的前提引物機制：反義RNA和引物RNA互補結合，阻止其發(fā)揮作用；Rop蛋白具有強化反義RNA和引物RNA結合的作用。是抑制物對靶位的直接調控模型。現(xiàn)在是20頁\一共有27頁\編輯于星期二(2)R1質粒的復制調控抑制物通過抑制Rep蛋白的形成而阻止了該蛋白對oriV的激活作用。是間接調控模型。抑制物：CopB蛋白：是PrepA啟動子的阻遏蛋白；copA基因轉錄產(chǎn)物RNA：Rep蛋白mRNA互補，抑制其合成靶位：Rep蛋白的合成現(xiàn)在是21頁\一共有27頁\編輯于星期二2.重復子-競爭結合調控采用該機制進行調控的質粒為重復子質粒。在復制起始位點ori和復制基因rep附近存在著多個長度為17~22bp的DNA短片段。這些短片段叫重復子。重復子能與復制必需的Rep蛋白競爭性結合，從而抑制了質粒的復制和拷貝數(shù)的增加。pSC101、F、P1等都屬于重復子質?！，F(xiàn)在是22頁\一共有27頁\編輯于星期二重復子質粒復制調控機制（兩種,p124-125）(1)轉錄自體調控：RepA蛋白通過與自身啟動子區(qū)的某些序列（如pSC101中的反向重復序列IR1和IR2）的結合而抑制自身的合成，這種方式叫做轉錄自體調控。現(xiàn)在是23頁\一共有27頁\編輯于星期二(2)偶聯(lián)模型調控：由于重復子序列間的相互作用使兩個質粒偶聯(lián)在一起，從而抑制了質粒復制的起始，該方式即為偶聯(lián)模型。質粒濃度低時，RepA蛋白只與一個質粒結合；質粒濃度高時，RepA蛋白通過與重復子序列的結合使兩個質粒聯(lián)結在一起，阻止質粒的復制。現(xiàn)在是24頁\一共有27頁\編輯于星期二F質粒的復制調控F質粒的復制區(qū)也含有19~22bp的重復序列，repE基因編碼的RepE蛋白也是質粒復制所必需的。RepE蛋白是一種自體調控蛋白，可能也是通過與自身啟動子結合對自身濃度進行調控。RepE蛋白通過與重復子序列結合抑制質粒復制?，F(xiàn)在是25頁\一共有27頁\編輯于星期二四、質粒之間的不相容性不相容性(incompatibility):親緣關系相近的兩種質粒，在非選擇性條件下不能穩(wěn)定存在于同一個細胞中，該種特性為質粒的不相容性。與質粒的復制起始的控制密切相關。同種質粒的衍生物總是不相容的；不同質粒的衍生物可能相容，也可能不相容。不相容群(incompatibilitygroup)：不能在同一個細胞中同時