第五章低壓液相層析（色譜）技術(shù)慢中等快色譜分離Temporalcourse淋洗液液相色譜法：以液體為流動(dòng)相的色譜法稱～。經(jīng)典液相色譜：固定相顆粒較大且不均勻常壓下輸送流動(dòng)相柱效較低分析周期長(zhǎng)現(xiàn)代液相色譜：固定相顆粒小且均勻高壓下輸送流動(dòng)相柱效較高分析周期短1、國(guó)產(chǎn)低壓液相色譜系統(tǒng)國(guó)產(chǎn)常壓液相色譜系統(tǒng)的組成層析柱恒流泵核酸蛋白檢測(cè)儀自動(dòng)分部收集器記錄儀一、低壓液相色譜系統(tǒng)

層析柱（a）自制簡(jiǎn)易層祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龍網(wǎng)）；（b）普通商品柱；（c）雙底板層析柱（1.洗脫液進(jìn)出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒溫水進(jìn)口；5．恒溫水出口；6．可調(diào)節(jié)的塞子）層析柱：填料的充填恒流泵：提供穩(wěn)定的液流紫外檢測(cè)儀：信號(hào)檢測(cè)部分收集器：樣品的分部收集記錄儀：記錄信號(hào)

層析系統(tǒng)連接示意圖

1．密封橡皮塞；2．恒壓管，3，恒壓瓶；4，層析流出液，5．可調(diào)蜾旋夾；6.自動(dòng)收集器；7.核酸一蛋白質(zhì)檢測(cè)儀2、GEAKTAsystemsAKTAprimeAKTAexplorerAKTAFPLC3、Bioradsystems二、柱層析法的一般技術(shù)層析柱層析柱通常是玻璃的。總的說來，長(zhǎng)柱分辨好。但大量物質(zhì)的處理則用粗的柱比較適宜。

凝膠的前處理的方法溶脹：稱取適量凝膠干粉，用約10倍蒸餾水浸泡24小時(shí)以上，待凝膠充分溶脹后，傾去上層懸浮物及蒸餾水。堿洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半個(gè)小時(shí)，然后用蒸餾水洗至中性。平衡：用起始緩沖液浸泡凝膠，直至凝膠液pH與起始緩沖液相同。

在用溶劑平衡時(shí)，先使材料沉淀，用傾瀉法除去懸浮的細(xì)顆粒，否則由于細(xì)顆粒的堵塞，溶劑的流速將顯著降低。二、裝柱裝柱是最關(guān)鍵的一步。重力沉降法裝柱陸續(xù)不斷地添加糊狀物，使其形成的膠粒床面上有膠粒連續(xù)均勻地沉降，直至裝柱物完全沉降至適當(dāng)?shù)闹搀w積為止。柱的表面始終要保持著一層溶劑(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分絕對(duì)不能“流干”。三、平衡層析柱正式使用前，必須平衡至所需的pH和離子強(qiáng)度，一般用起始緩沖液在恒定壓力下走柱，其洗脫體積相當(dāng)于3-5倍床體積，使交換劑充分平衡，柱床穩(wěn)定。裝好的柱必須均勻，無紋路，不含氣泡，柱頂交換劑沉積表面十分平坦。檢查柱是否均勻，可用藍(lán)色葡聚糖2000，在恒壓下走柱，如色帶均勻下降，說明柱是均勻的，可以使用，否則應(yīng)重新裝柱四、加樣量和加樣體積加樣量的多少和加樣體積大小是影響分離效果的關(guān)鍵因素，加樣量越少和加樣體積越小，則分離效果越好。它主要取決于層析目的(分析性柱層析或制備性柱層析)，也與樣品中種類多少，相對(duì)濃度及親和力有關(guān)。對(duì)于分析性柱層析，加樣量一般不超過床體積0.5-1％，制備性柱層析加樣量不超過1-3％。離子交換劑的加樣量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分子篩。如果要求高分辨率時(shí)，如分析性柱層析和精制要求高純度產(chǎn)品時(shí)，則樣品的體積盡可能小。

2．加樣方法有3種方法可將樣品加到已制備好的柱頂：1.簡(jiǎn)單的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加樣；保持柱上端膠面平整、柱內(nèi)無氣泡和膠床不干裂十分重要。為此，除加樣時(shí)注意不破壞膠面平整外，在整個(gè)層析過程中，應(yīng)在膠面上端保留合適體積的洗脫液(約1-2cm柱高)，避免洗脫液滴入柱內(nèi)時(shí)，破壞膠面的平整或可能造成膠床干裂。2.不需要讓柱流干至床表面，而是加入1％濃度的蔗糖來增加樣品的密度；3.用一個(gè)毛細(xì)管和一個(gè)注射器或蠕動(dòng)泵把樣品直接傳送到柱表面(如一些商品柱附有專門加樣裝置)。必須根據(jù)具體條件反復(fù)試驗(yàn)以確定一個(gè)合適的流速。太高的流速使洗脫峰加寬，繼而降低了分辨率；過高時(shí)，有時(shí)會(huì)使流速先快后慢甚至發(fā)生阻塞。流速可以通過調(diào)節(jié)“操作壓”來控制，“操作壓”相當(dāng)于在柱上部的貯液瓶中溶劑的水平和柱出水口位置的水平之差。獲得穩(wěn)定流速的另一方法是利用蠕動(dòng)泵把洗脫液泵入或泵出柱，并保持穩(wěn)定流速。七、分部收集洗脫液必須分成小部分收集，每一部分相當(dāng)于2—5％的床體積。這些部分一般被收集在試管中，使得在柱上已經(jīng)分離的化合物仍然處于分離的狀態(tài)。每管收集的體積愈小，愈容易得到純的組分。已有各種商品的自動(dòng)部分收集器(fractioncollector)。它們?cè)O(shè)計(jì)成當(dāng)一個(gè)管中收集了一定量的洗脫液后一個(gè)新的收集管自動(dòng)地接替了它的位置。預(yù)先確定的體積轉(zhuǎn)移到每一個(gè)管中，或用電子控制的方法使預(yù)定的滴數(shù)滴入每一管。在一個(gè)固定的時(shí)間內(nèi)，讓洗脫液進(jìn)入每個(gè)管。八、檢測(cè)和合并收集洗脫液按一定的體積分別收集于試管中，為了測(cè)定收集的各部分中各種成分的分布須用一些能特異地檢測(cè)被分離化合物的方法來進(jìn)行分析，一般可用直接或間接方法，直接法:分光光度法、光折射法、熒光法和放免法等。間接法:化學(xué)顯色法、等電聚焦法、電泳法、薄層層析法和生物活性測(cè)定法等。如果某一化合物具有特征性物理特性，對(duì)可見光或紫外光有吸收，如蛋白質(zhì)在280nm，核酸在260nm處有最大的吸收。可用核酸白質(zhì)檢測(cè)儀。洗脫液的合并方法對(duì)目的物質(zhì)量和產(chǎn)量有較大的影響。欲得高純度的化合物，一般根據(jù)洗脫峰位置收集合并較窄的部分；欲得產(chǎn)量較多目的物，則合并較寬部分。九、洗脫峰的純度鑒定由于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率有限所以一個(gè)對(duì)稱的洗脫峰并不一定代表一個(gè)純凈的組分。如果洗脫峰峰形不對(duì)稱，或出現(xiàn)“肩”(shoulder)，則表示混有雜質(zhì)。對(duì)在一個(gè)特定的柱層析分離條件下顯示出的每個(gè)峰要用幾個(gè)純度標(biāo)準(zhǔn)(一般2-3個(gè)高分辨率方法)來檢驗(yàn)，才能確定它的均一性。例如，可采用SDS電泳法、等電聚焦法、高效液相層析法和測(cè)定N末端氨基酸殘基方法等。十、脫鹽和濃縮洗脫峰在純度鑒定的基礎(chǔ)上，將同一組分合并。若欲得到某一產(chǎn)品，有必要依次經(jīng)過減壓薄膜濃縮法或超濾(去鹽、去水)，透析去鹽再用冰凍干燥或有機(jī)溶劑沉淀等方法處理，得到干粉或沉淀。科研、生產(chǎn)中要得到高純度組分，往往要經(jīng)過幾次柱層析每次柱層析后，某一峰的洗脫液可依次用透析法除鹽超濾或減壓薄膜濃縮法將樣品濃縮到一定體積后，再上第二次柱。十一、凝膠的再生及保存1、再生(一般無需做再生處理)用過的凝膠經(jīng)0.5M的NaOH(含0.5M的NaCI)混合液浸泡當(dāng)污染嚴(yán)重時(shí)用0.5MHCl做短暫處理2、防霉

0.02%疊氮鈉或0