第六章微生物的生長及其控制生長——微生物細胞吸收營養物質，進行新陳代謝，當同化作用>異化作用時，生命個體的重量和體積不斷增大的過程。繁殖——生命個體生長到一定階段，通過特定方式產生新的生命個體，即引起生命個體數量增加的生物學過程。發育——從生長到繁殖，是生物的構造和機能從簡單到復雜、從量變到質變的發展變化過程，這一過程稱為發育。個體生長——微生物細胞個體吸收營養物質，進行新陳代謝，原生質與細胞組分的增加為個體生長。群體生長——群體中個體數目的增加。可以用重量、體積、密度或濃度來衡量。（由于微生物的個體極小，所以常用群體生長來反映個體生長的狀況）個體生長個體繁殖群體生長群體生長=個體生長+個體繁殖生長與繁殖的概念第一節測定生長繁殖的方法一、以生物量為指標測定微生物的生長（一）直接法體積測量法：又稱測菌絲濃度法通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鐘）和轉速（如5000rpm），離心后，倒出上清液，測出上清液體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。（二）間接法比濁法：該法主要用于發酵工業菌體生長監測

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。在一定范圍內，菌懸液中的細胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌數越多，光密度越大。因此，借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度，就可反應出菌液的濃度。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可采用一種特制的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。快速、簡便；但易受干擾。生理指標法：測含氮量蛋白質是細胞的主要物質，含量穩定，而氮是蛋白質的主要成分，通過測含氮量就可推知微生物的濃度。一般細菌含氮量為干重的12.5%，酵母菌為7.5%，霉菌為6.0%，根據一定體積培養液中的含氮量再乘以6.25，就可測得粗蛋白的含量。其他方法含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、產二氧化碳、產酸、產熱、粘度等，都可用于生長量的測定。二、以數量變化對微生物生長情況進行測定（一）直接法將待測樣品制成菌懸液，適當稀釋，加入血球計數板方格網的計數室內，在顯微鏡下直接計數；因為計數室的體積一定，所以能夠計算出每毫升待測樣品中的細胞個數；特點：全菌計數，不區分死菌與活菌；適用于單細胞微生物：細菌、酵母菌；要點：菌懸液濃度應在108個細胞/毫升左右；方格網的結構方格網由九個大方格組成，中間的大方格為計數室。計數室：邊長1mm、高0.1mm，體積0.1mm3等于10-4ml分為25個中方格每個中格分為16個小方格共400小格；計數室計數方法在顯微鏡下計算4-5個中格的細菌數，并求出每個小格所含細菌的平均數（二）間接法平板菌落計數法：活菌計數，適用于單細胞微生物將待測樣品制成菌懸液；菌懸液用10倍稀釋法適當稀釋；定量取稀釋液（0.2ml）涂平板培養，根據平板上生長的菌落計數（cfu數/平板）要點：同一稀釋度涂布三皿以上取平均值計數；每支移液管或槍頭只能接觸一個稀釋度的菌液厭氧菌的菌落計數法：第四節平板菌落計數第二節微生物的生長規律一、微生物的個體生長和同步生長由于微生物細胞極其微小，研究其個體生長存在著技術上的困難。同步培養技術：設法使群體中的所有細胞盡量都處于同樣的細胞生長和分裂周期中，然后分析此群體的各種生物化學特征，從而了解單個細胞所發生的變化。同步培養法：能獲得處于同一生長階段的群體細胞的培養方法同步生長：運用同步培養技術，控制微生物生長，使之處于同一生長階段并同時分裂。同步細胞群體在任何一時刻都處在細胞周期的同一相，彼此間形態、生化特征都很一致，因而是細胞學、生理學和生物化學等研究的良好材料。Helmstetter-Cummings法最經典的獲得同步生長的方法硝酸纖維素濾膜法是由于細胞的個體差異，同步生長往往只能維持2-3個世代，隨后又逐漸轉變為隨機生長。二、單細胞微生物的典型生長曲線生長曲線就是以培養時間為橫座標，以細胞數量或生物量為縱座標作出的培養過程中生物量變化曲線圖，反映液體培養基中微生物群體生長規律。☆以細菌為例介紹無分支單細胞微生物群體生長規律，其結論也基本適用于酵母菌。☆生長曲線代表了細菌在新的環境中從開始生長、分裂直至死亡的整個動態變化過程。☆每種細菌都有各自的典型生長曲線，但它們的生長過程卻有著共同的規律性。一般可以將生長曲線劃分為四個時期。將少量單細胞的純培養，接種到一恒定容積的新鮮液體培養基中，在適宜條件下培養，每隔一定時間取樣，測菌細胞數目。以培養時間為橫坐標，以細菌增長數目的對數為縱坐標，繪制所得的曲線。生長曲線的制作其它名稱：延遲期、停滯期、調整期、適應期剛接種后開始時細胞一般不立即進行繁殖，細菌數幾乎不增加的一段時期，曲線稍平。此時期細胞內的代謝活動比較旺盛，細胞體積明顯增大，在此期的后期，少數細胞開始分裂，曲線略有上升。現象：活菌數沒增加，曲線平行于橫軸特點：生長速率常數=0細胞形態變大或增長細胞內RNA特別是rRNA含量增高，原生質嗜堿性增強合成代謝活躍（核糖體、酶類、ATP合成加快），易產生誘導酶對外界不良條件敏感，（如氯化鈉濃度、溫度、抗生素等化學藥物）原因：適應新的環境條件，合成新的酶，積累必要的中間產物（一）延滯期（lagphase）菌種：繁殖速度較快的菌種的延滯期一般較短；接種物菌齡：用對數生長期的菌種接種時，其延滯期較短，甚至檢查不到延滯期；接種量：一般來說，接種量增大可縮短甚至消除延滯期（發酵工業上一般采用1/10的接種量）；培養基成分：在營養成分豐富的天然培養基上生長的延滯期比在合成培養基上生長時短；接種后培養基成分有較大變化時，會使延滯期加長，所以發酵工業上盡量使發酵培養基的成分與種子培養基接近。★影響延滯期長短的因素：認識延滯期的特點及形成原因對實踐的指導意義：◆在發酵工業上需設法盡量縮短延滯期；采取的縮短lagphase的措施有：①增加接種量；（群體優勢----適應性增強）②采用對數生長期的健壯菌種；③調整培養基的成分，在種子培養基中加入發酵培養基的某些成分。④選用繁殖快的菌種◆在食品工業上，盡量在此期進行消毒或滅菌☆由一個細胞分裂成為兩個細胞的時間間隔稱為世代，一個世代所需的時間就是代時（Ｇenerationtime,G），代時也就是群體細胞數目擴大一倍所需時間，有時也稱為倍增時間。☆右圖表示的是一個細胞經過若干代分裂后的情況。右圖可見，每經過一個代時，細胞數目就增加一倍，呈指數增加，因而被稱為指數生長，這就是單細胞群體生長的特征。N2N1t2t1培養時間Lg細胞數/ml一些細菌的代時菌名 培養基培養溫度℃ 代時minE.coli（大腸桿菌） 肉湯 37 17E.coli 牛奶 37 12.5 Enterobacteraerogenes（產氣腸細菌） 肉湯或牛奶37 16~18 E.aerogenes 組合 37 29~44B. Cereus（蠟狀芽孢桿菌） 肉湯 30 18B.thermophilus（嗜熱芽孢桿菌） 肉湯 55 18.3Lactobacillusacidophilus（嗜酸乳桿菌） 牛奶 37 66~87Streptococcuslactis（乳酸鏈球菌） 牛奶 37 26S.lactis 乳糖肉湯 37 48Salmonellatyphi（傷寒沙門氏菌） 肉湯 37 23.5Azotobacterchroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 344~461Mycobacteriumtuberculosis（結核分枝桿菌）組合 37 792~932Nitrobacteragilis（活躍硝化桿菌） 組合 27 1200營養物濃度與對數期生長速率和產量作用方式：影響微生物的生長速率和總生長量生長限制因子：凡是處于較低濃度范圍內，可影響生長速率和菌體產量的營養物就稱生長限制因子8.0mg/ml6.0mg/ml4.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.2mg/ml0.1mg/ml只最大收獲量受影響生長速度和最大收獲量受影響時間細胞數或菌體量不同溫度下的代時溫度對微生物的代時有明顯影響：E.Coli在不同溫度下的代時溫度（℃） 代時（分） 溫度（℃） 代時（分）10 860 35 2215 120 37 1720 90 40 17.525 40 45 2030 29 47.5 77應用意義：①由于此時期的菌種比較健壯，增殖噬菌體的最適菌齡；生產上用作接種的最佳菌齡；②發酵工業上盡量延長該期，以達到較高的菌體密度③食品工業上盡量使有害微生物不能進入此期④是生理代謝及遺傳研究或進行染色、形態觀察等的良好材料。（三）穩定期（stationaryphase）又稱：恒定期或最高生長期特點：①新增殖的細胞數與老細胞的死亡數幾乎相等，微生物的生長速率處于動態平衡，培養物中的細胞數目達到最高值。②細胞分裂速度下降，開始積累內含物，產芽孢的細菌開始產芽孢。③此時期的微生物開始合成次生代謝產物，對于發酵生產來說，一般在穩定期的后期產物積累達到高峰，是最佳的收獲時期。產生原因：

營養物尤其是生長限制因子的耗盡營養物的比例失調，如碳氮比不合適;有害代謝廢物的積累（酸、醇、毒素等）物化條件（pH、氧化還原勢等）不合適;應用意義：1）發酵生產形成代謝產物的重要時期（抗生素、氨基酸等），生產上應盡量延長此期，提高產量，措施如下：補充營養物質（補料）調pH

調整溫度2）穩定期細胞數目及產物積累達到最高。生長產量常數（Y，或生長得率，growthyield）：概念：表示微生物對基質利用效率的高低

Y=菌體干重/消耗營養物質的濃度

根據產量常數可確定微生物對營養物質的需要量x-穩定期細胞干重；x0-接種時細胞干重；C-穩定期限制性營養物濃度；C0-限制性營養物最初濃度如：Y=0.5，表示要得到5g菌體，需某營養物（葡萄糖）10g。Y=x–x0C0–C=x–x0C0（四）衰亡期（declinephase）現象：整個群體出現負生長（R<0）特點：①細胞死亡數增加，死亡數大大超過新增殖的細胞數，群體中的活菌數目急劇下降，出現“負生長”。②細胞內顆粒更明顯，細胞出現多形態、畸形或衰退形，芽孢開始釋放。③因菌體本身產生的酶及代謝產物的作用，使菌體死亡、自溶等，發生自溶的菌生長曲線表現為向下跌落的趨勢。衰亡期比其他各時期時間長，它的長短也與菌種和環境條件有關。產生原因：生長條件的進一步惡化，使細胞內的分解代謝大大超過合成代謝，繼而導致菌體的死亡絲狀微生物的群體生長絲狀微生物的純培養采用孢子接種，在液體培養基中震蕩培養或深層通氣加攪拌培養，菌絲體通過斷裂繁殖不形成產孢結構。可以用菌絲干重作為衡量生長的指標，即以時間為橫坐標，以菌絲干重為縱坐標，繪制生長曲線。可分為三個階段：1、生長停滯期2、迅速生長期3、衰退期1、生長停滯期:

造成生長停滯的原因一是孢子萌發前真正的停滯狀態，另一種是生長已經開始，但還無法測定。2、迅速生長期:菌絲體干重迅速增加，菌絲干重不以幾何級數增加，沒有對數生長期。生長主要表現在菌絲尖端的伸長和出現分支、斷裂等，此時期的菌體呼吸強度達到高峰，有的開始積累代謝產物。3、衰退期:菌絲體干重下降，到一定時期不再變化。大多數次級代謝產物在此期合成，大多數細胞都出現大的空泡。有些菌絲體還會發生自溶菌絲體，這與菌種和培養條件有關。絲狀微生物的群體生長三、微生物的連續培養分批培養（batchculture）：將微生物置于一定容積的定量的培養基中培養，培養基一次性加入。不再補充和更換，最后一次性收獲。連續培養（continuousculture）：在微生物培養的過程中，不斷地供給新鮮的營養物質，同時排除含菌體及代謝產物的發酵液，讓培養的微生物長時間地處于對數生長期，以利于微生物的增殖速度和代謝活性處于某種穩定狀態。連續培養理論基礎：由于對典型生長曲線中穩定期到來原因的認識，采取相應有效措施推遲其來臨，從而發展出現在的連續培養技術。原理：當微生物在單批培養方式下生長達到對數期后期時，一方面以一定的速度流進新鮮培養基并攪拌，另一方面以溢流方式以同樣的流速不斷流出培養液，使培養物達到動態平衡，其中的微生物就能長期保持對數期的平衡生長狀態和穩定的生長速率。單批培養恒濁法恒化法單批培養 連續培養 時間連續流入新鮮培養液lg細胞數（個/ml）連續培養連續培養原理連續培養器按控制方式分按培養器的級數分按細胞狀態分按用途分內控制（控制菌體密度）：恒濁器外控制（控制培養液流速、以控制生長速率）：恒化器單級連續培養器多級連續培養器一般連續培養器固定化細胞連續培養器實驗室科研用：連續培養器發酵生產用：連續發酵罐連續培養器（1）按控制方式分

連續培養技術——恒化連續培養概念：以恒定流速使營養物質濃度恒定而保持細菌生長速率恒定的方法。原理：通過控制某一種營養物濃度（如碳、氮源、生長因子等），使其始終成為生長限制因子，而達到控制培養液流速保持不變，并使微生物始終在低于其最高生長速率條件下進行生長繁殖，保持恒定的生長速率。特點：維持營養成分的亞適量，控制微生物生長速率。菌體生長速率恒定，菌體均一、密度穩定，產量低于最高菌體產量。應用范圍：實驗室科學研究恒化器Chemostat或bactogen

概念：通過連續培養裝置中的光電系統控制培養液中菌體濃度恒定、使細菌生長連續進行的一種培養方式。原理：通過調節新鮮培養基流入的速度和培養物流出的速度來維持菌濃度不變,即濁度不變。主要采用恒濁器，當濁度高時，使新鮮培養基的流速加快，濁度降低，則減慢培養基的流速。特點：基質