第三章污染物的生物效應(yīng)檢測(cè)本章將討論以下內(nèi)容：生物測(cè)試及方式一般毒性試驗(yàn)生物的分子和細(xì)胞水平檢測(cè)生物致突變、致畸和致癌效應(yīng)檢測(cè)第一節(jié)生物測(cè)試及方式一、生物測(cè)試（Bioassay）的概念：指系統(tǒng)地利用生物的反應(yīng)測(cè)定一種或多種污染物或環(huán)境因素單獨(dú)或聯(lián)合存在時(shí)所導(dǎo)致的影響或危害。注釋1：所利用的生物反應(yīng)包括分子、細(xì)胞、組織、器官、個(gè)體、種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)各級(jí)水平上的反應(yīng)注釋2：生物測(cè)試與物理化學(xué)測(cè)試的比較注釋2：生物測(cè)試與物理化學(xué)測(cè)試的不同之處？生物測(cè)試不同于常規(guī)的物理、化學(xué)檢測(cè)。前者能夠測(cè)定污染物對(duì)生物機(jī)體的影響，而后者只能測(cè)定污染物的濃度。例如：通過(guò)水污染的生物測(cè)試可獲得以下數(shù)據(jù)：各種環(huán)境因素如DO、pH、溫度、混濁度等對(duì)生命的有利以及不利的濃度或強(qiáng)度；污染物對(duì)受測(cè)生物的毒性；各種水生生物對(duì)污染物的相對(duì)敏感性；廢水所應(yīng)處理的程度；允許的污染物排放濃度等。短期生物測(cè)試（ShortTermBioassays）被試生物在短時(shí)間內(nèi)暴露于高濃度的污染物下，測(cè)定污染物對(duì)生物機(jī)體的影響。主要用于測(cè)定LC50、IC50、EC50用來(lái)快速估計(jì)污染物的毒性；評(píng)定幾種不同毒物或廢物對(duì)某種生物的相對(duì)毒性；指示出中期或長(zhǎng)期試驗(yàn)所應(yīng)使用的毒物濃度。多數(shù)采用靜止式。中期生物測(cè)試（IntermediateTermBioassays）時(shí)間為8d到90d，多數(shù)情況下為流動(dòng)式。長(zhǎng)期生物測(cè)試（LongTermBioassays）包括全部生活史的生物測(cè)試（CompleteLife－cycleBioassays）和部分生活史的生物測(cè)試（PartialLife－cycleBioassays）目的是要測(cè)定出在持續(xù)情況下不造成有害效應(yīng)的毒物最大濃度或最大允許毒物濃度（MATC）只能采用流動(dòng)式受試生物的選擇敏感性廣泛性和可獲得性有代表性，是生態(tài)系統(tǒng)的重要組成易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和繁殖具有豐富的生物背景資料對(duì)毒物的響應(yīng)能夠被反應(yīng)和測(cè)定等等第二節(jié)一般毒性試驗(yàn)一、生物毒性的基本概念毒物（Toxicant）一定條件下，可引起不良生物反應(yīng)的外來(lái)化學(xué)物質(zhì)。毒物與非毒物之間不存在絕對(duì)的界限，通常一種物質(zhì)只有達(dá)到中毒劑量時(shí)才是毒物。中毒（Intoxication）生物體受到毒物作用引起功能或器質(zhì)性改變后出現(xiàn)的疾病狀態(tài)。中毒是各種毒性作用的綜合表現(xiàn)，包括急性中毒、亞急性中毒、慢性中毒。毒性（Toxicity）指一種物質(zhì)引起機(jī)體損傷的能力。毒性作用或毒效應(yīng)（ToxicEffect）化學(xué)物引起生物體損害的總稱(chēng)無(wú)損害作用（Non-adverseEffect）可逆的生物學(xué)變化，不引起機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育和壽命的改變；不引起機(jī)體功能容量的降低和對(duì)額外應(yīng)激狀態(tài)代償能力的損害等。

效應(yīng)（Effect）也稱(chēng)為作用，指接觸一定劑量化學(xué)物后，使機(jī)體產(chǎn)生的生物學(xué)改變。效應(yīng)是對(duì)個(gè)體而言的，這種改變可用一定的計(jì)量單位表示。反應(yīng)（Response）指接觸一定劑量化學(xué)物后，產(chǎn)生某種效應(yīng)并達(dá)到一定強(qiáng)度的個(gè)體在群體中所占的比例。反應(yīng)是對(duì)群體而言的，用百分率或比值來(lái)表示，如發(fā)病率、死亡率等。劑量－效應(yīng)關(guān)系和劑量－反應(yīng)關(guān)系曲線圖劑量10050反應(yīng)強(qiáng)度（％）圖3－1劑量－反應(yīng)曲線（直線型）劑量10050死亡率（％）圖3－2劑量－反應(yīng)曲線（拋物線型）對(duì)數(shù)劑量10050死亡率（％）圖3－3劑量－反應(yīng)曲線（S形線型）死亡率（概率單位）對(duì)數(shù)劑量10050圖3－4劑量－反應(yīng)曲線危害性（Hazard）:有毒物質(zhì)在與機(jī)體接觸或使用過(guò)程中，引起中毒的可能性。與風(fēng)險(xiǎn)（Risk）相近危險(xiǎn)性：化學(xué)物質(zhì)在正常的生產(chǎn)使用條件下，能引起機(jī)體發(fā)生中毒的可能性。偏重物質(zhì)本身性質(zhì)。二、毒性試驗(yàn)常用參數(shù)致死劑量或致死濃度（LethalDose/LD，LethalConcentration/LC）表示一次染毒后，在一定時(shí)間內(nèi)引起受試動(dòng)物死亡的劑量或濃度。絕對(duì)致死劑量或濃度（LD100、LC100）半數(shù)致死劑量或濃度（LD50、LC50）最小致死劑量或濃度（MLD、MLC）最大耐受劑量或濃度（LD0、LC0）毒作用帶（ToxicEffectZone）一種根據(jù)毒性和毒性作用特點(diǎn)綜合評(píng)價(jià)外來(lái)物危險(xiǎn)性的指標(biāo)。是對(duì)LD50的補(bǔ)充。急性毒性作用帶（Acute－toxicEffectZone）慢性毒性作用帶（Chronic－toxicEffectZone）半效應(yīng)濃度（EC50）在一定時(shí)間內(nèi)，引起50%受試生物的某種效應(yīng)變化的濃度。只有同種效應(yīng)才能比較。半數(shù)抑制濃度（IC50）是指能引起受試受試生物50%抑制的濃度常用于對(duì)生長(zhǎng)速率和活性的抑制。毒物單位與分級(jí)：mg/L,mg/kg,mg/m3分級(jí)：按急性毒性，人為分級(jí)。與染毒方式有關(guān)。三、急性毒性試驗(yàn)（AcuteToxicityTest）急性毒性試驗(yàn)（AcuteToxicityTest）研究化學(xué)物質(zhì)大劑量一次染毒或24小時(shí)內(nèi)多次染毒動(dòng)物所引起的毒性的試驗(yàn)。其目的是短期內(nèi)了解該物質(zhì)的毒性大小和特點(diǎn)，并為進(jìn)一步開(kāi)展其他毒性試驗(yàn)提供設(shè)計(jì)依據(jù)。急性毒性試驗(yàn)類(lèi)型哺乳動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)水生生物急性毒性試驗(yàn)蚯蚓急性毒性試驗(yàn)急性毒性試驗(yàn)過(guò)程（嚙齒類(lèi)）1、按試驗(yàn)要求選擇受試生物常用成年大鼠或小鼠，雌雄動(dòng)物同時(shí)試驗(yàn)，對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物預(yù)先觀察幾天后標(biāo)記編號(hào)并隨機(jī)分組。2、預(yù)備試驗(yàn)和確定劑量組選用少量動(dòng)物進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，求出引起動(dòng)物90％（或全部）死亡的劑量（即最高劑量組劑量）和引起動(dòng)物10％死亡（或不死亡）的劑量（即最低劑量組劑量）。在最高劑量組劑量和最低劑量組劑量的范圍內(nèi)，按等比級(jí)數(shù)插入若干個(gè)中間劑量（一般為4-6個(gè)），從而確定正式試驗(yàn)的劑量組。3、染毒方式和受試物的配制一般用灌胃法和人工熏氣法。受試物的配制：配制試驗(yàn)所需的最高劑量濃度溶液，然后依次稀釋到所需濃度。4、觀察指標(biāo)中毒癥狀：一般觀察24～48小時(shí)，最好觀察到絕大多數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)典型中毒癥狀。動(dòng)物死亡數(shù)目和死亡時(shí)間病理檢查：對(duì)于試驗(yàn)時(shí)立即死亡的動(dòng)物，可解剖，分析死亡原因，看是技術(shù)事故還是中毒引起的死亡。魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)過(guò)程選擇合適的魚(yú)類(lèi)確定養(yǎng)殖條件水質(zhì)、水量、pH、溫度、溶氧量等蚯蚓急性毒性試驗(yàn)過(guò)程主要評(píng)價(jià)土壤中殘留農(nóng)藥的毒性一般采用試紙法（蚯蚓與浸潤(rùn)在試紙上的有害物接觸）與人工土壤法（將一定濃度的有害物置于人工土壤中）四、亞慢性毒性試驗(yàn)和慢性毒性試驗(yàn)亞慢性毒性試驗(yàn)在生物生命周期的1/20~1/30時(shí)間內(nèi),使生物每天或反復(fù)多次接觸受試物的毒性實(shí)驗(yàn)，以確定最大毒物效應(yīng)劑量和效應(yīng)時(shí)間。采用的劑量是LD50的1/80~1/50，給藥途徑盡量模仿人類(lèi)在環(huán)境中實(shí)際的接觸方法。觀察的指標(biāo)主要有：（a）表觀指標(biāo)，如生長(zhǎng)情況、活動(dòng)能力、死亡等（b）血液與生化指標(biāo)，如血細(xì)胞、肝功能等（c）病理組織學(xué)檢查，如肝、肺腎等有否病變等五、蓄積毒性試驗(yàn)低于中毒閾劑量的外來(lái)化合物，反復(fù)多次地與機(jī)體持續(xù)接觸，經(jīng)一定時(shí)間后使機(jī)體出現(xiàn)明顯的中毒表現(xiàn)，即為蓄積毒性作用是由于外來(lái)化合物進(jìn)入機(jī)體的速度大于有機(jī)體消除的速度，而使外來(lái)化合物在體內(nèi)的量不斷累積，達(dá)到了使機(jī)體引起毒性作用的閾劑量所致。是引起亞慢性和慢性毒性作用的基礎(chǔ)。是評(píng)估環(huán)境污染毒性作用的常用指標(biāo)之一，也是制訂其在環(huán)境中的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的重要參考依據(jù)。蓄積系數(shù)法（CumulativeCoefficientMethod）是分次給受試物后引起50%受試動(dòng)物出現(xiàn)某種毒效應(yīng)的總劑量，與一次給受試物后引起50%受試動(dòng)物出現(xiàn)同一毒效應(yīng)的劑量的比值

蓄積系數(shù)K＝（比值愈小，表示蓄積作用愈強(qiáng)）生物半減期生物半減期（T1/2）是指一種外來(lái)化合物在體內(nèi)消除到原有濃度（或量）的一半所需要的時(shí)間。生物半減期越長(zhǎng)的物質(zhì)，表示越不易由體內(nèi)消除，其蓄積作用的可能性就越大。T1/2=動(dòng)物細(xì)胞模型法采用動(dòng)物細(xì)胞（如：非洲綠猴腎細(xì)胞）作為試驗(yàn)受體，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)，觀察含外源化學(xué)物質(zhì)的培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長(zhǎng)情況（與對(duì)照相比較），從而確定化學(xué)物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生毒效應(yīng)；測(cè)試時(shí)間一般只需48h，而且重復(fù)性好、成本低、可較直接反應(yīng)對(duì)人體的影響。細(xì)胞水平檢測(cè)：第三節(jié)生物的分子和細(xì)胞水平檢測(cè)分子水平檢測(cè)1：加合物的測(cè)定DNA－加合物的測(cè)定

蛋白加合物的測(cè)定eg：Hb—加合物分子水平檢測(cè)2：酶活性的測(cè)定方法：直接法：指直接測(cè)定體液中酶的含量，該法技術(shù)要求較高；間接法：通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)中底物的減少或產(chǎn)物的增加量來(lái)確定酶的活性，該方法目前使用廣泛，但要求反應(yīng)專(zhuān)一性較高，反應(yīng)結(jié)果與過(guò)程方便觀察。酶活性的測(cè)定一般代謝酶的活性測(cè)定乙酰膽堿酯酶腺三磷酶解毒系統(tǒng)酶類(lèi)誘導(dǎo)作用的檢測(cè)混合功能氧化酶的誘導(dǎo)作用谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶抗氧化防御系統(tǒng)檢測(cè)過(guò)氧化氫酶谷胱甘肽過(guò)氧化酶第四節(jié)生物致突變、致畸和致癌效應(yīng)檢測(cè)

基本概念突變（Mutation）：生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生了基因結(jié)構(gòu)的變化。基因突變（GeneMutation）和染色體畸變（ChromosomeMutation）基因突變：只涉及染色體的某一部分的改變，不能用光學(xué)顯微鏡直接觀察染色體畸變：染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可用光學(xué)直接觀察一、致突變?cè)囼?yàn)致突變作用（Mutagenesis）和致突變物（Mutagen）致突變作用：某些物質(zhì)引起生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構(gòu)改變的作用致突變物：具有引起生物體的遺傳物質(zhì)發(fā)生基因結(jié)構(gòu)變化的物質(zhì)致突變?cè)囼?yàn)的目的確定某種外來(lái)化合物（或環(huán)境污染物）對(duì)生物體是否具有致突變作用。致突變?cè)囼?yàn)方法基因突變?cè)囼?yàn)例如Ames試驗(yàn)、哺乳動(dòng)物體細(xì)胞突變株試驗(yàn)染色體畸變?cè)囼?yàn)DNA損傷試驗(yàn)Ames試驗(yàn)

（沙門(mén)氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)）Ames試驗(yàn)原理利用一種營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變型菌株與受試物接觸，若此化學(xué)物質(zhì)具有致突變性，可使突變型微生物再發(fā)生回復(fù)突變，重新成為野生型微生物。注釋1：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變型菌株：不具合成組氨酸的能力，不能在低營(yíng)養(yǎng)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)注釋2：野生型微生物：鼠傷寒沙門(mén)氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)法某些化學(xué)物質(zhì)需經(jīng)代謝活化才有致變作用，在測(cè)試系統(tǒng)中加入哺乳動(dòng)物微粒體酶，從而彌補(bǔ)體外試驗(yàn)缺乏代謝活化系統(tǒng)之不足。方法：在動(dòng)物體外將待測(cè)物經(jīng)肝微粒體酶系活化后，檢測(cè)其所誘發(fā)的沙門(mén)氏菌回變菌落數(shù)。突變率＝誘發(fā)回復(fù)突變菌落數(shù)/自發(fā)回復(fù)突變的菌落數(shù)（對(duì)照）當(dāng)突變率大于2.0時(shí)，為陽(yáng)性結(jié)果。Ames試驗(yàn)的應(yīng)用檢測(cè)食品添加劑、化妝品等的致突變性，由此推測(cè)其致癌性；檢測(cè)水源水和飲用水的致突變性，探索較現(xiàn)行方法更加衛(wèi)生安全的消毒措施；檢測(cè)城市污水和工業(yè)廢水的致突變性，結(jié)合化學(xué)分析，追蹤污染源，為研究防治對(duì)策提供依據(jù)；檢測(cè)土壤、污泥、工業(yè)廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性，以防止維系生命的土壤受致突變物污染后，通過(guò)農(nóng)作物危害人類(lèi)；檢測(cè)氣態(tài)污染物的致突變性，防止污染物經(jīng)由大氣，通過(guò)呼吸對(duì)人體發(fā)生潛在危害；研究化合物結(jié)構(gòu)與致變性的關(guān)系，為合成對(duì)環(huán)境無(wú)潛在危害的新化合物提供理論依據(jù)；還有用Ames試驗(yàn)篩選抗突變物，研究開(kāi)發(fā)新的抗癌藥。。。。。。原理：某種動(dòng)物體細(xì)胞突變株缺乏利用嘌呤堿的酶，因此不能利用某些嘌呤堿類(lèi)似物，但正常細(xì)胞可以利用。當(dāng)培養(yǎng)液中存在有一些不常見(jiàn)的嘌呤堿類(lèi)似物時(shí)，正常細(xì)胞可以將這些嘌呤類(lèi)似物結(jié)合進(jìn)DNA中，從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。但突變型細(xì)胞不受影響。一旦突變型細(xì)胞和某種化學(xué)物接觸后又變?yōu)閷?duì)這些嘌呤堿敏感的野生型，就說(shuō)明這種化學(xué)物具有致突變性哺乳動(dòng)物體細(xì)胞突變株試驗(yàn)體外培養(yǎng)法：動(dòng)物細(xì)胞（如淋巴細(xì)胞等）在一定的培養(yǎng)液中37oC培養(yǎng)1－3天，培養(yǎng)過(guò)程中與受試物同步接觸。在細(xì)胞收獲前加入秋水仙堿使細(xì)胞分裂停止于分裂中期（該期的細(xì)胞較易觀察胞內(nèi)的染色體結(jié)構(gòu)），然后經(jīng)一定的預(yù)處理，在顯微鏡下觀察染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)等（如斷裂、缺失、環(huán)狀等）。體內(nèi)試驗(yàn)法：也采用灌胃或腹腔注射方式使受試物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)（如小鼠等），飼養(yǎng)數(shù)個(gè)月，在處死前注入秋水仙堿，抽取骨髓細(xì)胞經(jīng)預(yù)處理后顯微觀察。顯微鏡檢測(cè)染色體畸變微核實(shí)驗(yàn)

微核是染色單體或染色體的無(wú)著絲點(diǎn)斷片或因紡錘體受傷而失去的整個(gè)染色體，在分裂后期，仍留在細(xì)胞質(zhì)中，或因核膜受損后核物質(zhì)向外突出延伸形成，形成一個(gè)或幾個(gè)規(guī)則的圓形或橢圓形小體，其嗜染性與細(xì)胞核相似，比主核小，故稱(chēng)微核。蠶豆根尖微核實(shí)驗(yàn)二、

致畸效應(yīng)概念畸形（Malformation）、畸胎（Terate）畸形：胚胎在發(fā)育過(guò)程中，由于受到某種因素的影響，使胚胎的細(xì)胞分化和器官形成不能正常進(jìn)行，而造成器官組織上的缺陷，并出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的形態(tài)結(jié)構(gòu)異常畸胎：有畸形的胚胎或胎仔稱(chēng)為畸胎（廣義的畸胎還包括生化、生理功能及行為的發(fā)育缺陷）致畸作用（Teratogenesis）、致畸物（Teratogen）致畸物通過(guò)母體作用于胚胎而引起胎兒畸形的現(xiàn)象稱(chēng)為致畸作用。“反應(yīng)停”致畸致畸作用的毒理學(xué)特點(diǎn)不同發(fā)育階段敏感性不同不同發(fā)育階段畸形不同種屬差異明顯致畸作用帶較窄化學(xué)致畸作用機(jī)理突變引起胚胎發(fā)育異常；對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)分化較為重要的酶類(lèi)受到抑制；母體正常代謝過(guò)程被破壞；細(xì)胞分裂過(guò)程的障礙致畸試驗(yàn)?zāi)康模簷z測(cè)環(huán)境污染物能否通過(guò)妊娠母體引起胚胎畸形。一般過(guò)程為選擇合適的受試動(dòng)物，受孕后給予一定劑量的化學(xué)物（如灌胃等），在自然預(yù)產(chǎn)期前1－2天解剖檢查胎兒是否發(fā)生畸形。一般試驗(yàn)動(dòng)物要求其對(duì)化學(xué)物質(zhì)的代謝過(guò)程與人相似，胎盤(pán)結(jié)構(gòu)也相似，還要求孕期短，產(chǎn)仔多，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，如大鼠、家兔、小鼠等。致畸作用的評(píng)價(jià)注意與自然變異區(qū)分；注意種屬差異；注意試驗(yàn)的閾劑量與人類(lèi)實(shí)際可能攝入量之間的差別。三、致癌效應(yīng)概念癌：細(xì)胞自主生長(zhǎng)，不斷分裂形成危害機(jī)體的腫塊（惡性腫瘤）。化學(xué)致癌作用（ChemicalCarcinogenesis）指化學(xué)物質(zhì)（包括有機(jī)、無(wú)機(jī)、天然和合成的化學(xué)物質(zhì)）引起腫瘤的過(guò)程。化學(xué)致癌物（ChemicalCarcinogen）指能誘發(fā)腫瘤的化學(xué)物質(zhì)。致癌因素：化學(xué)物理：射線生物：病毒細(xì)胞癌變學(xué)說(shuō)體細(xì)胞突變學(xué)說(shuō)癌變形成的基礎(chǔ)是體細(xì)胞發(fā)生了突變，導(dǎo)致其功能發(fā)生異常。分化障礙學(xué)說(shuō)細(xì)胞癌變不一定需要體細(xì)胞遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，而只是細(xì)胞分化過(guò)程中有關(guān)的基因調(diào)控過(guò)程受到致癌因素的干擾，使細(xì)胞分化和增殖發(fā)生紊亂而出現(xiàn)癌變。癌變過(guò)程引發(fā)階段正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的過(guò)程。促長(zhǎng)階段促長(zhǎng)是經(jīng)過(guò)引發(fā)的癌細(xì)胞不斷增殖直至形成一個(gè)臨床上可被檢出之腫塊的過(guò)程，是癌的增殖階段。促進(jìn)過(guò)程需要較長(zhǎng)的時(shí)間，一般為可逆過(guò)程。浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移階段浸潤(rùn)：癌細(xì)胞分泌毒素，侵蝕和破壞體內(nèi)各種組織和器官。轉(zhuǎn)移：癌細(xì)胞從初生腫瘤中離散，隨血液循環(huán)向全身擴(kuò)散。致癌試驗(yàn)?zāi)康模簷z驗(yàn)受試物及其代謝產(chǎn)物是否具有致癌效應(yīng)或誘發(fā)腫瘤作用的慢性毒性試驗(yàn)法。試驗(yàn)方法（p130）短期篩檢方法85％以上的癌癥都是由致突變作用造成的,利用已建立的各種致突變?cè)囼?yàn)方法快速篩檢外來(lái)化合物是否具有致癌作用長(zhǎng)期動(dòng)物誘癌試驗(yàn)

過(guò)程：選擇受試動(dòng)物類(lèi)型與數(shù)量；確定劑量與給藥方式；觀察結(jié)果（包括腫瘤發(fā)生情況，發(fā)生率，潛伏期）最終確定結(jié)果等。第五節(jié)微宇宙法微宇宙（Microcosm）是研究污染物在生物種群、群落、生態(tài)系統(tǒng)和生物圈水平上的生物效應(yīng)的一種方法，又稱(chēng)模型生態(tài)系統(tǒng)法（ModelEcosystem）可分為自然微宇宙和人工微宇宙或也可