關于色譜毛細管電泳法1第一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三2概述毛細管電泳又叫高效毛細管電泳(HPCE)，是80年代初發展起來的一種新型分離分析技術，它是電泳技術與層析技術相結合的產物廣泛用于生物大分子，手性藥物，生物體內的藥物及代謝物，中西藥物及其制劑等的分析，在選擇性上與高效液相法有很大的互補性被多國藥典收載，如2010年版中國藥典對鹽酸頭孢吡肟中N-甲基吡咯烷的檢查，USP對鹽酸羅哌卡因的對映體純度檢查，均采用毛細管電泳法測定第二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三3一、基本原理高效毛細管電泳以高壓電場為驅動力，以毛細管為分離通道，依據各組分之間的遷移速度和分配行為上的差異而實現分離的一類技術在毛細管電泳中有兩個重要的遷移：電泳遷移電滲流遷移第三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三4電泳遷移在電場作用下，帶電組分作定向移動。其遷移速度（）可用下式表示：

=eE

（1）e為電泳淌度E為電場強度（V/L）——是外加電壓和毛細管長度的函數第四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三5電泳遷移原理對于給定的離子和介質，淌度e為離子的特征常數，其大小取決于分子所受的電場力FE和其通過介質時的摩擦力FF的平衡：

FE

=qE

（q為離子電量）

FF=－6r

（溶液粘度,r離子半徑,離子速度）達到平衡時，兩種力大小相等而方向相反，即

qE=6r

（2）第五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三6電泳遷移原理根據式(1)=eE

，淌度e=/E

根據式(2)qE=6r，/E=q/(6r)所以e=q/(6r)（3）式（3）表明，帶電量大的物質，離子半徑小的物質有較高的淌度第六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三7淌度淌度——物理常數，是在溶質帶最大電量時測定并外推至無限稀釋條件下的數值，即絕對淌度有效淌度——實驗條件下測得的數值，其取決于操作緩沖液的pH值和組成第七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三8溶液pH值對淌度的影響若兩種溶質在完全離子化狀態下，具有相同的電泳淌度，則因沒有差速遷移而不能分離但若它們具有不同的pKa值，則可調節溶液pH值，使他們具有不同的有效淌度，而達到分離的目的第八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三9電滲流（EOF）毛細管電泳中的一個重要現象，是毛細管內壁表面電荷所引起的管內液體整體流動的現象，是推動流體前進的驅動力當固體與液體接觸時，固-液兩相界面上會帶有相反符號的電荷，形成雙電層。對于石英毛細管柱，當溶液pH值達4以上時，其內壁帶負電荷，管中液體將感應一層正電荷，形成雙電層，在高電壓作用下緩沖液整體向負極移動，此即電滲流(eof)第九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三10電滲流在電場作用下電滲流作用示意圖第十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三11電滲流性質電滲流的一個獨特性質是其具有平面流型，推動液體流動的力在毛細管內均勻分布，平面流型的優點是對譜帶的擴散沒有直接作用第十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三12帶電微粒在毛細管內的移動的速度帶電微粒在毛細管內的移動的速度為電泳流和電滲流的矢量和。

=(e+eof）V/L一般情況下，電滲流的方向是由正極向負極移動，而電滲流的速度又遠大于電泳流故所有組分均向同一方向——陰極移動，但速度各不相同第十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三13淌度與遷移時間式中L為毛細管總長度，

l為毛細管有效長度（進樣點到檢測器距離），V為電壓當L，l，V一定時，Tm與e成反比Lle

VTm=第十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三14電滲流后的遷移時間Tm=L·l/（e+eof）·V（e+eof）稱為表觀淌度a（即在電滲流存在下測得的淌度）溶質從進樣點遷移至檢測點所用的時間稱為“遷移時間(t)”，根據上式可計算溶質的表觀淌度：a

=e＋eof=L·l/t·V當L、l、V一定時，a與t成反比第十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三15二、分離度與理論板數分離度R=Z/4

（Z為兩峰間距，為峰標準差）理想條件下理論板數n與電壓V的關系可表示為：N=（e＋

eof）·V·l/2DL（式中D為擴散系數）D值小的大分子擴散小，柱效高在高電場下(V值大)，溶質在毛細管內停留時間短，擴散小，柱效高W=42（tR2-tR1）W1+W2R=在實際工作中，按HPLC方法求得理論板數：N=5.54（t/w1/2）2第十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三16影響分離效率的因素焦耳熱與溫度梯度——電流通過而產生的熱稱為焦耳熱。受毛細管尺寸、溶液電導、外加電壓等影響不均勻的溫度梯度和局部的黏度變化會引起區帶展寬。溫度變化1℃→黏度變化2%～3%→淌度變化2%～3%進樣塞長度——在進樣過程中減少樣品塞長度非常重要。對進樣長度的限制是低于毛細管總長度的（1～2）%。例70cm長的毛細管，進樣量應小于7mm第十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三17影響分離效率的因素溶質與管壁相互作用——可能導致峰拖尾或發生對溶質的完全吸附。對多肽和蛋白質來說，這種吸附特別嚴重?？刹捎枚喾N方法來減少相互作用：增加緩沖液濃度以降低有效表面電荷在極端pH值下進行分離，使石英表面硅羥基以不帶電的形式存在對毛細管壁進行涂層處理電分散作用——樣品區帶與操作緩沖液的電導差異可產生峰型畸變第十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三18◎◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎◎◎bufferbuffer◎◎◎◎bufferbuffer＋＋＋－－－低電導等電導高電導樣品區帶樣品區帶樣品區帶溶質電導高于緩沖液，產生前沿峰溶質電導低于緩沖液，產生拖尾峰◎◎樣品與緩沖液電導不匹配引起的電分散第十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三19

方式分離依據毛細管區帶電泳（CZE）自由溶液的淌度膠束電動色譜（MECC）疏水性/離子性相互作用毛細管凝膠色譜（CGE）分子大小/電荷毛細管等電聚焦（CIEF）等電點毛細管等速電泳（CITP）移動界面毛細管電色譜（CEC）樣品與固定相間相互作用三、分離模式毛細管電泳的操作方式有多種，分離機制各不相同，常用的分離模式有：第十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三20毛細管區帶電泳（CZE）CZE是應用最廣泛的一種技術，在毛細管內充滿緩沖液，不同質荷比大小的組分在電場的作用下，根據遷移速度不同而達到分離緩沖液選擇因電滲流（EOF）對pH值很敏感，故要求采用緩沖液來維持恒定的pH值第二十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三21對緩沖液的要求強緩沖能力，低的紫外吸收，小的淌度。常用的緩沖液有Tris（三羥甲基氨基丙烷），硼酸鹽，磷酸鹽等緩沖液的pH值當測定多肽、蛋白質等時，由于溶質的pI值相接近，此時調節緩沖液的pH值對分離特別有用。在高于或低于溶質的pI值情況下操作，可使溶質所帶電荷改變，從而在EOF前或后流出第二十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三22表面活性劑在毛細管電泳中常添加表面活性劑，作為疏水性溶質的增溶劑、與溶質形成離子對，或作為毛細管內壁的改性劑等，以改善分離效率。常用表面活性劑有：陰離子—十二烷基硫酸鈉（SDS）陽離子---十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）兩性離子---N,N’二甲基胺-3-丙烷-1-磺酸第二十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三23手性選擇劑在操作緩沖液中加入少量手性試劑可以實現手性分離。常用的手性試劑有：環糊精、冠醚、膽汁鹽等選擇手性試劑的種類、濃度或添加醇類、表面活性劑、金屬離子等可提高選擇性 第二十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三24溫度與毛細管內壁改性溫度——恒溫是消除焦耳熱的主要目的，但溫度也可作為一個優化分離的參數。通過調節溫度來改變溶液黏度、EOF和分析時間，以達到分離目的毛細管內壁改性——在分離生物大分子物質如蛋白質時，由于它們可被毛細管內壁強烈吸附,使分離效率大大降低。需對毛細管內壁改性：永久性改性——硅烷化動力學去活——操作緩沖液中加改性劑第二十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三25例氯芐律定對映體在家兔體內藥代動力學研究電泳條件：羧甲基環糊精衍生物(CM--CD)為手性拆分劑,最佳濃度5mmol/L毛細管柱48cm58m75mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH2.3）UV檢測波長200nm電遷移進樣(20kV16s)電壓20kV,柱溫20C第二十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三26討論：用酸性緩沖液體系，有效控制了毛細管內電滲流電遷移進樣可以消除血漿中酸性或中性內源性物質的干擾，使被測物有選擇地進樣采用柱上場放大堆積濃集樣品，在進樣前先在毛細管進樣口引入一個短的稀緩沖液水柱，因樣品離子的電泳速度與電場強度成正比，故使樣品塞中離子堆積在高濃度緩沖液界面上從結構看，本品手性碳藏于四環體系中，用一般的CD難以分離兩對映體，衍生酸性羧甲基后可與藥物的堿性基團發生靜電吸引，有利于手性識別第二十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三27膠束電動毛細管色譜（MECC或MEKC）MECC是電泳技術與色譜技術的交叉，也是唯一既能分離中性物質又能分離帶電組分的電泳技術。把表面活性劑加到緩沖液中，在表面活性劑的臨界濃度以上，單個表面活性劑之間聚集形成膠束。疏水性一端聚在一起朝向里，帶電荷的一端則朝向緩沖液第二十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三28MECC的作用原理表面活性劑分子和膠束通常是帶電的，以與EOF相同或相反的方向移動，但EOF的移動速度一般較膠束快

第二十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三29選擇性與分離度通過選擇不同的表面活性劑，改變緩沖液濃度、pH值和操作溫度，使用添加劑（尿素、金屬離子、手性試劑），加入有機修飾劑（甲醇、乙腈、異丙醇）等來控制溶質與膠束之間的相互作用，以提高色譜的選擇性在分離中性物質時，所有溶質都在t0與tm之間流出。親水性溶質隨EOF流出，被膠束完全保留的溶質隨膠束流出?？刂茥l件，采用中等程度的EOF和高遷移率的膠束，以擴大時間窗口，提高分離度第二十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三30時間窗口

t0

tR1tR2tR3

tm膠束EOF

t0

tm溶質中性溶質的流出時間窗口示意圖第三十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三31例1

兔血漿中氟比洛芬的測定電泳條件：75m100cm毛細管柱分離電壓30kV,溫度30C°虹吸進樣30sUV檢測波長254nm分離緩沖液為20mmol/L硼砂含25mmol/LSDS,pH9.02討論:硼砂緩沖液中加入SDS可包裹血漿中蛋白質，減少蛋白質對分離測定的干擾和對柱的污染空白血漿血樣內標第三十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三32例2高效毛細管電泳法測定注射用水溶性維生素的含量

采用膠束電動毛細管色譜法，分離分析注射用水溶性維生素制劑中VB1、VB12、VB6、VC、煙酰氨、葉酸、D-生物素、核黃素磷酸鈉、泛酸鈉9種成分電泳條件：未涂層熔融石英毛細管(67cm×50m，有效長度55cm)運行緩沖液為50mmol/LSDS-50mmol/L的硼酸鈉（pH8.33）檢測波長214nm壓力進樣（6.89KPa×10s）運行電壓15.0kV；毛細管柱溫25℃第三十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三33分析前毛細管處理每天分析之前，分別依次用1mol/L氫氧化鈉溶液、高純水、運行緩沖液沖洗5,10,10min每次分析之間分別用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、高純水、運行緩沖液沖洗毛細管3,5,5min第三十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三34測定方法取約1.5g的內容物，精密稱定，置于10ml量瓶中，用水沖洗瓶內壁，洗液與樣品合并，加水溶解并稀釋至刻度，混勻。用0.22m微孔濾膜過濾后，在上述電泳條件下進樣，記錄維生素B12和D-生物素的峰面積另精密量取上述樣品溶液1.0ml,置于100ml量瓶中，加水稀釋至刻度、搖勻，同法測定，記錄VB1,VB6,VC、煙酰氨、葉酸、核黃素磷酸鈉、泛酸鈉的峰面積，按外標法計算樣品含量第三十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三35測定結果測得各種成分按標示量計算的百分含量（%）在97.5±0.9到103.8±0.7之間（n=3）制劑中9種成分的毛細管電泳圖如下：1-煙酰氨；2-VB6；3-D-生物素；4-核黃素磷酸鈉；5-VB12；6-VC；7-泛酸鈉；8-葉酸；9-VB1混合對照液制劑第三十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三36毛細管電色譜（CEC）將HPLC中的固定相填充到毛細管中作為固定相，以電滲流為流動相的驅動力，利用樣品與固定相的相互作用的差異而達到分離HV分離柱檢測器分流控制閥反壓閥高壓電源電極第三十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三37例氟西汀和西替利嗪對映體的雙動態吸附毛細管電色譜手性分離以SO3--CD為手性選擇劑，海美溴銨(HDB)為陽離子表面活性劑，在Tris-H3PO4(pH3.0)的體系中分離了氟西汀和西替利嗪對映體色譜條件毛細管柱35cm50m,有效長度30cm壓力進樣：13.8kPa4s；分離電壓15kV紫外檢測210nm；分離柱溫25C第三十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三38討論采用HDB作添加劑使形成雙動態涂層，反轉電滲流，采用正極檢測，大大縮短分析時間在20mmol/LTris-H3PO4(pH3.0)條件下，HDB含量0.1g/L，SO3--CD20mmol/L，氟西汀和西替利嗪對映體在較短的時間內達到良好分離pH2時石英毛細管壁的硅羥基不解離，即使加入HBD也無法形成雙動態吸附。當pH增加到3時，硅羥基發生解離后而帶負電，帶正電的HBD通過靜電作用在柱內形成第一動態涂層，而后再靜電吸附一層負電性的SO3--CD，雙動態吸附的形成導致分析物R值的增大第三十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三39例梯度加壓毛細管電色譜同時分離大黃提取液中5種蒽醌類化合物毛細管電色譜主要是以電驅動流動相為主要的分離模式，而壓力流驅動毛細管電色譜是以液相色譜泵為流動相的主要驅動力，它克服了僅靠電滲流驅動的一些限制因素，可方便地對流動相的組成、性質和流速進行調節，尤其是能夠實現流動相梯度洗脫，是毛細管電色譜法發展的重要方向第三十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三40色譜條件C18熔硅毛細管柱（27cm75m），有效長度20cm流動相A組成：醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=4.5)；流動相B組成：乙腈流動相流速0.08mL/min進樣閥定量進樣20nL在260nmUV柱上檢測-3kV電壓下，大黃酚、大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素和大黃酸5種成分得到最好分離效果第四十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三41AE為5種梯度（不加電壓）在上述C梯度條件下，改變電壓最佳分離結果第四十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三42多種色譜技術提供了不同的選擇性第四十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三43四、毛細管電泳儀裝置示意圖第四十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三44進樣進樣體積一般是不知道的，進樣量通常用壓力與時間或電壓與時間表示。（注意：樣品區帶的長度應不超過毛細管總長度的1%-2%）。方法有：流體力學方式在進樣端加氣壓在出口端抽真空利用虹吸現象第四十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三45虹吸抽真空流體動力加壓氣動進樣示意圖第四十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三46電動進樣用樣品管替換緩沖液管，施加電壓來完成進樣。這種進樣方式的進樣量取決于組分的電泳淌度，對于離子型組分有進樣歧視，遷移速度快的離子比遷移速度慢的離子進去得要多一些。第四十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三47毛細管熔融石英毛細管有效長度為50～75cm，總長度一般比有效長度多5～15cm，內徑為20～75m。毛細管使用前后需用堿液、緩沖液沖洗毛細管溫度的控制對于操作重現性很重要，常采用液體恒溫或空氣恒溫方式，前者比較有效，后者儀器裝置簡單、操作方便毛細管電泳所用高壓電源要能提供30kV的直流電壓和200～300A的電流。最好使用雙極性電源，能進行極性切換第四十七頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三48泡狀池示意圖光源檢測器毛細管電泳的檢測方式是采用柱上檢測，透光窗直接開在毛細管上，不存在死體積和組分混合而產生譜帶展寬現象第四十八頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三49五、毛細管電泳與其它技術聯用毛細管電泳與其它技術聯用拓寬了毛細管電泳的應用范圍。例不同電泳技術間的聯用（等速電泳與區帶電泳聯用，CITP-CZE）高效液相與毛細管電泳聯用（HPLC-HPCE）毛細管電泳與質譜聯用免疫分析與毛細管電泳聯用——毛細管電泳免疫分析。利用抗原抗體復合物與游離抗原、抗體在電泳行為上的差異，將毛細管電泳作為免疫分析的檢測手段第四十九頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三50例1：毛細管液相/毛細管電泳二維系統小承氣湯

uHPLC:EP-250-80-5-C18(A)CH3OH;(B)H2OMEKC:36cmx75um30mMSDS,8mMNaBr,5mMK2HPO421kv210nm第五十頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三51例2：二維毛細管電泳電化學檢測尿樣中的-阻斷劑設計制作了在柱電化學(EC)檢測池，用于在同一根毛細管中進行中心切割二維毛細管電泳(2D-CE)在線純化分離檢測尿樣中的6種-阻斷劑尿樣先在15mmoL/LNaAc緩沖液中進行毛細管區帶電泳(CZE)分離，帶正電荷的-阻斷劑與中性和帶負電荷的干擾物質分成不同區帶然后在檢測端施加13.8kPa壓力將干擾成分從毛細管入口端排出，同時將目標組分驅送到毛細管入口端第五十一頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三52二維毛細管電泳電化學檢測尿樣中的-阻斷劑最后在90mmoL/LNaAc-30mmoL/LSDS緩沖液中進行膠束電動毛細管色譜(MEKC)分離場放大樣品堆積(FASS)／膠束推掃在柱雙重富集技術不僅有效抵消壓力驅送過程中產生的區帶擴散，還可進一步壓縮樣品區帶，提高檢測靈敏度。第五十二頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三53CE-EC在柱檢測裝置為在柱EC檢測，制作了蝕刻場隔離接頭。距毛細管出口端1.5cm處，用刀將毛細管一側的聚酰亞胺涂層刮掉5mm，去掉涂層的部分毛細管放置在40％HF溶液中蝕刻3h形成一段多孔膜，在該處均勻涂敷一層醋酸纖維素漿，待凝固后，即形成只通過電流而無溶液泄漏的場隔離接頭。第五十三頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三54方法設計單純采用MEKC，尿中共存組分，如尿酸、抗壞血酸、氨基酸等對6種-阻斷劑測定有干擾根據6種-阻斷劑都是弱堿性化合物（pKa=8.7-9.7），在pH4.3的NaAc-HAc緩沖液中帶正電荷，電泳淌度與電滲流方向一致，在CZE條件下遷移較快，而部分干擾成分在該條件下為中性或陰離子化合物，遷移較慢。在90mmoL/LNaAc-HAc(pH4.3)緩沖液中，6種-阻斷劑與干擾成分得到分離第五十四頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三55MEKC與CZE分離色譜圖第五十五頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三562D-CE在線純化分離尿樣中-阻斷劑的方法毛細管內先充滿CZE15mmol/LNaAc-HAc緩沖液，10kV電動進樣10s，鼠尿樣品在l0kV下進行CZE分離。當工作電極檢測到-阻斷劑的信號時立即停止分離電壓；檢測端換為MEKC90mmol/LNaAc-HAc-30mmol/LSDS緩沖液，并在檢測端施加13.8kPaN2壓力，溶液以0.2cm/s的速度流向進樣端，干擾物質從進樣端排出毛細管，根據毛細管有效長度(59.5cm)和液流速度(0.2cm/s),-阻斷劑在298s時到達進樣端(為防止損失,290s時停止N2壓力);同時MEKC緩沖溶液進入毛細管中。進樣端換成MEKC緩沖溶液，-阻斷劑在10kV下進行MEKC分離。經一維CZE分離純化后，二維MEKC分離待測物時無干擾峰。第五十六頁，共六十二頁，編輯于2023年，星期三57雙重富集作用第二維分離第一維至第1個峰被檢出壓力驅送過程MEK