細胞在發生凋亡時，會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組DNA。基因組DNA斷裂時，暴露的3?OH可以在末端脫氧核昔酸轉移酶（TerminalDeoxynucleotidylTransfe「sse,TdT）的催化下加上熒光素（FITC）標記的dUTP（fluorescein-dUTP）?從而可以通過熒光顯微鏡或流式細胞儀進行檢測，這就是TUNEL法檢測細胞凋亡的原理。TUNEL法特異性檢測細胞凋亡時產生的DNA斷裂，但不會檢測出射線等誘導的DNA斷裂（和細胞凋亡時的斷裂方式不同）。這樣一方面可以把凋亡和壞死區分開，另一方面也不會把射線等誘導發生DNA斷裂的非凋亡細胞判斷為凋亡細胞。針對問題2（TUNEL法的實驗原理是什么？）：基本原理：對不同組織切片先增加細胞膜通透性，然后讓rTDT和bio標記的dUTP進入細胞內，在rTDT的輔助下dUTP與核斷裂的DNA3'-0H結合，再用HRP標記的鏈霉親和素與dUTP上的biotin結合（每個鏈霉親和素至少可以再結合3個biotin分子），最后用DAB、過氧化氫與SP士的辣根過氧化物酶HRP發生氧化、環化反應，形成苯乙腓聚合物而呈現棕褐色，最終通過計數每張切片上不同視野中TUNEL陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發生情況。1.TUNEL工作原理：簡單說就是一TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細胞在凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況。其原理是；生物素（biotin）標記的dUTP在脫氧核糖核昔酸末端轉移酶（TdT

■?WBBWMBM*?WaMMM■*■■?最新資料推■?WBBWMBM*?WaMMM■*■■?最新資料推?MHMMWsys=ssyEnzyme）的作用下，可以連接到凋亡細胞中斷裂的DNA的3*-0H末端，并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin.HRP）特異結合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺（DAB）的存在下，產生很強的顏色反應（呈深棕色），特異準確地定位正在凋亡的細胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計數凋亡細胞；由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-0H形成，很少能夠被染色。針對問題3（TUNEL實驗中幾個關鍵步驟是什么？）：1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min,再用二甲苯兩次5-10min;而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結合反應充分、均勻；2.把握好細胞通透的時間。一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用10?30min,幾um切片用短時間；幾十urn切片用長時間，通過摸索達到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進入胞內。3.適當延長TUNEL反應液的時間。一般是37度1h,你也可以根據你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至2h,但要結合你最終的背景著色。4.DAB顯色條件的選擇。一般DAB反應10分鐘左右，結合鏡下控制背景顏色，最長不超過30min;我不喜歡用promega公司提供的DAB液（桃紅色），不利于辨認棕褐色。5.PBS的充分清洗。我個人認為，在TUNEL反應后和酶標反應后的清洗應十分嚴格，可增加次數達5次，因為這些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。6?此外，內源性POD的封閉也十分關鍵。對于肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。針對問題5?細胞通透的原理、通透劑的濃度、解育時間及其配制方法?1.蛋白酶K是消化膜蛋白，從而起打孔作用，增加膜通透性，使「TDT酶、抗體易透過細胞膜進入細胞反應；2.蛋白酶K一般工作液濃度為20ug/ml,但濃縮液可配制1TOmg/mL可用PBS配制，也可用蛋白酶K緩沖液(100m何T「isHCIPH8.0+50mMEDTA);3.蛋白酶K反應時間一般為10-30min,具體時間長短與切片厚薄有關，4utri左右的片子可以用10min,但30um左右的可用30min,最終通過摸索最佳時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。1.抗原修復的原因是標本在甲醛等固定過程中，因發生蛋白交聯和甲醛的封閉作用使抗原性降低，可以通過抗原修復使抗原決定族充分暴露出來；2.免疫組化中經常使用抗原修復，因為它的原理主要是抗原和抗體反應，通過抗原修復使更多的抗原與抗體結合，避免假陰性結果；3.而TUNEL的原理是dUTP與斷裂的DNA土的3'OH結合，故不需抗原修復：4.第一次TUNEL反應只需37度反應仆，或者延長時間即可1.PROMEGA公司去年是40t要3300元（按100ul/片，實際可根據切片大小，加到30ul/pian）；而roche公司一般10t國內分裝1300元（同樣也是100/pian）；2.兩個公司試劑盒內均沒有PBS試劑，也不含DNase（以制作標準對照片）；3.我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24h后進行石蠟包埋、制片。此外，Promega公司在操作步驟中加了兩步4%PFA以固定組織，試劑盒內無PFA,但提供了配制方法。再次請教：1?我做TUNEL復染用蘇木素幾秒鐘，請問還用不用1%鹽酸究酒精分化了？2我想用羅氏的TUNEL試劑盒做熒光顯像，請問用什么封片，配方？針對你的問題，我分析如下：1.鹽酸酒精分化的目的：一方面是分色；另一方面是減弱過強的蘇木素核染色。所以你若把握好蘇木素著色，也可不分化。2.分化時間不能過長，否則陽性著色也褪色。3.一般熒光成像后可用高純度甘油封片即可，若需長期保存，也可用無色指甲油片周圍封固（必要性不大）。這是我的操作步驟（P「omegs公司），看完后就知道了：1.脫 最新資料推■?WBBWMBM*?WaMMM■*■■?44 ^* ”OM.八^*MMM?■■■*W ?MHMMW■?WBBWMBM*?WaMMM■*■■?sy ”s=s蠟：用二甲苯浸洗5minx2次；2.水化：用梯度乙醇（100%><5min、100%x3min、95%x3min、85%x3min、70%x3min、50%x3min）；3.浸洗；0.85%NaClx5min->PBS洗5min;4.固定：浸入4%多聚甲醛15min;5.浸洗：PBS5miz2次；6.細胞通透：用每片100ul20pg/mlProteinaseK處理組.織15（10-30）minRT;7.浸洗：PBS洗5min:8.固定：浸入4%多聚甲醛5min;9.浸洗:PBS5minx2次；10.平衡：｝口100ul平衡液，濕盒平衡10（5-10）min;11.制備TUNEL反應混合液：處理組用1MlrTdT+1訓生物素標記的dUTP+98ul平衡液混勻；而陰性對照組不加「TdT,改為三蒸水；陽性對照組先加入100pIDNase1緩沖液孵育5min,甩掉液體后再加100ulDNase1（10U/ml）酶切10min,用去離子水沖洗4次，PBS浸洗5min,

后面步驟從第10步開始。12.標記反應：加lOOpITUNEL反應混

合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒中反應37°Cx1ho13.終止反應：浸入2xSSC15min;14.浸洗：PBS5minx3次；15.封閉POD:浸入0.3%H2O215min;16.浸洗：PBS5minx3次：17.酶標反應:加100ulstreptavidin標記HRP（按1:500PBS稀釋）30min;18.浸洗：PBS5minx3次；19.DAB顯色（避光）：力U100ulDAB混合液（50ulDAB+50ulDAB底物緩】■中液+50ulH2O220x4-950ul三蒸水）10min左右，鏡下出現淺棕色背景時。20.用去離子水沖洗幾況21.用蘇木素復染，3s左右后立即用自來水沖洗。梯度酒精脫水（50、70、85、95、100.100%各1min）、二甲苯透明1minx2次、中性樹膠封片。1、蛋白酶k的目的是通透細胞膜和核膜，從而使反