DNA泳見問分

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個收整，做業途DNA電泳常見問凝膠電操作注意事1、瓊糖：不同廠家、不同批號的瓊脂糖，其雜質含量不同，影響DNA的遷移及熒光背景的強度，應有選擇地使用。2、凝的制備：凝膠中所加緩沖液應電泳槽中的相一致，溶化的凝膠應及時倒入板中，避免倒入凝固結塊。倒入板中的凝膠應避免出現氣泡，以免影響電泳結果。3、電泳緩沖液：為保持電泳所需的子強度和應經更電緩沖。4、樣品加入量一情況下0.5cm寬梳可加0.5DNA量加量的多少依據加樣孔大小及中片段的數量和大小而定當樣孔大時樣上樣量應相應加大,否則會造成條帶淺甚至辨認不清;反則應適當減少加樣量但上樣過會成樣超，而致尾彌，于較的DNA此象明顯5、DNA樣中鹽濃度會影響的移率，平行對照樣品應使用同樣的緩沖條件以消除這種影響。6、遷率取決于瓊脂糖凝膠的濃度遷移分子的形狀及大小采用不同度的凝膠有可能分辯范圍廣泛的分子，制備瓊脂糖凝膠可根據分子的范圍來決定凝膠的濃度。小片段DNA的測應采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，以提高分辨率。選的實驗材料要新鮮，處理時間不易過長加入細裂緩液，胞須勻散以減DNA團形。提的不溶解：不純，含雜質較多；加溶解液太少使濃度過大。沉淀物太干燥，也將使溶解變得很困難。10.電檢時DNA成布：作不；染酸等11.分光光度分析的小于1.8；不純，含有蛋白等雜質。在這種情況下，應加入SDS至終濃度為，重復步驟～。12.酚/氯/異戊醇抽提后，其上液太黏不易吸取：含高濃度的DNA，加大抽提前緩沖液的量或減少所取組織的量DNA電泳見問題析之一1請問制丙酰凝電膠，凝是TEMED還過硫銨膠時很如解？過硫酸銨提供驅動丙烯酰胺和雙丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通催化過硫酸銨形成自由基而加速它倆的聚合。膠聚合時間長可能是TEMED失了，過硫酸銨固體時間過久也失效的。一個讓PAGE膠快聚合的方法：不要先配AP（過硫酸銨）溶，因為AP很易變質。在保證TEMED和AP質的情況下，每次配膠時，直接稱一定量的粉溶入液體狀態的PAGE中這樣可以保證AP的催化能力，而且可以多加一點。配25ml的PAGE膠加0.03克AP劑，最后加入25ulTEMED，20分左右就可以凝固（當然這個時候拔梳子，會有少量未凝固的PAGE在里形成絲狀干擾，使加的樣品看起來不太漂亮，但一般不影響跑膠效果和條帶的形狀和位置）。2DNA泳怎是曲？1、配膠的緩沖液需要和電泳緩沖液不是同時配制.最好是同時配制.泳時緩沖液高過液面1－2mm3

個收整，做業途即可。2、電時壓過,可以在電泳前15鐘用較低電壓3V/cm),等帶出孔后比較漂.然后再調電壓。3、上時量慢慢加,等樣品自然沉降再加電壓。3跑出DNA帶模？1、DNA降：免核酸酶污染。2、電緩液陳:電泳緩沖液多次使用后，離子強降低值升，緩沖能減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液。3、所電條件不合:電泳時電壓不應過20V/cm，溫度＜℃巨大DNA鏈泳，溫度應15；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力。4、DNA上量多：減少凝膠中DNA上量。5、DNA樣鹽高：電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽。6、有白染：電泳前酚抽提去除蛋白。7、DNA變：泳前勿加熱，用NaCl緩液稀釋。4有不則遷1、對cos位復性：電泳前于65℃加熱5分，然后在冰上冷卻分。2、電條不合適：電泳電壓不超過20V/cm；溫度30℃經常更換電泳緩沖液。3、DNA變：20mMNaClBuffer稀，電泳前勿加熱。5跑出DNA條帶弱無？1、DNA的上樣不夠：增加DNA的上樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高上樣量可適當降低。2、DNA降：免DNA核酸酶污染。3、DNA走凝：縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度。4、對EB染的，用源不合??用短波長254nm）的紫外光源。6跑出DNA帶缺不整怎回1、如是DNA帶出凝膠，可以縮短電泳時間或降低電壓或增強凝膠濃度。2、分大相近的DNA帶易分辨?加電泳時間，核準正確的凝膠濃度。3、DNA變：泳前請勿高溫加熱DNA，以20mMNaClBuffer稀。DNA鏈大，常規凝膠電不合?在脈沖凝膠電泳分析。7做電泳后電，目基是489BP的，果次切回后跑泳變500多，快到600？什？有時只靠電泳結果判斷是不準確的，同樣的片段每次跑的遠近會有不同。有經驗顯示目的片段是1300多果跑到1000的marker面去了來證實片段沒有問題做的一個片段也是這樣490BP.理論上兩個條帶一樣，可是PCR結顯示就是大小不一致。然后回收以后的檢測結果又全部都一樣了，后來又拿去做了下一個測序，才知道根本沒有問題。：為么marker條帶常模，法別體帶A：出現上述情況，可能有以下個原因：1.marker條出現了降解。請保在使用過程中避免核酸酶污染2.電泳沖液陳舊。電泳緩沖液多次使用后，離子濃度降低，上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經常更換電泳沖液；4

個收整，做業途3.電條件不合適。電泳時電壓應不超過20V/cm，度應低于℃4.marker上量過多請根據說明書選用合適上樣量；5.凝質不好。建議使用質量較好的瓊脂糖；此外，凝膠凝固不均勻也會導致條帶模糊。：為么marker條帶現不則條（啞狀）A：出現上述情況，多與以下幾原因有關電緩沖液陳舊。老化的電泳緩沖液離子濃度降低值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果，建議經常更換電泳緩沖液電泳件不合適。電泳電壓應不超過20V/cm電太可能會致條帶現規現象外膠量以凝冷時固均也導致該現象出現。為么marker條帶非弱者本有帶A：出現上述情況可能是1.marker上樣量較低，可適當增加上樣量2.凝膠質量較差或凝膠固不均勻也會導致電泳條帶弱或根本沒有條帶3.電時間過長導致marker條跑出凝膠，可縮短電時間，降低電壓，增加凝膠濃度。：為么marker缺帶？A：對于含有較小片段的marker，果出現缺帶現象，可能是因為：1.小帶跑出凝膠或分子量大小非常相近的條帶不易辨認所致，可適當縮短電泳時間，降低電，同時增加凝膠濃度2.凝中EB含量過低，導致大片段結合量太或沒有，在紫外光下亮度太低，可適當增加EB用。問題DNA帶模糊

適

原因DNA解電泳緩沖液陳舊所用電泳條件不合DNA上量過多DNA樣鹽過高有蛋白污染DNA變

解決辦法避免核酸酶污染電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低pH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。建議經常更換電泳緩沖液電泳時電壓不應超過20V/cm溫度＜℃巨大DNA鏈泳，溫度應＜15℃；核查所用電泳緩沖液是否有足夠的緩沖能力減少凝膠中DNA樣量電泳前通過乙醇沉淀去除過多的鹽電泳前酚抽提去除蛋白電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩液稀釋DNA不規則DNA帶移帶弱或無DNA帶

對于λ/Hindcos位復性電泳條件不合適DNA變DNA的樣量不夠DNA降DNA走凝膠對于染色的

電泳前于65℃加熱5分，然后在冰上冷卻5分電泳電壓不超過20V/cm溫度30℃經更電泳緩沖液以20mMNaClBuffer稀，電泳前勿加熱增加的樣量；聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度稍高，上樣量可適當降低避免的酸酶污染縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度應用短波長（254nm）的紫外光源5

個收整，做業途DNA帶缺失

，用光源不合小DNA帶走出凝膠分子大小相近的DNA帶易分辨DNA變性

縮短電泳時間，降低電壓，增強凝膠濃度增加電泳時間，核準正確的凝膠濃度電泳前請勿高溫加熱DNA鏈，以20mMNaClBuffer稀釋DNADNA鏈大

常規凝膠電泳不合適

在脈沖凝膠電泳上分析問題DNAMarker降解DNAMarker無法正確分離條帶黯淡條帶模糊或彌散條帶缺失

可能原因核酸酶污染保存不當瓊脂糖質量差電泳緩沖液多次使用后失效核酸濃度過低核酸降解DNA條帶被示蹤染料掩蓋電泳緩沖液多次使用后失效核酸部分降解核酸樣品純度差，含有DNA結合蛋白或高濃度的鹽份電壓過低，電泳時間過長染色時間過長或拍照前放置過久，DNA條帶彌散DNA條帶分子量過大分子量接近的DNA條帶沒有分開電泳緩沖液使用不當電泳時間過長或電壓過高，DNA走出凝膠電極插反，DNA走出凝膠6

解決方法每次吸取時更換滅菌槍頭將泳緩沖液帶入管中；用后密閉4°存4°或-20°C保存，避免多次反復凍融；不可加熱使用質量可靠的瓊脂糖制膠更換緩沖液增加上樣量使用不含核酸酶的試劑和耗材制樣品提高上樣量免使用與目的片遷移率相同的示蹤染料更換緩沖液使用不含核酸酶的試劑和耗材制樣品酚/仿抽提乙醇沉淀去除蛋白、鹽份等雜質根據凝膠大小和電泳緩沖液類型用適當的電壓進行電泳電泳結束后及時觀察、拍照使用脈沖凝膠電泳選擇適當的凝膠濃度進行電泳SD和TBE緩沖液適于分析較小分子量的DNA片段片段分子不完全分離；TAE沖液不適于分離很小的DNA片段縮短電泳時間，調整電壓正確連接電極方向

個收整，做業途條帶大小不正確帶型異常

核酸降解或形成聚合物λDNA酶切Marker的cos位點復性相同分子量的DNA片段由于結構或序列的差異而有不同的遷率梳子變形，點樣孔不在同一水平線上不同樣本的上樣條件不同上樣量過大或過小核酸樣品純度差，含有DNA結合蛋白或高濃度的鹽份電泳緩沖液未完全浸沒凝膠電壓過高或電泳時間過長致使凝膠過熱和變凝膠中加入EB造成染色不均凝膠中有氣泡或污染物點樣孔質量差

加熱處理或重新制備樣品電泳前C加熱分鐘，冰上冷卻5分鐘以后再上樣判斷DNA