細胞破碎和生化分離技術演示文稿當前1頁，總共68頁。（優選）細胞破碎和生化分離技術當前2頁，總共68頁。固液分析技術當前3頁，總共68頁。過濾過濾就是利用多孔性介質截留固液懸浮物中的固體顆粒，從而實現固液分離的方法。深層過濾濾餅過濾濾餅阻力主要由菌種和發酵條件決定當前4頁，總共68頁。改善過濾性能的方法過濾操作的兩個目標：加快過濾速率、提高過濾質量。絮凝助濾劑反應劑酶解當前5頁，總共68頁。過濾設備及選擇依據推動力；常壓過濾機、加壓過濾機、真空過濾機依據設備構造：板框壓濾機、鼓式真空過濾機、加壓葉濾機當前6頁，總共68頁。微濾微濾是一種以多孔細小薄膜為過濾介質，以壓差為推動力，使不溶物質濃縮過濾的操作。微濾分離過程的三階段。影響分離速率的因素主要有操作形式、流速、壓力和料液濃度。微濾技術有著廣泛應用和眾多的優點。當前7頁，總共68頁。微濾的操作模式無流動操作模式和錯流過濾操作模式當前8頁，總共68頁。微濾設備板框式膜過濾器管式膜過濾器中空纖維式膜分離器螺旋卷式膜分離器當前9頁，總共68頁。離心技術一、離心分離的基本原理二、離心機的類型三、離心方法四、離心條件的確定五、影響離心效果的主要因素與控制當前10頁，總共68頁。優點：分離速度快，分離效率高、液相澄清度好；缺點：與過濾設備相比，設備投資高、能耗大、離心產生的固體濃縮物和過濾產生的濃縮不同。通常情況下離心只能得到一種較為濃縮的懸浮液或漿體。而過濾可獲得的水分含量較低的濾餅。離心分離當前11頁，總共68頁。離心的原理對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當固體顆粒細小而難以過濾時，發酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。離心分離：是借助于離心機旋轉所產生的離心力，使不同大小、不同密度的物質分離的技術過程。當前12頁，總共68頁。當前13頁，總共68頁。差速離心當前14頁，總共68頁。離心機的類型據分離方式分：沉降式離心機、過濾式離心機據操作方式分：間歇式(分批)離心機、連續式離心機據轉速分：常速離心機（低速離心機）、高速離心機、超速離心機據設備結構特點分：管式、蝶式、螺旋式……

當前15頁，總共68頁。按速度和離心力：1、常速離心機最大轉速8000rpm(r/min)，相對離心力(RCF)104g以下，用于細胞、菌體和培養基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104～2.5×104rpm，相對離心力104～105g，用于細胞碎片、較大細胞器、大分子沉淀物等分離；3、超速離心機

轉速2.5～8×104rpm，相對離心力5×105g；用于DNA、RNA蛋白質、細胞器、病毒分離純化；檢測純度；沉降系數和相對分子量測定等。離心機的種類與用途當前16頁，總共68頁。離心方法◆對于常速離心機和高速離心機，由于所分離的顆粒大小和密度相差較大，只要選擇好離心速度和離心時間，就能達到分離效果；◆如果希望從樣品液中分離出2種以上大小和密度不同的顆粒，需要采用差速離心方法。◆而對于超速離心，則可以根據需要采用差速離心、密度梯度離心或等密梯度離心等方法。當前17頁，總共68頁。大容量冷凍離心機當前18頁，總共68頁。據設備結構特點分1斜角式2平拋式3管式4蝶片式5螺旋式6多室式當前19頁，總共68頁。斜角式離心機是一類結構最簡單的實驗室常用離心機，指離心管腔與轉軸成一定傾角的轉子；角度越大，沉降越結實，分離效果越好，角度越小，顆粒沉降距離短，沉降速度快，但分離效果差。顆粒在角轉子中沉降時，先沿離心力方向撞向離心管，然后再沿管壁滑向管底，因此管的一側會出現顆粒沉積。當前20頁，總共68頁。當前21頁，總共68頁。

平拋式離心機平拋式離心機一類結構簡單的實驗室常用的低中速離心機，轉速一般在3000-6000rpm。轉子活動管套內的離心管，靜止時垂直掛在轉頭上，旋轉時隨著轉子轉動，從垂直懸吊上升到水平位置（約200—800rpm）。顆粒在水平轉子中的沉降是沿管子軸向移動。樣品便于收集受振動和變速攪亂后對流現象小，但轉頭結構復雜，最高轉速相對要低容量也小一些。

當前22頁，總共68頁。平拋式離心機轉子當前23頁，總共68頁。管式離心機具有一個細長而高速旋轉的轉鼓，轉鼓內裝有縱向平板，其下部有進料口。上部兩側有重液相和輕液相出口(對液液分離而言)。分為液液分離的連續式管式離心機和液固分離的間歇式管式離心機。管式離心機當前24頁，總共68頁。液液分離管式離心機液固分離管式離心機當前25頁，總共68頁。液固分離管式離心機待處理的物料在一定壓力（3×104Pa左右）下由進料管經底部空心軸進入鼓內，靠擋板分布于鼓的四周，并使料液迅速達到與轉鼓相同的角速度。轉鼓帶動物料高速旋轉，在離心力下，懸浮液沿轉鼓內壁向上流動的，料液在離心力場的作用下因其密度差的存在而分離。澄清后的液相流動到轉鼓上部的排液口排出。比重大的固體微粒逐漸沉積在轉鼓內壁形成沉渣層，達到一定數量后，停機人工清除。當前26頁，總共68頁。管式離心機特點：結構簡單，可提供較大離心力，轉速高，效果好。管狀離心機可以冷卻，有利蛋白質分離對于間歇操作式，須定時拆卸、清洗適用于分離乳濁液及含細顆粒的稀懸浮液，適用于固體含量低于1%，顆粒度小于5微米，黏度大的懸浮液澄清或固液兩相密度差較小的分離。當前27頁，總共68頁。碟片式離心機是在管式離心機的基礎上發展起來的，在轉鼓中加入了許多重迭的碟片，縮短了顆粒的沉降距離，提高了分離效率。是生物工業中應用最為廣泛的一種離心機有一個密封的轉鼓，內裝十至上百個錐頂角為60-100゜錐形碟片。碟片間的距離一般為0.5-2.5mm。當前28頁，總共68頁。當前29頁，總共68頁。碟片式離心機工作原理當懸浮液在動壓頭的作用下，經中心管流入高速旋轉的碟片之間的間隙時，便產生了慣性離心力，其中密度較大的固體顆粒在離心力作用下向上層碟片的下表面運動，而后在離心力作用下被向外甩出，沿碟片下表面向轉子外圍下滑，而液體則由于密度小，在后續液體的推動下沿著碟片的隙道向轉子中心流動，然后沿中心軸上升，從套管中排出，達到分離的目的當前30頁，總共68頁。碟片式離心機類型人工排渣的碟片離心機碟片上不開孔，只有一個清液排出口。沉積在轉鼓內壁上的沉渣，間歇排出。只適用于固體顆粒含量很少的懸浮液。噴嘴排渣的碟片離心機：當固體顆粒含量較多時，可采用具有噴嘴排渣的碟式離心沉降機。在有特殊形狀內壁的轉鼓壁上開設若干噴嘴活門（活塞）排渣的碟片離心機這是近年來開發的機型，它和相同直徑的活塞機相似，其速度可增加23%~30%,可用于酶制劑，疫苗和胰島素等生產中分離物的澄清。當前31頁，總共68頁。螺旋卸料沉降離心機有立式和臥式兩種臥螺機是一種全速旋轉，連續進料，分離和卸料的離心機。最大離心力強度可達6000rpm操作溫度可達300℃操作壓力一般為常壓常用于胰島素，細胞色素，胰酶等的分離。螺旋式離心機當前32頁，總共68頁。螺旋式離心機工作原理轉鼓與螺旋輸送器以一定差速同向高速旋轉(后者慢)，懸浮液通過螺旋輸送器的空心軸進入機內中部，由進料管連續引入螺旋內筒，加速后進入轉鼓。在離心力場作用下，固相物沉積在轉鼓壁上形成沉渣層。輸料螺旋將沉積的固相物連續不斷定推至轉鼓錐端，經排渣口排出機外，較輕的液相物則形成內層液環，由轉鼓大端溢流口連續溢出轉鼓，經排液口排出機外。當前33頁，總共68頁。1、差速離心2、密度梯度離心3、等密梯度離心離心方法當前34頁，總共68頁。1、差速離心

差速離心是指采用不同的離心速度和離心時間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。

※當前35頁，總共68頁。2、密度梯度離心

（1）定義：密度梯度離心是樣品在密度梯度介質中進行離心，使沉降系數比較接近的物質分離的一種區帶分離方法。

（2）梯度介質：為了使沉降系數比較接近的顆粒得以分離，必須配制好適宜的密度梯度系統。密度梯度系統是在溶劑中加入一定的溶質制成的。這種溶質稱為梯度介質。常用的梯度介質有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統，其適用范圍是：蔗糖濃度5～60%，密度范圍1.02～1.30g/cm3?！斍?6頁，總共68頁。（3）不同密度梯度條件下物質的分離離心后形成不同大小不同形狀、具有一定沉降系數差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清楚的不連續區帶。當前37頁，總共68頁。密度梯度離心法當前38頁，總共68頁。（4）密度梯度的制備：密度梯度一般采用密度梯度混合器進行制備?！裘芏忍荻然旌掀饔少A液室、混合室、電磁攪拌器和閥門等組成，如圖。當前39頁，總共68頁?！芏忍荻然旌掀鳟斍?0頁，總共68頁。（4）所形成密度梯度的類型：制備得到的密度梯度可以分為線性梯度、凹形梯度和凸形梯度等。

※當前41頁，總共68頁。（5）密度梯度的形成

兩種不同濃度的溶液（蔗糖溶液）以不同比例混合形成?！斍?2頁，總共68頁。3、等密度梯度離心

當欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質的密度范圍內時，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上飄浮，只要時間足夠長，就可以一直移動到與它們各自的浮力密度恰好相等的位置（等密度點），形成區帶。這種方法稱為等密梯度離心，或稱為平衡等密度離心。

※當前43頁，總共68頁。五、影響離心效果的主要因素與控制1、樣品的理化性質2、離心分離設備3、離心條件的選擇（1）離心力和相對離心力（2）離心時間和K因子（3）離心操作溫度當前44頁，總共68頁。細胞破碎技術細胞破碎的目的：使細胞壁和細胞膜受到不同程度的破壞（增大通透性）或破碎，釋放其中的目標產物。機械法非機械法珠磨法、壓榨法高壓勻漿、超聲破碎、撞擊法固體剪切作用液體剪切作用1）酶溶法2）化學法3）物理法干燥處理溶胞作用超臨界細胞破碎當前45頁，總共68頁。機械方法破碎1）珠磨法（beadmilling）：細胞懸浮液與極小的研磨劑如玻璃小珠、石英砂等一起高速攪拌，細胞與研磨劑之間相互碰撞、剪切，使細胞達到某種程度破碎，釋放內含物可采用間歇式或連續操作珠磨機增加裝珠量、延長破碎時間、提高轉速等手段可提高破碎率→總能耗增加且須注意換熱適用于多數微生物細胞，esp.有大量菌絲體的微生物（藻類和真菌菌絲）和質地堅硬（亞細胞器）的微生物細胞當前46頁，總共68頁。高壓勻漿法

破碎原理：利用高壓使懸浮液通過針形閥，從閥座與閥之間的環隙高速噴出后撞擊到碰撞環上，細胞在受到高速撞擊后，急劇釋放到低壓環境破碎作用力：突然減壓和高速沖撞閥座閥撞擊環操作參數少且易于確定，實驗室及工業生產中均可適用于酵母和多數細胞的破碎對易造成堵塞的團狀或絲狀真菌及一些易損傷勻漿閥、質地堅硬的亞細胞器一般不適用當前47頁，總共68頁。超聲波破碎機理：高于20kHz的超聲作用下產生的空穴化作用，空穴由于超聲波的沖擊而產生和閉合，產生極大的沖擊波和剪切力。缺點：A、影響因素多，細胞種類、濃度和處理時間、探頭材料和形狀；B、有效能量的利用率低；C、產熱大，需控溫；D、不易放大，僅應用于實驗室規模的細胞破碎。當前48頁，總共68頁。機械破碎法總結以上幾種機械破碎法的作用機理不盡相同，有各自的適用范圍（包括菌體細胞、細胞發酵液的特性）和處理規模（實驗室或工業用）方法珠磨高壓勻漿超聲破碎使用規模實驗室、工業用實驗室、工業用實驗室適用對象酵母、藻類及絲狀真菌酵母菌、細菌細菌當前49頁，總共68頁。細胞物理破碎方法1）滲透壓沖擊法（osmoticshock）最為溫和的一類細胞破碎方法，適用于易于破碎的細胞，eg.動物細胞和革蘭氏陰性菌。細胞于高滲介質中，脫水達到平衡后，迅速將其轉置于低滲透壓的水或緩沖液中，水進入細胞使胞壁和胞膜破裂2）凍結－融化法（FreezingandThawing）細胞急劇凍結后在室溫緩慢融化，反復操作多次使細胞破壞，對于存在于細胞質周圍靠近細胞膜的胞內產物釋放較為有效當前50頁，總共68頁?；瘜W法破碎用某些化學試劑溶解細胞壁或抽提細胞中某些組分酸堿、某些表面活性劑及脂溶性有機溶劑都可改變細胞壁或膜的通透性，從而使內含物有選擇性地滲透出來→化學滲透法利用酸堿調pH；有機溶劑甲苯；表面活性劑十二烷基磺酸鈉、TritonX-100；螯合劑乙二胺四乙酸EDTA等優點：細胞外型完整、碎片少、粘度低，料液易澄清A、價格昂貴，引起新的污染；B、一般只有有限的破碎，比機械破碎速度低、效率差，常需與機械法連用。當前51頁，總共68頁。生物法破碎原理：利用溶解細胞壁的酶處理菌體細胞，使細胞壁受到部分或完全破壞后再利用滲透壓沖擊等方法破壞細胞膜，進一步增大胞內產物的通透性溶菌酶lysozyme適用于G＋的細胞壁，若配合EDTA、TritonX-100則可有效作用于G－的胞壁；真核細胞需用不同的酶：酵母細胞需用葡聚糖酶或甘露聚糖酶；破壞植物細胞壁需用纖維素酶優點：產品釋放的選擇性高、產品破壞少、對溫度及pH等外界條件要求低，不殘留細胞碎片等，不同的細胞壁結構決定了需要不同的酶當前52頁，總共68頁。生物法破碎自溶：通過調節溫度、pH或添加有機溶劑等激活劑，誘使細胞產生溶解自身酶的方法溶菌酶是酶法溶胞中最常用的方法但其高成本和有限的適用性使該法不可能實現大規模應用，esp.G-的酶溶更受到了限制當前53頁，總共68頁。超臨界細胞破碎技術超臨界流體：溫度和壓力處于臨界條件之上的流體，具有類似于氣體的性質（低黏度）和類似于液體的高密度，具有較好的流動性能、傳質性能和溶解性能利用超臨界CO2做介質，高壓CO2易于滲透到細胞內。突然降壓后，因細胞內外較大的壓差使細胞急劇膨脹而發生破裂可破碎細胞壁較厚的細胞如酵母甚至對粘稠的酵母漿都有很好的破碎效果當前54頁，總共68頁。當前55頁，總共68頁。破碎方法的選擇選擇的一般原則A、提取產物在細胞質內，用機械法破碎B、提取產物在細胞膜附近，用化學法C、提取產物與細胞膜或細胞壁結合，可采用化學法和機械法結合的方法破碎過程中應注意的問題A、多種破碎方法相結合可產生很大優勢B、對下游分離技術的影響：破碎顆粒清除，產物分離純化C、在上游發酵階段，考慮到發酵過程和環境對破碎難易程度影響D、菌種的培育及改造，胞內產物胞外產物當前56頁，總共68頁。胞內產物的選擇性釋放細胞破碎和雙水相萃取技術結合利用噬菌體裂解細胞電脈沖提取法分步、分級提取法當前57頁，總共68頁。雙水相分離技術雙水相萃取可以同時完成細胞碎片去除和產品純化任務。雙水相萃取技術設備簡單、容易放大，但需要較多的原料。當前58頁，總共68頁。膨脹床吸附技術通過改進吸附劑本身的物理性質和通過對色譜柱進行精心設計，得到了穩定、無返混的流化床，讓固體顆粒通過填料層，同時以填充床的模式吸附目標產物。優點：減少操作步驟、提高產品收率、降低純化費用和資本投入。當前59頁，總共68頁。層析柱對形成穩定的膨脹床有很大影響，其底部和上部分別有一個液體分布器和床層調節器。選擇合適的吸附劑對產物吸附和維持合適膨脹度十分重要，選擇時應注意：1、吸附劑應具有良好的吸附性能和流態化性能。2、在粒度和密度上要有差異。當前60頁，總共68頁。膨脹床的操作五個步驟：當前61