第七章基因的定點誘變演示文稿當(dāng)前1頁，總共49頁。第七章基因的定點誘變當(dāng)前2頁，總共49頁。突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。經(jīng)典的方法是根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)的方法鑒定相應(yīng)的基因。當(dāng)前3頁，總共49頁。傳統(tǒng)的誘變方式利用能夠修飾DNA分子的化學(xué)或物理誘變劑處理生物體射線（紫外線、X射線、γ射線等）化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS、亞硝基胍等）當(dāng)前4頁，總共49頁。不足：生物體的任何基因都可能發(fā)生突變，目的基因突變率較低，篩選困難即使獲得期望表型的突變體，無法保證突變確實發(fā)生在目的基因上在基因克隆和核酸測序技術(shù)發(fā)展之前，無法知道基因中突變的位置和性質(zhì)當(dāng)前5頁，總共49頁。Directedevolution

（定向進化或直接進化）

對目的基因人為制造大量突變，然后按照特定的需要和目的，給予選擇壓力，反復(fù)誘變，循環(huán)篩選，將滿足要求的、適合特定目的的分子篩選出來，獲得滿足需要的性能改良的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)在試管中分子水平的模擬進化。當(dāng)前6頁，總共49頁。基因直接進化的步驟突變基因突變庫的建立篩選

基因突變庫的活體或離體篩選當(dāng)前7頁，總共49頁。Keystepsofatypicaldirectedenzymeevolutionexperiment

當(dāng)前8頁，總共49頁。體外誘變是對克隆化的DNA進行誘變處理，改變其核苷酸序列，獲得突變基因。研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，獲得所需功能的突變體蛋白質(zhì)主要方法有：隨機誘變，DNA體外重組，寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變，嵌套缺失當(dāng)前9頁，總共49頁。第一節(jié)隨機誘變隨機的在克隆化DNA中引入堿基置換突變，引入位置和性質(zhì)均為隨機性的。包括：1.錯誤摻入誘變（易錯PCR)2.盒式誘變

3.增變菌株的誘變作用

4.化學(xué)誘變當(dāng)前10頁，總共49頁。隨機突變的策略：1.易錯PCR（error-pronePCR）

在擴增目的基因的過程中，通過改變PCR反應(yīng)的條件（如改變4種dNTP的比例、改變Mg2+的濃度等），在PCR過程中引入堿基錯配，導(dǎo)致目的基因的隨機突變當(dāng)前11頁，總共49頁。當(dāng)前12頁，總共49頁。2.盒式誘變

Cassettemutagenesis

利用一段人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸盒，取代野生型基因中的相應(yīng)序列

包括兩種方式：盒式取代誘變和混合寡核苷酸誘變當(dāng)前13頁，總共49頁。簡單盒式取代誘變當(dāng)前14頁，總共49頁。混合寡核苷酸誘變用于取代的是含有隨機突變的混合雙聯(lián)寡核苷酸，可引入大量的隨機突變。在合成寡核苷酸片段時，需要帶限制性內(nèi)切酶位點，以便介導(dǎo)它們互為引物當(dāng)前15頁，總共49頁。3增變菌株的誘變作用因為DNA復(fù)制酶有校正功能及DNA復(fù)制后修復(fù)系統(tǒng)，正常大腸桿菌自發(fā)突變頻率較小。與校正和修復(fù)有關(guān)的基因突變后細(xì)胞內(nèi)基因突變頻率大大增加，這樣的菌株叫突變菌株。當(dāng)前16頁，總共49頁。流程：把攜帶待突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入增變菌株擴增，------隨機突變體庫。把該庫的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到正常宿主中，篩選鑒定突變體。當(dāng)前17頁，總共49頁。4化學(xué)誘變化學(xué)誘變劑（亞硝酸、羥胺、EMS（甲基磺酸乙酯）、亞硝基胍等）處理DNA片段，產(chǎn)生隨機突變體庫。當(dāng)前18頁，總共49頁。DNA體外重組依賴序列同源性的DNA體外重組，包括DNA洗牌(DNAshuffing)，交錯延伸（StEP)，隨機引發(fā)重組（RPR).當(dāng)前19頁，總共49頁。2.DNAshuffling

（DNA重排或改組）

DNAshuffling

是指DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上進行有性重組。通過改變單個基因（或基因家族）原有的核苷酸序列，創(chuàng)造新基因，并賦予表達產(chǎn)物以新功能當(dāng)前20頁，總共49頁。基本步驟:目的基因片段的準(zhǔn)備：根據(jù)不同的需要選擇一個基因或其片段，也可以是幾個序列上具有較高同源性的基因DNaseI酶切：將基因隨機切割成約50～100bp左右的小片段不加引物的PCR：在Taq酶的作用下將切割后的DNA重疊小片段重新連接起來，在這個過程中可能發(fā)生許多突變和重組加引物的PCR：加入目的基因片段兩端的引物,

使連接好的DNA得到擴增，篩選正突變。當(dāng)前21頁，總共49頁。基因家族的改組當(dāng)前22頁，總共49頁。交錯延伸重組圖10-5以兩個以上的有一定同源性的DNA片段為模板進行PCR反應(yīng)，通過交換模板機制實現(xiàn)DNA序列的重新組裝。不需要DNaseI切割DNA，簡化了程序。當(dāng)前23頁，總共49頁。隨機引發(fā)重組圖10-6用一套隨機引物與模板配對延伸，產(chǎn)生不同位點的短DNA片段混合物（含有少量點突變），以這些短DNA片段為引物重新組裝成全長基因。當(dāng)前24頁，總共49頁。

寡核苷酸介導(dǎo)的定點誘變

①基本原理：使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸片段作為引物，啟動單鏈DNA分子進行復(fù)制，隨后這段寡核苷酸引物便成為了新合成DNA子鏈的一個組成部分，因此所產(chǎn)生出來的新鏈便具有已發(fā)生突變的堿基序列當(dāng)前25頁，總共49頁。當(dāng)前26頁，總共49頁。作為誘變劑的寡核苷酸序列：人工合成一段寡核苷酸序列，該序列中除了所需的堿基突變外，其余的則與目的基因編碼鏈的特定區(qū)段完全互補錯配堿基的位置應(yīng)設(shè)計在寡核苷酸分子的中央部位，每側(cè)至少10-15個堿基通常采用化學(xué)合成無回文，重復(fù)和自身互補序列當(dāng)前27頁，總共49頁。②基本步驟：將待突變的目的基因插入M13噬菌體載體，制備單鏈DNA將合成的寡核苷酸片段與單鏈模板退火，在DNA聚合酶作用下合成互補的雙鏈DNA將雙鏈DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得突變基因突變體的篩選：寡核苷酸探針雜交篩選法當(dāng)前28頁，總共49頁。當(dāng)前29頁，總共49頁。局限性：突變體子代頻率低退火時，有些單鏈模板DNA未與寡核苷酸配對細(xì)胞內(nèi)甲基介導(dǎo)的錯配修復(fù)機制會修復(fù)新合成鏈中的錯配堿基當(dāng)前30頁，總共49頁。

dut-dUTP酶(dUTPase)缺陷，細(xì)胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細(xì)胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下由胸苷嘧啶占據(jù)的位置一、Kunkel法或稱“U”法ung-UDG酶缺陷,UDG酶[尿嘧啶(uracil)-N-糖基化酶(glycosylase)]可除去摻入DNA中的尿嘧啶殘基1．背景知識當(dāng)前31頁，總共49頁。E.coli(dut-/ung-)

合成的DNA含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基E.coliCJ236dut,ung,thi,relA;pCJ105(Cmr)pCJ105isaF’plasmid當(dāng)前32頁，總共49頁。ssDNA制備載體當(dāng)前33頁，總共49頁。ssDNA制備載體單鏈?zhǔn)删w載體phagemid載體當(dāng)前34頁，總共49頁。UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUInserttargetDNA轉(zhuǎn)化E.coliCJ236M13K07感染IsolatephagemidssDNA與突變寡核苷酸退火T4DNApolymeraseDNAligase2．原理只有突變鏈能復(fù)制轉(zhuǎn)化E.coliMV1190(dut+/ung+)水解U和脫氧核糖磷酸的N-糖苷鍵圖10-7當(dāng)前35頁，總共49頁。二、AlteredSites?IIinvitromutagenesissystem位點選擇定點誘變法

當(dāng)前36頁，總共49頁。當(dāng)前37頁，總共49頁。三、TransformerSite-Directedmutagenesis轉(zhuǎn)化子誘變法

當(dāng)前38頁，總共49頁。SynthesizesecondstrandDigestDNA(primarydigestion)TransformE.coli

mutS

topropagateplasmidsIsolateanddigest(Seconddigestion)TransformE.coliIsolateDNA當(dāng)前39頁，總共49頁。當(dāng)前40頁，總共49頁。四、PCR定點誘變1.大引物PCR誘變圖10-10當(dāng)前41頁，總共49頁。2.重疊延伸Overlapextension對于兩個具有部分重疊序列的DNA片段，在經(jīng)過變性和復(fù)性后，兩個DNA片段之間通過同源序列形成部分雜合的雙鏈，在DNA聚合酶作用下，雜合雙鏈可互為引物和模板，引導(dǎo)DNA的合成，從而形成雜合DNA雙鏈當(dāng)前42頁，總共49頁。3、SOE重疊延伸剪接術(shù)

Splicingbyoverlapextension可用于將兩個DNA片段在所期望的位點進行連接設(shè)計一個寡聚體引物，其序列包含兩個部分，“引發(fā)”和“重疊”部分，引發(fā)部分在3‘末端，起引物作用；重疊部分在5’末端，與待融合的DNA片段序列互補。設(shè)計另一個引物，該引物與上一個引物完全互補當(dāng)前43頁，總共49頁。ATGATGEcoRIBamHIBamHIATGEcoRIATGBamHIATGEcoRIPCRPCR重疊延伸PCRAB當(dāng)前44頁，總共49頁。第二節(jié)嵌套缺失1.外切核酸酶III的消化ExonucleaseIII5‘3‘5‘3‘5‘3‘當(dāng)前45頁，總共49頁。當(dāng)前46頁，總共49頁。2.BAL31的消化主要活性為3’外切核酸酶活性，可從線性DNA兩條鏈的3’端去掉除單核苷酸，還是一個內(nèi)切核酸(單鏈，nick,gap)

依賴鈣離子

EGTA可抑制活性當(dāng)前47頁，總共49頁。AA