1蛋白質的分離、純化和表征第7章P291一、蛋白質的酸堿性質

蛋白質分子中有很多酸性和堿性解離基團，是具有兩性解離性質的化合物。各種解離基團的解離度與溶液的pH有關，pH越低，堿性解離度越大，蛋白質分子帶正電荷越多，負電荷越少；pH升高，則解離情況相反。

在特定pH條件下，某種蛋白質分子所帶正負電荷相等，靜電荷為零，這一pH稱為該蛋白質的等電點（pI）。蛋白質的等電點有中性鹽時，蛋白質等電點在一定程度上決定于介質中離子的組成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可與蛋白質某些可解離基團結合，影響等電點。無鹽類干擾時，蛋白質分子本身的質子供體基團解離出來的質子數與它的質子受體基團結合的質子數相等時的溶液pH稱為等離子點(isoionicpoint,或稱等離點)。等離子點是每種蛋白質的一個特征常數。幾種蛋白質等電點二、蛋白質的分子大小與分子量的測定蛋白質的分子量的范圍:6×103～1×106Da（一）根據化學組成測定最低相對分子量

用化學分析方法測出蛋白質中某一微量元素的含量。并假設蛋白質分子中含有一個被測元素的原子，則可由此計算出蛋白質的最低分子量。

例：肌紅蛋白和血紅蛋白含鐵量均為0.335%,計算二者的相對分子質量。

最低相對分子量＝x100=鐵的百分含量鐵的原子量0.33555.8x100=16700測定蛋白質相對分子量的原理和方法也可以利用蛋白質中含量特少的aa，用同樣的原理計算蛋白質的最低分子量。（二）滲透壓法測定相對分子量

滲透壓法測定Mr操作簡單，Mr在10-100kDa時較準，但不能區別蛋白質分子是否均一。滲透壓公式：Mr

=RTlimc→0πc(c=質量濃度，g/mol)（三）沉降分析測定Mr超速離心機最大轉速:60000～80000r/min,相當于位于距轉軸中心10cm處、單位質量(1g)分子所受到的離心力(離心場強度)為400000×g～700000×g.沉降速度與蛋白質分子大小、密度和形狀有關,且與溶劑密度和黏度有關.單位離心場強度的沉降速度稱為沉降系數,用s(小寫)表示:

蛋白質、核酸、核糖體和病毒等的沉降系數介于1×10－13到200×10－13秒之間。為了使用方便，以10－13秒為一個沉降系數的單位，稱為斯維得貝格單位（Svedbergunit），或稱沉降系數單位，用S表示。如人血紅蛋白的S為4.46×10－13秒，即4.46S。

蛋白質的沉降系數(s)與相對分子質量(Mr)的關系可用斯維得貝格方程表達:摩爾氣體常數(8.314J·K-1·mol-1);熱力學溫度(K),舊稱絕對溫度蛋白質的擴散系數(cm2/s),數值上等于當濃度梯度為1個單位時在1s內通過1cm2面積的蛋白質質量溶劑的密度(g/cm3)偏微比體積(cm3/g)又稱偏微比容,蛋白質溶于水的偏微比容約0.74cm3/g沉降系數（四）凝膠過濾法測定Mr

凝膠過濾（層析）可按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，同時可以測定蛋白質分子量。蛋白質通過凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關:先測得幾種標準蛋白質的Ve（Ve為洗脫體積），并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量，并以其分子量對數對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標準曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測（五）SDS法測定Mr

聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高分辨率，用它分離、檢測蛋白質混合樣品，主要是根據各蛋白質各組分的電泳遷移率的不同。這種差異就蛋白質分子本身而言，主要與其所帶凈電荷以及分子量和形狀有關。當電泳體系中含有一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS）時，則得電泳遷移率的大小只取決于蛋白質的分子量，從而可直接由電泳遷移率推算出蛋白質的分子量。

SDS破壞蛋白氫鍵和疏水相互作用,巰基乙醇能打開二硫鍵,SDS和巰基乙醇存在下,單體蛋白或亞基(寡聚蛋白質解離成亞基)處展開狀態.SDS烴鏈與蛋白質側鏈通過疏水相互作用形成復合體.在一定條件下,SDS與大多數蛋白質的結合比:1.4gSDS/1g蛋白質,相當于每兩分子氨基酸殘基結合一分子SDS.SDS與蛋白質結合后:第一,SDS陰離子使多肽鏈覆蓋上相同密度的負電荷,遠超過蛋白質原有電荷量,掩蓋了不同蛋白質間原有的電荷差別;第二,改變蛋白質的天然構象,使大多數蛋白質采取類似的形狀.因此在SDS存在下的電泳幾乎是完全基于相對分子質量分離蛋白質的.聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）SDS，遷移率不受蛋白質原有的電荷、分子形狀等因素影響,但凝膠具分子篩效應.因此，遷移率與相對分子質量(Mr)之關系:常數相對遷移率：樣品遷移距離/前沿(染料)蛋白質親水膠體的穩定性主要取決于兩個因素：雙電層水化層三、膠體性質與蛋白質的沉淀1．蛋白質膠體溶液的穩定性

蛋白質顆粒大小屬于膠體粒子的范圍(1-100nm)。又由于其分子表面有許多極性基團，親水性極強，易溶于水成為穩定的親水膠體溶液。

蛋白質膠體溶液的穩定性是有條件的，相對的。假若改變環境條件，破壞其水化膜和雙電層，蛋白質親水膠體便失去穩定性，發生絮結沉淀現象，這既是所謂的蛋白質沉淀作用。①鹽析法（saltingout）：中性鹽（NH4SO4，NaSO4，NaCl等）→蛋白質脫去水化層。

優點：不引起蛋白質變性。鹽溶（saltingin）：稀鹽溶液中蛋白質溶解度增加的現象。2．蛋白質的沉淀②有機溶劑沉淀法：極性有機溶劑（甲醇，乙醇，丙酮）→脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用。條件：低溫操作，縮短時間。

③重金屬鹽沉淀法:當溶液pH>pI,蛋白質顆粒帶負電荷,易與重金屬離子

(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等)→生成沉淀。

④生物堿試劑和某些酸類沉淀法:生物堿試劑—能引起生物堿沉淀的一類試劑。當溶液pH<pI時,蛋白質顆粒帶正電荷→易與生物堿試劑,酸根負離子反應→沉淀用途：臨床除去體液中干擾測定的蛋白質⑤加熱變性沉淀法原因：加熱變性使蛋白質天然結構解體，疏水基外露，損壞了水化層

用途：制豆腐（加熱+少量鹽鹵）四、蛋白質分離純化的一般原則前處理：細胞破碎粗分級分離：鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等細分級分離：層析、電泳、結晶蛋白質純化測總目標：增加純度或比活力動物材料剔除結締組織、脂肪組織;種子材料應先去殼和種皮以免受單寧等物質的污染,油料種子脫脂.選擇適當方法,破碎組織或細胞：動物組織(電動搗碎機或勻漿器或超聲);植物組織(英砂或玻璃粉和適當的緩沖液研磨或用纖維素酶);細菌細胞(超聲,與砂研磨或溶菌酶).選擇適當的緩沖液把所要的蛋白質提取出來.如果蛋白質是與細胞膜或膜質細胞器結合的,用超聲波或去污劑使膜結構解聚,用適當的介質提取。前處理:五、蛋白質分離純化的一般方法

根據分子量：如沉降速度法離心根據密度：沉降平衡法離心根據電荷和分子量：聚丙烯酰胺凝膠電泳根據分子量和分子形狀：凝膠過濾根據溶解度：硫酸銨分級沉淀、有機溶劑分級沉淀根據電荷：等電點沉淀

透析：利用半透膜的選擇通透性來純化象蛋白質這樣的大分子物質的過程叫透析。超過濾：是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子而蛋白質分子被截留在膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的，有時要用切向流過濾法。（一）根據分子大小不同的分離純化方法磁力攪拌器透析液裝有蛋白溶液的透析袋攪拌子

透析超濾離心技術主要用于各種生物樣品的分離和制備，生物樣品懸浮液在高速旋轉下，由于巨大的離心力作用，使懸浮的微小顆粒（細胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，從而與溶液得以分離，而沉降速度取決于顆粒的質量、大小和密度。密度梯度離心技術是利用每種蛋白質顆粒沉降到與自身密度相等的密度梯度時即停止不前，最后各種蛋白質在離心管中被分離成各自的區帶。常用的密度梯度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度等。密度梯度（區帶）離心常用于生成密度梯度的介質是蔗糖、聚蔗糖（Ficoll），分離核酸時還常用CsCl作為介質。凝膠過濾法

常用凝膠：交聯葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠，瓊脂糖（sepharose或Bio-GelA）；凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外，即分級分離范圍或排阻極限;大分子從顆粒間隙流下來，洗脫液體積小。小分子在顆粒網狀結構洗脫歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大；用洗脫體積同標準分子量的蛋白質的比例關系測定蛋白質分子量；（二）利用溶解度差別的純化方法

影響蛋白質溶解度的外部因素很多，其中主要有：溶液的pH、離子強度、介電常數和溫度。溶解度歸根結底取決于他們本身的分子結構。1.通過改變溶液pH值的等電點沉淀法2.通過改變溶液離子強度的鹽析、鹽溶3.有機溶劑的分級沉淀4.通過改變溫度的沉淀法

在等電點pH條件下，蛋白質為電中性，其物理性質如導電性、溶解度、黏度、滲透壓等都表現為最低值，易發生絮結沉淀。因此，等電點性質常被用于蛋白質的分離制備，被稱為等電點沉淀技術。等電點沉淀鹽溶與鹽析鹽溶：一般在低鹽濃度的情況下，蛋白質的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這種現象稱為鹽溶；鹽析:當鹽濃度升高到一定程度后，蛋白質的溶解度又隨著鹽濃度的升高而降低，結果使蛋白質沉淀析出，這種現象稱為鹽析;同一濃度鹽溶液中，不同蛋白質的溶解度不同，借此可達到彼此分離的目的。鹽溶原理:蛋白質吸附某種鹽離子后彼此排斥。鹽析原理：鹽濃度增高到一定數值后，水活性降低，水化膜相繼被破壞，最終引起蛋白質分子間相互聚積并從溶液中析出溫度對蛋白質溶解度的影響

0-40℃之間，大部分球狀蛋白質的溶解度隨溫度的升高而增加。有機溶劑分級分離法降低水溶液的介電常數，破壞大分子周圍水膜，使溶質溶解度降低;利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑中的溶解度不同而使蛋白質分離的方法，有機溶劑沉淀法。經常使用的有機溶劑是乙醇和丙酮；易使蛋白質和酶變性，操作必須在低溫條件下進行。電泳:在外電場的作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動，這種現象稱為電泳。原則上按電泳的原理來分，可分為：（三）根據電荷不同的純化方法自由界面電泳區帶電泳濾紙電泳和薄膜電泳（醋酸纖維素薄膜、聚酰胺薄膜）粉末電泳（淀粉、纖維素粉、硅膠粉，粉末與適當溶劑調和，鋪板）細絲電泳，如尼龍絲和其它人造絲電泳，這是一類微量電泳凝膠電泳，最常用的支持介質是聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠

聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)濃縮膠樣品

分離膠

在PAGE中，除了一般的電荷效應外，還有凝膠對樣品的分子篩效應和濃縮效應，三種效應共同起作用，使樣品的分離效果大大提高。Tris-GlypH=8.3Tris-GlypH=8.3Tris-HClpH=6.8T=3%Tris-HClpH=8.9T=7.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）0.51.0kD33022067603618.5kD9467433020.114.4MolmasskD30020010080605040302010Migration(Rf)Pharmacia:MolecularMarkersforelectrophoresisAstablepHgradientisestablishedinthegelafterapplicationofanelectricfield.Proteinsolutionisaddedandelectricfieldisreapplied.Afterstaining,proteinsareshowntobedistributedalongpHgradientaccordingtotheirpIvalues.等電聚焦(IEF)pH梯度制作：利用兩性電解質(商品名:Ampholine)，多氨基多羧酸系列兩性化合物同系物的復雜混合物，它們有相近但不同的pH和pI值，在電場作用下，自然形成pH梯度.電泳就是在凝膠中加入兩性電解質從而構成從正極到負極pH逐漸增加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。FirstdimensionIsoelectricfocusingIsoelectricfocusinggelisplacedonSDSpolyacrylamidegel.SeconddimensionSDS-polyacrylamidegelelectrophoresis雙向電泳(Two-dimensionalelectrophoresis)

此法是利用離子交換樹脂作為柱層析支持物，將帶有不同電荷的蛋白質進行分離的方法。若選擇陽離子交換樹脂，則帶正電荷的物質與H+發生交換而結合在樹脂上。若選擇陰離子交換樹脂，則帶負電荷的物質可與OH-發生交換而結合在樹脂上。物質在樹脂上結合的牢固程度即親和力大小有差異，因此選用適當的洗脫液便可將混合物中的組分逐個洗脫下來，達到分離純化的目的。離子交換層析陽離子交換劑：

CM-纖維素：-O-CH2COOHP-纖維素：磷酸基陰離子交換劑：

DEAE-纖維素：二乙基氨基乙基

AE-纖維素：氨基乙基親和層析利用化學方法將可與待分離物質可逆性特異結合的化合物（稱配體）連接到某種固相載體上，并將載有配體的固相載體裝柱，當待提純的生物大分子通過此層析柱時，此生物大分子便與載體上的配體特異的結合而留在柱上，其他物質則被沖洗出去。然后再用適當方法使這種生物大分子從配體上分離并洗脫下來，從而達到分離提純的目的?？乖涂贵w激素和受體蛋白凝集素和糖蛋白配體蛋白質蛋白質和配體復合物交聯試劑載體配體載體與配體交聯體雜