第二章蛋白質化學(10學時)

蛋白質的生物學意義蛋白質的元素組成蛋白質的氨基酸組成(重點)肽蛋白質的結構(重點)蛋白質分子結構與功能的關系蛋白質的性質(重點)蛋白質的分類（1）熟悉蛋白質的基本結構單位：氨基酸；肽；蛋白質的一級結構、二級結構、超二級結構和結構域、三級結構四級結構；蛋白質的兩性性質、等電點與電泳、紫外吸收性質、膠體性質、蛋白質的沉淀；變性與復性；蛋白質的呈色反應。（2）了解蛋白質的分類；蛋白質分子結構與功能的關系。目的與要求蛋白質是由許多不同的α-氨基酸按一定的序列通過酰胺鍵（肽鍵）縮合而成的，具有較穩定的構象并具有一定生物功能的大分子。一、蛋白質的生物學意義1.生物體的組成成分2.酶3.運輸4.運動5.抗體6.干擾素7.遺傳信息的控制8.細胞膜的通透性9.高等動物的記憶、識別機構二、蛋白質的元素組成C（50~55%）、H（6~8%）、O（20~23%）、N（15~18%）、S（0~4%）、…N的含量平均為16%——凱氏（Kjadehl）定氮法的理論基礎三、蛋白質的氨基酸組成氨基酸是蛋白質的基本組成單位。從細菌到人類，所有蛋白質都由20種標準氨基酸（20standardaminoacids)組成。（一）氨基酸的結構通式：19種氨基酸具有一級氨基（-NH3+）和羧基（-COOH）結合到α碳原子（Cα），同時結合到（Cα）上的是H原子和各種側鏈（R）；Pro具有二級氨基（α-亞氨基酸）不帶電形式

H2N—Cα—HCOOHR+H3N—Cα—HCOO-R兩性離子形式Cα如是不對稱C（除Gly），則：具有兩種立體異構體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]（二）氨基酸的分類根據R的化學結構（1）脂肪族氨基酸：1）疏水性：Gly甘、Ala丙、Val纈、Leu亮、Ile異、Met甲、Cys半；2）極性：Arg精、Lys賴、Asp天、Glu谷、Asn天、Gln谷、Ser絲、Thr蘇（2）芳香族氨基酸：Phe苯、Tyr酪（3）雜環氨基酸：Trp色、His組（4）雜環亞氨基酸：Pro脯根據R的極性（1）極性氨基酸：1）不帶電：Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys；2）帶正電：His、Lys、Arg；3）帶負電：Asp、Glu（2）非極性氨基酸：Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pro、Trp（三）氨基酸的重要理化性質一般物理性質無色晶體，熔點極高（200℃以上），不同味道；水中溶解度差別較大（極性和非極性），不溶于有機溶劑。兩性解離和等電點氨基酸在水溶液中或在晶體狀態時都以離子形式存在，在同一個氨基酸分子上帶有能放出質子的—NH3+正離子和能接受質子的—COO-負離子，為兩性電解質。3.化學性質（1）與茚三酮的反應：Pro產生黃色物質，其它為藍紫色。在570nm（藍紫色）或440nm（黃色）定量測定（幾μg）。調節氨基酸溶液的pH，使氨基酸分子上的—+NH3基和—COO-基的解離程度完全相等時，即所帶凈電荷為零，此時氨基酸所處溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點（pI）。H3N—CH—COOHR+在酸性溶液中的氨基酸（pH＜pI）H3N—CH—COO-R+在晶體狀態或水溶液中的氨基酸（pH=pI）H2N—CH—COO-R在堿性溶液中的氨基酸（pH＞pI）（當氨基酸相互連接成蛋白質時，只有其側鏈基團和末端的α-氨基，α-羧基是可以離子化的。氨基酸等電點的確定：1）酸堿滴定（滴定曲線）2）根據pK值（該基團在此pH一半解離）計算：等電點等于兩性離子兩側pK值的算術平均數。pI=————pK1+pK22or（pI=————）pK2+pK32（2）與甲醛的反應：氨基酸的甲醛滴定法R—CH—COO-NH3+R—CH—COO-NH2+H+OH-中和滴定HCHOR—CH—COO-NHCH2OHHCHOR—CH—COO-N(CH2OH)2羥甲基AA二羥甲基AA（3）與2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反應NO2FO2N+HN—CH—COOHRNO2O2NHN—CH—COOHR+HF弱堿性DNP-氨基酸穩定，黃色H2N—CH—COOH+RNCH3CH3O=S=OCl5-二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）pH9.740℃NCH3CH3O=S=OHN—CH—COOHRDNS-氨基酸取代DNFB測定蛋白質N端氨基酸，靈敏度高，定量測定熒光（4）與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸—N—CHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF重復測定多肽鏈N端氨基酸排列順序，設計出“多肽順序自動分析儀”酸中很穩定（5）與熒光胺反應：根據熒光強度測定氨基酸含量（ng級）。激發波長λx=390nm，發射波長λm=475nm。產生具熒光物質。（6）與5,5′-雙硫基-雙（2-硝基苯甲酸）反應：H2N—CHCH2SSHNO2HOOCSNO2COOHCOOH+SSNO2NO2HOOCCOOHH2N—CH—COOH+CH2SHpH8.0硫代硝基苯甲酸測定Cys含量（pH8.0λ412nm的摩爾消光系數ε=13600）四、肽——一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物。氨基酸之間脫水后形成的鍵稱肽鍵（酰胺鍵）。當兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在一端仍然有游離的氨基和另一端有游離的羧基，每一端連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、不帶支鏈的寡肽（25個氨基酸殘基以下）和多肽（多于25個氨基酸殘基）。多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基。肽鏈寫法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示肽鍵。H2N-絲氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）（一）谷光甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG（二）催產素和升壓素均為9肽，第3位和第9位氨基酸不同。催產素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產和促使乳腺排乳作用。升壓素促進血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。（三）促腎上腺皮質激素（ACTH）39肽，活性部位為第4~10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（四）腦肽腦啡肽具有強烈的鎮痛作用（強于嗎啡），不上癮。Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leuβ-內啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮痛作用。（五）膽囊收縮素（六）胰高血糖素由胰島α-細胞分泌（β-細胞分泌胰島素），29肽。胰高血糖素調節維持血糖濃度。五、蛋白質的結構蛋白質是氨基酸以肽鍵相互連接的線性序列。在蛋白質中，多肽鏈折疊形成特殊的形狀（構象）（conformation）。在結構中，這種構象是原子的三維排列，由氨基酸序列決定。蛋白質有四種結構層次：一級結構（primary），二級結構（secondary），三級結構（tertiary）和四級結構（quaternary）（不總是有）。（一）蛋白質的一級結構（化學結構）一級結構就是蛋白質分子中氨基酸殘基的排列順序，即氨基酸的線性序列。在基因編碼的蛋白質中，這種序列是由mRNA中的核苷酸序列決定的。一級結構中包含的共價鍵（covalentbonds）主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）HPhe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-GlyGlu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaOHB鏈15710151920212530HGly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-AsnOH15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學結構—S————S——一級結構確定的原則：將大化小，逐段分析，制成兩套肽片段，找出重疊位點，排出肽的前后位置，最后確定蛋白質的完整序列。目前往往采用從待測蛋白質的基因序列反推出蛋白質的一級結構。（二）蛋白質的空間結構（構象、高級結構）——蛋白質分子中所有原子在三維空間的排列分布和肽鏈的走向。由于羰基碳-氧雙鍵的靠攏，允許存在共振結構（resonancestructure），碳與氮之間的肽鍵有部分雙鍵性質，由CO-NH構成的肽單元呈現相對的剛性和平面化，肽鍵中的4個原子和它相鄰的兩個α-碳原子多處于同一個平面上。Cα—C—N—CαOH—CN—O-H+CαCα氨基的H與羰基的O幾乎總是呈反式（trans）而不是順式（cis）。蛋白質構象穩定的原因：1）酰胺平面；2）R的影響。1.蛋白質的二級結構——指蛋白質多肽鏈本身的折疊和盤繞方式（1）α-螺旋（α-helix）Pauling和Corey于1965年提出。結構要點：1）螺旋的每圈有3.6個氨基酸，螺旋間距離為0.54nm，每個殘基沿軸旋轉100°。2）每個肽鍵的羰基氧與遠在第四個氨基酸氨基上的氫形成氫鍵（hydrogenbond），氫鍵的走向平行于螺旋軸，所有肽鍵都能參與鏈內氫鍵的形成。—C—(NH—C—CO)3N—OHHR3.613(ns)3)R側鏈基團伸向螺旋的外側。RRRRRRRRR螺旋的橫截面4）Pro的N上缺少H，不能形成氫鍵，經常出現在α-螺旋的端頭，它改變多肽鏈的方向并終止螺旋。（2）β-折疊結構（β-pleatedsheet）是一種肽鏈相當伸展的結構。肽鏈按層排列，依靠相鄰肽鏈上的羰基和氨基形成的氫鍵維持結構的穩定性。肽鍵的平面性使多肽折疊成片，氨基酸側鏈伸展在折疊片的上面和下面。CαCαCαCαCαCαRRRRRRNNCNNCCC平行反平行β-折疊片中，相鄰多肽鏈平行或反平行（較穩定）。（3）β-轉角（β-turn）為了緊緊折疊成緊密的球蛋白，多肽鏈常常反轉方向，成發夾形狀。一個氨基酸的羰基氧以氫鍵結合到相距的第四個氨基酸的氨基氫上。N—1CH—CC2CHN—HO=C3CHNC—4CH—NRRHOHRROHOβ-轉角經常出現在連接反平行β-折疊片的端頭。（4）自由回轉沒有一定規律的松散肽鏈結構。酶的活性部位。2.超二級結構和結構域超二級結構是指若干相鄰的二級結構中的構象單元彼此相互作用，形成有規則的，在空間上能辨認的二級結構組合體。是蛋白質二級結構至三級結構層次的一種過渡態構象層次。結構域是球狀蛋白質的折疊單位。多肽鏈在超二級結構的基礎上進一步繞曲折疊成緊密的近似球行的結構，具有部分生物功能。對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往往由兩個以上結構域締合而成三級結構。3.蛋白質的三級結構——指多肽鏈上的所有原子（包括主鏈和側鏈）在三維空間的分布。肌紅蛋白4.蛋白質的四級結構——多肽亞基（subunit）的空間排布和相互作用。亞基間以非共價鍵連接。血紅蛋白共價鍵次級鍵化學鍵肽鍵一級結構氫鍵二硫鍵二、三、四級結構疏水鍵鹽鍵范德華力三、四級結構（三）蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵肌紅蛋白是1957年由JohnKendrew用X射線晶體分析法測定的有三維結構的第一個蛋白質。它是典型的球形蛋白質，高度折疊成緊密結構，疏水氨基酸殘基大部分埋藏在分子內部，極性殘基在表面。肌紅蛋白中有8條α-螺旋。由多肽的折疊形成的疏水空隙內是血紅素輔基，通過肽鏈上的His殘基與肌紅蛋白分子內部相連，它對肌紅蛋白的生物活性是必需的（與O2結合）。六、蛋白質分子結構與功能的關系蛋白質分子具有多樣的生物學功能，需要一定的化學結構，還需要一定的空間構象。（一）蛋白質一級結構與功能的關系1.種屬差異蛋白質一級結構的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質的功能起決定作用。根據蛋白質結構上的差異，可以斷定它們在親緣關系上的遠近。2.分子病——蛋白質分子一級結構的氨基酸排列順序與正常有所不同的遺傳病。鐮狀細胞貧血（sick-cellanemia）從患者紅細胞中鑒定出特異的鐮刀型或月牙型細胞。β-鏈1234567Hb-AVal-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys…Hb-SVal-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys…Val取代Glu含氧-HbAO2O2粘性疏水斑點含氧HbS脫氧HbS疏水位點血紅蛋白分子凝集（二）蛋白質構象與功能的關系別（變）構作用：含亞基的蛋白質由于一個亞基的構象改變而引起其余亞基和整個分子構象、性質和功能發生改變的作用。因別構而產生的效應稱別構效應。血紅蛋白是別構蛋白，O2結合到一個亞基上以后，影響與其它亞基的相互作用。肌紅蛋白血紅蛋白在肺部O2的壓力在毛細血管中O2的壓力飽和度00.5120406080100120O2壓力24681012140.51.01.52.0OH-加入的當量pHpK1pIpK2（3）（2）（1）Gly的滴定曲線OH-OH-+H3N—C—COOHHH（1）+H3N—C—COO-HH（2）H2N—C—COO-HH（3）Gly解離作用七、蛋白質的性質（一）蛋白質的相對分子量蛋白質相對分子量在10000~1000000之間。測定分子量的主要方法有滲透壓法、超離心法、凝膠過濾法、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。最準確可靠的方法是超離心法（Svedberg于1940年設計）：蛋白質顆粒在25~50*104g離心力作用下從溶液中沉降下來。沉降系數（s）：單位（cm）離心場里的沉降速度。

s=————vω2xv=沉降速度（dx/dt）ω=離心機轉子角速度（弧度/s）x=蛋白質界面中點與轉子中心的距離（cm）沉降系數的單位常用S，1S=1×10-13（s）蛋白質分子量（M）與沉降系數（s）的關系M=——————RTsD（1－Vρ）R——氣體常數（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T——絕對溫度D——擴散常數（蛋白質分子量很大，離心機轉速很快，則忽略不計）V——蛋白質的微分比容（m3·g-1）ρ——溶劑密度（20℃，g·ml-1）s——沉降系數（二）蛋白質的兩性電離及等電點蛋白質在其等電點偏酸溶液中帶正電荷，在偏堿溶液中帶負電荷，在等電點pH時為兩性離子。電泳：帶電顆粒在電場中移動的現象。分子大小不同的蛋白質所帶凈電荷密度不同，遷移率即異，在電泳時可以分開。1.自由界面電泳：蛋白質溶于緩沖液中進行電泳。2.區帶電泳：將蛋白質溶液點在浸了緩沖液的支持物上進行電泳，不同組分形成帶狀區域。（1）紙上電泳：用濾紙作支持物。（2）凝膠電泳：用凝膠（淀粉、瓊脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。1）圓盤電泳：玻璃管中進行的凝膠電泳。+—2）平板電泳：鋪有凝膠的玻板上進行的電泳。-+等電聚焦電泳：當蛋白質在其等電點時，凈電荷為零，在電場中不再移動。++－－－－+－－－－－5.06.07.0穩定pH梯度5.06.07.0穩定pH梯度通電++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－++－－－－+－－－－－（三）蛋白質的膠體性質布郎運動、丁道爾現象、電泳現象，不能透過半透膜，具有吸附能力蛋白質溶液穩定的原因：1）表面形成水膜（水化層）；2）帶相同電荷。++++++（四）蛋白質的沉淀反應1.加高濃度鹽類（鹽析）：加鹽使蛋白質沉淀析出。分段鹽析：調節鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4飽和度），清蛋白（飽和(NH4)2SO4)。2.加有機溶劑3.加重金屬鹽4.加生物堿試劑單寧酸、苦味酸、鉬酸、鎢酸、三氯乙酸能沉淀生物堿，稱生物堿試劑。（五）蛋白質的變性天然蛋白質受物理或化學因素的影響，其共價鍵不變，但分子內部原有的高度規律性的空間排列發生變化，致使其原有性質發生部分或全部喪失，稱為蛋白質的變性。變性蛋白質主要標志是生物學功能的喪失。溶解度降低，易形成沉淀析出，結晶能力喪失，分子形狀改變，肽鏈松散，反應基團增加，易被酶消化。變性蛋白質分子互相凝集為固體的現象稱凝固。有些蛋白質的變性作用是可逆的，其變性如不超過一定限度，經適當處理后，可重新變為天然蛋白質。反應名稱試劑顏色反應有關基團有此反應的蛋白質或氨基酸雙縮脲反應NaOH、CuSO2紫色或粉紅色二個以上肽鍵所有蛋白質米倫反應HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物白色加熱變紅色

酪黃色反應濃HNO3及NH3黃色、橘色

酪、苯丙乙醛酸反應(Hopking-Cole反應)乙醛酸試劑及濃H2SO4紫色

色坂口反應(Sakaguchi反應)α-萘酚、NaClO紅色胍基精酚試劑反應(Folin-Cioculteu反應)堿性CuSO4及磷鎢酸-鉬酸藍色酚基、吲哚基酪茚三酮反應茚三酮藍色自由氨基及羧基α-氨基酸

（六）蛋白質的顏色反應—OHN六、蛋白質的分類1.蛋白質形狀球狀蛋白纖維狀蛋白2.分子