第2章

蛋白質的構件-氨基酸(aminoacid)一、蛋白質的化學組成和分類1.元素組成蛋白質是一類含氮有機化合物，除含有碳、氫、氧外，還有氮和少量的硫。某些蛋白質還含有其他一些元素，主要是磷、鐵、碘、鋅和銅等。碳和氮元素在蛋白質中的組成百分比約為：碳：50%;氮：16%。2.蛋白質的估算平均含氮量約為16%，所以，可以根據樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量：蛋白質含量=蛋白氮×6.253.氨基酸組成蛋白質是由20種L-型α氨基酸組成的長鏈分子4.蛋白質的分類1）按組成：簡單蛋白質（表2－1）：綴合蛋白質（表2－1）：（注意輔基的組成）2）按生物學功能分：酶、運輸蛋白、營養和貯存蛋白、激素、受體蛋白、運動蛋白、結構蛋白、防御蛋白等。3）按形狀和溶解度：纖維狀蛋白質：不溶于水,結構作用；球狀蛋白質：易溶于水，細胞中大多屬可溶性蛋白；膜蛋白質：不溶于水,與細胞的各種膜系統結合。酸水解：H2SO4或HCI能使蛋白質完全水解；不引起消旋作用，但色氨酸完全被破壞，天冬酰胺、谷胺酰胺脫酰胺基；堿水解：NaOH能使蛋白質完全水解；色氨酸穩定，但大多數氨基酸遭破壞并引起消旋現象；酶水解：部分水解；不產生消旋，不破壞氨基酸；主要用于蛋白質一級結構分析，如：胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶等。二、蛋白質的水解

三、氨基酸的一般結構

結構通式：與羧基相連的Cα上都有一個氨基，氫原子和可變的R基。如圖aa結構通式：除Gly外

,Cα是不對稱C：1.具有兩種立體異構體[D-型和L-型]2.具有旋光性[左旋（-）或右旋（+）]四、氨基酸的分類（一）基本氨基酸：組成蛋白質的常見氨基酸（有20種）。（二）不常見的蛋白質氨基酸：不常見但在某些蛋白質中存在。是多肽合成后由基本aa經酶促修飾而來(約10種)。（三）非蛋白質氨基酸：存在于生物體內但不參與蛋白質組成的氨基酸(約200多種)。按R基的化學結構：中性氨基酸1.脂肪族氨基酸含羥基或硫的氨基酸酸性氨基酸及其酰氨堿性氨基酸2.芳香族氨基酸3.雜環族氨基酸（一）

常見的蛋白質氨基酸（20種）（1）中性氨基酸（5種，甘丙纈亮異）R基均為中性烷基，R基對分子酸堿性影響很小。Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。1.脂肪族氨基酸（2）R中含有羥基和硫的氨基酸（共4種，絲蘇半甲硫）Cys的R中含巰基（-SH），具有重要性質：兩個Cys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。Met在生物合成中是一種重要的甲基供體（★）。（3）酸性氨基酸及其酰胺基團（各2種，天谷酸酰胺）Asp和Glu是唯一在生理條件下帶有負電荷的的兩個氨基酸；（4）堿性氨基酸（2種，賴精脂肪酸）Arg是堿性最強的氨基酸，是動物體內尿素形成的中間物。

2.芳香族氨基酸（3種，苯丙色酪香）苯丙氨酸酪氨酸色氨酸

3.雜環氨基酸（2種，雜環帶組脯）Pro的α-亞氨基是環的一部分，因此具有特殊的剛性結構，一般出現在兩段α-螺旋之間的轉角處，Pro殘基所在的位置必然發生骨架方向的變化；His帶有咪唑基，是在生理pH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸。His在酶的酸堿催化機制中起重要作用。按R基的極性性質：1.非極性R基氨基酸8（丙、纈、亮、異亮、脯、苯丙、色、甲硫）

2.不帶電荷的極性R基氨基酸7（甘、絲、蘇、半胱、酪、谷氨酰胺、天冬酰胺）

3.帶正電荷的R基氨基酸3（賴、精、組）

4.帶負電荷的R基氨基酸2（谷、天冬）極性

1.非極性R基氨基酸（8種）在水中的溶解度小，且在維持蛋白質的三維結構（蛋白質的疏水核心）中起著重要作用。2.不帶電荷的極性R基氨基酸（7種）這類氨基酸的側鏈都能與水形成氫鍵，因此很容易溶于水。羥基巰基酰胺基

3.帶負電荷的R基氨基酸（酸性氨基酸，2種）這兩種氨基酸都含有兩個羧基，并且第二個羧基在pH7左右也完全解離，因此分子帶負電荷。

4.帶正電荷的R基氨基酸（堿性氨基酸，3種）膠原蛋白中的Lys側鏈氧化時能形成很強的分子間(內)交聯。Arg堿性很強，與NaOH相當。His是天然的緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。

（二）不常見的蛋白質氨基酸也稱修飾氨基酸，是在蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來。4-羥脯氨酸和5-羥賴氨酸，這兩種氨基酸主要存在于結締組織的纖維狀蛋白中。（三）非蛋白質氨基酸不組成蛋白質，但有生理功能。（2）D-型氨基酸D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短桿菌肽S）（3）β-、γ-、δ-氨基酸β-Ala（泛素的前體）、γ-氨基丁酸（神經遞質）。（一）氨基酸的解離氨基酸在晶體和水溶液中主要以兼性離子形式存在。氨基酸在兩性離子時，氨基是以質子化(－NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(－COO-)存在。兩性離子既有酸的作用，又有堿的作用。五、氨基酸的酸堿性質氨基酸的分部解離陽離子兩性離子陰離子

正電荷負電荷PH>PIPH<PIPH>PI等電點（PI)正電荷負電荷（二）氨基酸的等電點等電點：當溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-數目正好相等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態，少數離解成數目相等的陰、陽離子。pH=pI時，氨基酸凈電荷為零；pH>pI時，氨基酸帶負電荷，－COOH解離成－COO-，向正極移動；pH<pI時，氨基酸帶正電荷，－NH2解離成－NH3+，向負極移動。

氨基酸的等電點可依其分子中氨基、羧基和R基的解離常數pKa值求出。解離常數(pKa)是水溶液中具有一定離解度的溶質的的極性參數。氨基酸等電點的計算公式可分為下列情況：1.非極性R基氨基酸和不帶電荷的極性R基氨基酸（半胱氨酸除外）：pI=(pKa1+pKa2)/2

2.R基含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定于兼性離子兩邊的pKa的算術平均值：

（1）酸性氨基酸：pI=(pKa1+pKR-COO-

)/2半胱氨酸（Cys)不屬酸性氨基酸，但其—SH具有弱酸性，在PH7.0時，Cys的—SH大約解離8%，故其PI按酸性氨基酸計算。

（2）堿性氨基酸：pI=(pKa2+pKR-NH2)/2例1：計算天冬氨酸的等電點pI解：根據等電點的定義，近似求出pI=（pKa1+pKR)/2=(2.09+3.86)/2=2.97例2：Glu的pKa1＝2.19，pKa2＝9.67，pKR-COOH＝4.25，則等電點為?(3.22)（一）α-羧基參加的反應1.成酯反應羧基被醇酯化后，形成相應的酯。2.成酰氯反應羧基可與五氯化磷或二氯亞砜反應，生成酰氯，在多肽的人工合成中常用。3.成酰胺反應六、氨基酸的化學反應1.酰化反應

丹磺酰氯（5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯，DNS-Cl）：常用于多肽鏈－NH2末端氨基酸的標記和微量氨基酸的定量測定。（二）α-NH2參加的反應

NGly—Ala—Ser—Leu—PheC

DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—PheC水解產物：DNS—Gly、Ala、Ser、Leu、PheDNS-AA在紫外光激發后發黃色熒光。DNS

2.烴基化反應

α-氨基中的氮是一個親核中心，能與烴基（包括環烴及其衍生物）發生親核取代反應，如Edman反應（可鑒定多肽的NH2末端氨基酸）。Edman反應(苯異硫氰酸酯，PITC)產物：苯乙內酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸），無色，可以用層析法分離鑒定。被Edman用來鑒定多肽的NH2末端氨基酸。（三）茚三酮反應與茚三酮反應（★）茚三酮在弱酸中與α-氨基酸共熱，引起氨基酸的氧化脫氨、脫羧反應，最后，茚三酮與反應產物——氨和還原茚三酮反應，生成紫色物質。氨基酸與茚三酮的反應過程用紙層析和柱層析把各種氨基酸分開后，用茚三酮顯色可以定性鑒定，并在570nm定量測定各種氨基酸。Pro、Hy-Pro與茚三酮直接形成黃色化合物。（四）

側鏈官能團的特異反應—用于蛋白質的化學修飾氨基酸側鏈含有羥基、酚基、巰基、吲哚基、咪唑基、胍基、甲硫基等。蛋白質的化學修飾：在溫和條件下，以可控制的方式使蛋白質與某種試劑發生特異反應，引起蛋白質中個別氨基酸側鏈或功能團發生共價化學改變。

Cys(－SH)鹵化烷（碘乙酸等）：保護巰基，防止重新被氧化；2—硝基苯甲酸：分光光度法定量測定巰基；易被氧化成胱氨酸胱氨酸的氧化（產物：磺基丙氨酸。氧化劑：過甲酸）胱氨酸的還原（產物：半胱氨酸。還原劑：巰基乙醇等）七、氨基酸的旋光性和光譜性質（一）氨基酸的旋光性和立體化學1.氨基酸的構型氨基酸構型：L型、D型。除了蘇、異亮有四種光學異構體,甘氨酸只為L型外，其余17種氨基酸有兩種光學異構體：L型、D型。構成蛋白質的氨基酸均屬L-型。外消旋物：D-型和L-型的等摩爾混合物。L-蘇和D-蘇組成消旋物；L-別-蘇和D-別-蘇組成消旋物。2.氨基酸的旋光性氨基酸的旋光性（符號和大小）取決于它的R基的性質，并與溶液的pH值有關。比旋是α－氨基酸的物理常數之一，蛋白質中L型氨基酸的比旋光度見表2-3。Gly無手性C，無旋光性;

H2N—Cα—HCOOHH（二)氨基酸的光譜性質氨基酸的光吸收性20種基本氨基酸在可見光區都沒有光吸收，在紅外區和遠紫外區有光吸收。在近紫外區（200-400nm）只有芳香族氨基酸（Tyr、Phe、Trp的R基含有共軛雙鍵）有光吸收。λ（nm）εTyr2751.4×103Phe2572.0×102Trp2805.6×103

蛋白質在280nm有最大紫外吸收光吸收，分光光度法鑒定。核磁共振（NMR）：在aa和Pro化學表征方面起重要作用。知識鏈接核磁共振(NMR)是電磁波（無線電波）與原子核自旋相互作用的一種基本物理現象。NMR波譜學具有最高的頻率分辨率。NMR曾經使物理學家為之神魂顛倒，近二十年來越來越多的化學家、生物學家和醫學家也涉足其中。目前生物NMR波譜學研究的前沿領域包括：1.生物分子三維結構的NMR測定方法和應用2.生物分子相互作用、動力學及其與功能的關系研究方法和應用3.基于NMR的代謝組學研究方法和應用4.生物組織的高分辨NMR分析方法和應用中國科學技術大學生命科學學院核磁共振波譜實驗室：主要用多維核磁共振波譜及計算生物學研究與重大疾病或重要生理功能相關的蛋白質結構,動力學與功能關系,以及蛋白質相互作用。蛋白質因含有這些氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般在280nm波長處有最大光吸收，因此能利用紫外吸收法鑒定并測定樣品中蛋白質的含量。分配原理固定相和流動相；混合物在層析系統中的分離決定于該混合物組分在兩相中的分配情況；分配系數；固—液、液—液、氣—液；（一）分配層析法：

分配系數Kd=CACBCA：一種物質在A相（流動相）中的濃度

CB：一種物質在B相（固定相）中的濃度八、氨基酸混合物的分離和分析原理：主要根據被分析的樣品（如aa混合物）在兩種互不相溶的溶劑中分配系數的不同而達到分離的目的。固定相和流動相基于分配系數差異的分離方法—分配層析1.柱層析2.紙層析3.薄層層析1、柱層析

層析柱中的填充劑或支持劑表面附著一層結合水作為固定相，沿固定相流過的與它互不相溶的溶劑是流動相。當用洗脫劑洗脫時，柱上端的氨基酸混合物在兩相之間會按不同的分配系數以不同的速度向下移動。分部收集層析柱下端的洗脫液，然后分別用茚三酮顯色定量，以氨基酸量對洗脫液體積作圖得洗脫曲線，曲線中的每個峰相當于某一種氨基酸。加洗脫劑氨基酸樣品支持劑層析柱分部收集1.00.50.1光吸收值

20406080100120流出液（毫升）2、紙層析

固定相：濾紙纖維素上吸附的水流動相：展層用的溶劑層析時，混合氨基酸在這兩相中不斷分配，使它們分布在濾紙的不同位置上。基本步驟：點樣、展層、顯色、定性（定量）層析時，將樣品點在濾紙的一個角上，稱為原點。然后將其放入一個密閉的容器中，用一種溶劑系統進行展層，層析后烘干濾紙，再將其旋轉90度采用第二種溶劑系統進行第二相展層。由于各種氨基