人羊膜間充質干細胞的生物學特性與研究,醫學工程論文羊膜位于胎盤的最內層，主要來歷源于外胚層的上皮細胞和來源于中胚層的間充質細胞構成。其不含血管，細胞成分相對簡單，在胎兒娩出后即成為廢棄物.人羊膜間充質干細胞〔humanamnioticmesenchymalstemcells,hAMSCs〕有著來源豐富、無需有創操作、取材幾乎不受限制、分離培養方式方法簡便、有向3個胚層來源的組織細胞分化的潛能、免疫原性低等多種優點，可能成為一種愈加理想的間充質干細胞〔mesenchymalstemcells,MSC〕臨床研究及應用的來源[1].1hAMSCs的生物學特性1.1免疫表型及基因表示出當前，hAMSCs還沒有統一的外表標志物，但是大多數外表抗原和骨髓間充質干細胞〔bonemarrowmesenchymalstemcells,BM-MSCs〕類似。Kim等[2]通過分離羊膜間充質細胞并在體外擴增至第2、3代后獲得成纖維樣細胞，通過不同的培養條件分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、神經元細胞。免疫表型分析結果顯示，其表示出SSEA-3、SSEA-4、膠原蛋白-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ、-Ⅳ、-Ⅻ、纖維連接蛋白、-SMA、波形蛋白〔Vimenti〕、結蛋白、細胞角蛋18〔CK18〕、HCAM-1、成纖維細胞外表蛋白和人類白細胞抗原〔HLA〕-ABC;弱表示出ICAM-1蛋白；不表示出TRA-1-60、VCAM-1、vWF、PECAM-1和HLA-DR.用反轉錄聚合酶鏈反響〔RT-PCR〕方式方法檢測發現無論傳至幾代，一些基因[如：Oct-4、Rex-1、SCF、神經細胞黏附分子〔nervecellularadhesionmo1ecul,NCAM〕、巢蛋白〔Nestin〕、骨形態發生蛋白〔bonemorphoge-neticprotein,BMP〕4、心肌特異性轉錄因子GATA-4、肝細胞核因子〔hepatocyteneclearfactor,HNF〕-4、波形蛋白〔Vimen-ti〕、CK18]始終持續表示出。而一些基因〔如：鼠短尾突變體表型、FGF-5、Pax-6和BMP2〕不表示出。華而不實，研究發現，-甲胎蛋白、HLA-ABC、HLA-DR基因表示出于早期〔2~3代〕的細胞中而不表示出于晚期〔7~13代〕的細胞中，且在第3代以上的細胞中可檢測出端粒酶活性。近年來，流式細胞儀分選干細胞側群技術廣泛應用于提取多分化潛能干細胞。樸正福等利用流式細胞分選技術hAMSCs中分離提純干細胞〔hAMC-SP細胞〕，通過FACS分析結果示，此細胞表示出Nestin、Vimentin、整合素家族成員〔CD49b、CD49c、CD49d、CD49e〕、CD9、CDl3、CDl9、CD29、CD44、CD46、CD51、CD59、CDl66及干細胞相關的Oct-3/4抗原。HLA-ABC、TRA-1-81及SSEA-4為弱表示出；CD34、CD45、CDll7、CD56、CD90、CDl05、CDl06、CDl33、Fit1、Musashil及HLA-DR無陽性結果，TRA-1-60及SSEA-3也表示出陰性。實驗結果提示此細胞與其他間充質干細胞一樣，不表示出造血干細胞標記，表示出整合素分子成員及間充質干細胞特征性外表標志蛋白。1.2增殖能力、免疫原性及致瘤性SSEA-3、SSEA-4是胚胎干細胞和胚胎生殖細胞的外表標志特征，成體干細胞包括BMMSCs無表示出。研究發現羊膜間充質細胞表示出SSEA-3、SSEA-4,講明AM-MSCs可能是介于胚胎干細胞和成體干細胞之間的一個中間等級的干細胞，因而，其增殖能力比BM-MSCs更強。同時發現傳至〔14.50.9〕代、培養〔146.88.9〕d后、群體培增平均數〔36.94.7〕后細胞衰老.人羊膜細胞的低免疫原性和人羊膜組織移植不易引起免疫排擠反響。有學者通過實驗發現將AM-MSCs與人外周血單個核細胞〔PBMC〕或純化的T細胞直接transwell共培養都能夠抑制同種異體混合淋巴細胞反響誘導的淋巴細胞增殖，隨著AM-MSCs細胞的增加，其抑制效應越明顯，當細胞比例到達l∶l時，抑制效應最強。近來有學者進一步研究表示清楚hAM-SCs通過分泌可溶性因子在抑制淋巴細胞增殖中起作用，華而不實前列腺素可能是關鍵的效應分子。并且初次證實了hAMSCs抑制淋巴細胞增殖的能力是其本身所具有的，而不是像BM-MSCs抑制淋巴細胞增殖需要活化刺激等條件.近來研究報道，采用原代或第1~3代的間充質干細胞進行治療，不會有致瘤的危險。而當前對于hAMSCs的致瘤性問題，國內外的研究均較少。樸正福等通過在體外進行癌化實驗，提示hAMSCs傳代培養時保持細胞原有的特性，不具有致瘤性。利用體外細胞集落分析方式方法對hAMSCs的致瘤性進行了簡單的研究，發現AMC-SP細胞未構成集落，而作為陽性對照的HepG2構成了多數較大集落。2hAMSCs的臨床前研究干細胞是具有自我更新、高度增殖和多系分化能力的細胞群體，是替代、修復或加強受損或衰老組織、器官功能的理想種子細胞，是組織工程再生醫學領域的重要生物材料來源。hAMSCs能分化為多種細胞，且因其本身的眾多優勢，使其在再生醫學應用中具有很高的應用價值。近年來已有不少學者對其做了很多臨床前的探尋求索研究。有研究證實羊膜間充質干細胞可促進人臍血單個核細胞和CD34+細胞擴增，擴增后兩者在甲基纖維素半固體培養基中能夠構成造血祖細胞集落，其造血支持作用與BM-MSCs類似，二者比擬差異無統計學意義.近期有學者初次使用hAMSCs移植治療大劑量順鉑誘導的骨髓抑制，發現hAMSCs移植治療較早地改善順鉑所致骨髓抑制小鼠的造血功能[7].Kim等[8]發現hAMSCs較脂肪來源的間充質干細胞表示出更高層次水平的血管內皮生長因子-A、血管生成素-1、肝細胞生長因子、纖維母細胞生長因子-2〔FGF-2〕，十分是抗凋亡因子〔Akt-1〕也在hAMSCs中高表示出。進一步研究發現，當移植hAMSCs入小鼠缺血性后肢中，觀察到其自發的構成血管樣構造以及表示出特定的內皮基因和蛋白。移植hAMSCs后加強血液灌注及毛細血管密度，表示清楚hAMSCs能增加新血管構成，且實驗證實其移植率高。以上講明移植hAMSCs在治療缺血性下肢中可能具有可觀的療效。Warrier等[9]采用實時熒光PCR〔RT-PCR〕、免疫組織化學法等方式方法顯示羊膜來源的間充質干細胞在體外有生成內皮和血管的能力。進一步研究證實其本身表示出促血管生成因子〔如：Tie2、Ang1、VEGF、VEGFR、vWF、KDR和Flt4〕。這表示清楚可將其應用于創傷愈合、中風、缺血性疾病和組織修復中。Kim等[10]和Fatimah等[11]采用糖尿病的NOD/SCID小鼠模型，也證實了羊膜間充質干細胞通過分泌血管新生因子和加強移植分化能力，促進傷口愈合。近期有學者發現連續傳代培養后羊膜間充質干細胞對血管生成素-1的表示出加強。因胎兒的創傷愈合需要最小的炎性反響和有限的疤痕，Klein等采用胎羊羔模型發現，雖hAMSCs不是創傷愈合經過中絕對必需的，但其能加快創傷閉合，增加傷口處的細胞外基質。而對華而不實轉化的影響還需進一步研究。近來有研究發現hAMSCs在體外經自然生物誘導劑RPE〔老鼠再生胰腺提取物〕誘導可分化為分泌胰島素的細胞.也有學者通過實驗觀察到羊膜間充質干細胞能構成胰島樣細胞團〔ILC〕，采用免疫組織化學法顯示已分化的ILC可表示出人胰島素、胰高血糖素、生長抑素。而實時定量PCR顯示除表示出人胰島素、胰高血糖素、生長抑素，還表示出Ngn3、Isl1.將其移植入實驗性糖尿病小鼠，可使小鼠恢復正常的血糖且沒有免疫排擠.以上講明羊膜間充質干細胞具有構成新生胰島的能力，使其可能用于細胞替代治療糖尿病。hAMSCs也能分化為神經元細胞。有研究證實將經BHA誘導的hAMSCs移植入小鼠局灶缺血模型〔此模型有不同程度的左側偏癱伴隨右側霍納氏綜合征〕，分別于1、3、6、8周后檢查，發現與對照組比擬，移植組小鼠的神經系統異常感覺和狀態有明顯的改善。且移植入小鼠體內的hAMSCs主要集中于移植部位及其周邊區域，而在某些特定的情況下，其向缺血部位遷移。未檢測到缺血部位的膠質增生及淋巴細胞浸潤。以上實驗講明，用BHA誘導過的hAMSCs能分化為表示出NSE的神經元樣細胞。除此之外，hAMSCs移植可能改善局灶性腦缺血后造成的神經系統異常感覺和狀態.近來以大鼠為模型研究發現hAMSCs能顯著改善腦缺血大鼠的行為障礙、減少腦梗死體積及提高功能恢復。將hAMSCs移植入阿爾茨海默病老鼠中，發現其通過免疫調節及旁分泌機制持久地改善了老鼠的記憶功能.Paracchini等研究發現羊膜間充質干細胞有可能分化為與囊胞性纖維癥〔CF〕發病相關的器官〔肝與肺〕的上皮細胞，并能有助于部分修復CF的表型。有研究表示清楚，hAMSCs能分化為心肌細胞，且能高效率地重組成為誘導性多能干細胞〔MiPSCs〕,由MiPSCs分化得來的心肌細胞表示出c-kit細胞的外表標志，其能純化心肌細胞群且能用于同種異體的心臟干細胞療法.近期研究發現三維培養系統能增加hAMSCs分化為心肌樣細胞，使其能更有效地應用于再生醫學.還有學者通過將羊膜間充質干細胞直接移植入心肌梗死的NOD/SCID小鼠模型中的缺血心肌組織的周邊，發現羊膜間充質干細胞能顯著表示出相關的趨化因子及其受體，并改善了心臟功能，這一試驗表示清楚了將羊膜間充質干細胞應用于缺血性心血管病的治療的可能性.有學者建立有氣管缺陷的胎兒羊羔模型，發現移植羊膜間充質干細胞能增加其氣管的修復，表示清楚了將來應用于圍產期兒氣道修復的可能性.在博來霉素誘發的肺損傷活體模型中研究中發現，hAMSC能減輕肺纖維化、炎性反響，以及恢復肺的通氣功能。近來有學者用載有hAMSCs的羊膜直接移植到有皮膚傷口的小鼠模型中，發現其通過促進表皮干細胞和毛細血管的再生促進皮膚愈合.也有學者用hAMSCs與hAECs細胞構建雙層膜構造的皮膚組織，發現其與人皮膚組織有類似的形態，擁有表皮和真皮，且能成功修復無胸腺小鼠的全層皮膚缺損[22].在移植hAMSCs入四氯化碳誘導的小鼠肝硬化模型中實驗中，發現其能減少肝細胞凋亡，促進肝細胞再生，改善肝的纖維化[23].這為臨床提供了一種治療肝纖維化疾病的新方式方法。Lange-Consiglio等[24]初次比擬了羊膜間充質干細胞與BM-MSCs在治療馬的肌腱、韌帶損傷的療效，結果發現羊膜間充質干細胞的療效優于BM-MSCs.還有學者研究證實BM-MSCs的一些治療應用可被羊膜間充質干細胞等其他來源的間充質干細胞所取代，包括移植物抗宿主病的治療[25].Han等[26]通過流式細胞分析發現表示出于女性生殖系統及妊娠子宮中的HOXA9、HOXA10、HOXA11基因也表示出于羊膜來源的間充質干細胞上，并通過相關實驗推斷其可能作為子宮干細胞療法的新來源。Sakuragawa等發現羊膜間充質干細胞表示出神經膠質祖細胞的表型。近期又有研究證實hAMSCs有可能應用于神經膠質瘤的治療。3瞻望hAMSCs具有取材方便、來源廣泛、不易受污染