ICS.11.220B41中華人民共和國國家標準GB/T18648—2002非洲豬癌診斷技術DiagnostictechniquesforrAfricanswinefever2002-02-19發布2002-05-01實施中華人民共和國發布國家質量監督檢驗檢疫總局

中華人民共和國國家標準非洲豬診斷技術GB/T18648-2002中中國標準出版社出版發行北京西城區復興門外三里河北街16號郵政編碼：100045電話：63787337、637874472002年7月第一版2004年11月電子版制作書號：155066·1-18544版權專有侵權必究舉報電話：（010)68533533

GB/T18648-2002非洲豬癌(Africanswinefever,簡稱SF)是由非洲豬癌病毒（ASFV)引起的豬的一種急性、熱性高度接觸傳染性疾病。其特征為病程短·病死率高·臨床癥狀和病理變化均類似于急性豬癌，表現高熱皮膚充血、流產、水腫及臟器出血。為世界動物衛生組織WorldOrganizationforAnimalHealth(英)OfficeIntentionaldesEpizootic(法）,OIE和我國規定的動物一類疾病。病毒在鮮肉和腌肉中能存活數ASF的實驗室診斷分為兩類：第一類包括病毒分離、病毒抗原和基因組DNA的檢測;第二類包括抗體的檢測。試驗方法的選擇主要依據本國或本地區的疾病情況而定。在沒有ASF但又懷疑該病存在的國家，實驗室診斷必須應用無感染性的診斷方法，即應用聚合酶鏈反應（PCR)檢測病毒基因組DNA和應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清抗體。我國是無ASF國家，目前尚無ASF的檢疫方法。農業部動物檢疫所于1997年與美國梅島動物病研究中心進行了ASF的無感染性快速檢測方法的合作研究，建立了適合于我國使用的由可疑感染動物血液和內臟器官中直接檢測ASFVDNA的PCR技術.以及檢測血清中ASFV抗體的ELISA方法。本標準對這兩種方法技術要求作了規定。本標準的附錄A、附錄B和附錄C都是標準的附錄。本標準由中華人民共和國農業部提出。本標準由全國動物檢疫標準化技術委員會歸口。本標準起草單位：農業部動物檢疫所。本標準主要起草人：蔣正軍、王樹雙、尹燕博、蔡麗娟、郭福生、陸明哲、孫淑芳、龔振華

中華人民共和國國家標準GB/T18648-2002非洲豬癌診斷技術DiagnostictechniquesforAfricanswinefever1范圍本標準規定了非洲豬癌(ASF)聚合酶鏈反應(PCR)和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)的技術要求本標準適用于生豬和野豬等易感動物及其產品ASF的診斷和檢疫，2PCR試驗2.1材料準備2.1.1樣品DNA制備方法見附錄A(標準的附錄)2.1.2電泳液緩沖液的配制方法見附錄B（標準的附錄）2.1.3標準ASFV-BA株DNA、引物1、引物2、1.25mmol/LdNTP和載樣緩沖液2.1.4臺克(Taq)DNA聚合酶、分子量為100堿基對(bp)Ladder(標準DNAMarker)0和10倍濃度的聚合酶鏈反應(PCR)擴增緩沖液。2.1.5自動DNA熱循環儀2.2操作方法2.2.1將下列試劑按要求量加入到0.75mL的離心管中：滅菌蒸留水(24.5PL.);10倍濃度的PCR擴增緩沖液(5PL)：1.25mmol/LdNTP存液(8PL)；引物1(1L);引物2（1PL)；樣品DNA溶液(10L)見附錄A)：TaqDNA聚合酶(0.5L)。2.2.2設定兩個對照，陽性對照為標準的ASFV-BA株的10LDNA含量為10{g:陰性對照為不含DNA的滅菌蒸留水10/L。2.2.3取50″L礦物油覆蓋在混合液上。2.2.4將加有樣品或對照混合物的Eppendorf管放入自動DNA熱環儀中按下述程序和條件進行DNA擴增：94C5min.50C2min.72C3min循環一次94C1min.50C2min.72C3min循環30次94C1min.50C2min,72C10min循環一次,最后置于4C保存2.2.5上述步驃完成后，從礦物油下小心取出每種反應混合物20“L·放入另一支干凈的Eppendorf管中并加2載樣緩沖液，2.2.6將所有樣品按編號加入到對應2%瓊脂凝膠（見附錄B1)板的各孔中.其中一孔加標準陽性DNA樣品，在凝膠的邊孔中加入標準分子量DNAMarker。2.2.7將凝膠在150V恒定電壓下電泳2h。2.2.8結果判定：用紫外光源檢查凝膠。如為陽性樣品則出現一條孤立的、與陽性對照PCR產物的同步遷