分光光度法Spectrophotometry分光光度法概念：是利用物質分子對光的選擇性吸收而建立的分析方法。也叫吸光光度法。是利用物質所特有的吸收光譜來鑒別物質或測定其含量的一項技術。定性定量定量----單組分、多組分特點：靈敏度高、精確度高、操作簡便、快速。對于復雜的組分系統，無須分離即可檢測出其中所含的微量組分的特點。第一節

物質的吸收光譜一、基本概念復色光：不同波長組成的光單色光：單一波長的光可見光：380~780nm紫外光：200~380nm互補色光：按適當的強度比例混合可成白光的兩種顏色的光白光藍黃紅青橙紫青藍綠物質的吸收光譜互補色光示意圖二、物質對光具有選擇性吸收若溶液選擇性吸收某種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補色光。如硫酸銅溶液選擇吸收黃色光，故溶液呈藍色物質的吸收光譜M(基態）＋hM*(激發態)選擇性吸收：⊿E=h光子h=hc/⊿E不同物質，⊿E不同，選擇吸收光子能量也不同，即吸收的波長不同三、吸收光譜max(2)(1)A物質的吸收光譜A:吸光度，物質對單色光的吸收程度吸收光譜：A~作圖

C2﹥C1吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。max是定性鑒別物質的基礎不同濃度的溶液，max不變，濃度與峰值成正比，這是進行定量分析的依據。一般用max單色光測定第二節

分光光度法基本原理一、Lambert-Beerlaw透光率T

：透射光強度與入射光強度之比

T=It/I0吸光度A：透光率的負對數A=-lgTI0=Ia+It

分光光度法基本原理一、Lambert-Beer定律1、Lambert定律

一定條件下，某溶液吸光度與單色光通過的液層厚度b成正比。

A=k1b2、Beer定律

一定條件下（液層厚度固定），單色光通過溶液時，吸光度與溶液的濃度成正比。

A=k2C3.Lambert-Beer定律

A=bc1A=abc2=aM分光光度法基本原理:摩爾吸光系數L.mol-1.cm-1b:液層厚度cmC1:量濃度mol.L-1a:質量吸光系數L.g-1.cm-1C2

:質量濃度g.L-1(a),溶液對入射光吸收。

>103,可進行分光光度分析摩爾吸光系數ε的討論（1）吸收物質在一定波長和溶劑條件下的特征常數（2）不隨濃度c和液層厚度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質本身的性質有關，與待測物濃度無關；（3）同一吸光物質在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數，常以εmax表示

εmax表明了該吸收物質最大限度的吸光能力。

例：濃度為0.150mmol/L某化合物(Mr=251)溶液，在480nm波長處用2.00cm吸收池測得透光率為39.8%,求、a.解：=Acb=-lgTcb=-lg0.3980.150×10-3×2.00=1.33×103L.mol.cm-1分光光度法基本原理一、Lambert-Beer定律a=/M=1.33×103251=5.30L.g-1.cm-1例：某有色溶液在1.00cm吸收池中，測得其透光率T=60%，若改用2cm的吸收池時，其T為？

解：A=kb=-lgTb=1.00時A1=-lg0.6b=2.00時A2

＝2A1

＝-2lg0.6=-lg0.36

T=0.36練習題：1.在波長為508nm處，以鄰二氮菲光度法測定某元素，該元素的溶液濃度為2.5×10―4g/L，吸收池厚為2.0cm，測得其吸光度為0.190，已知該物質的ε為21223.0，試計算該元素的相對分子質量。2.稱鋼樣1.500g，用酸溶解后，以過硫酸鉀將其中的錳氧化成高錳酸根，轉移到100mL容量瓶內，稀釋至刻度后，用1.0cm吸收池在520nm處測得其吸光度為0.620，試計算試樣中的錳含量（ε=2235、MMn=54.94）第三節可見分光光度法一、分光光度計光源單色器吸收池檢測器信號放大器顯示器二、單組份測定方法（一）、標準曲線法分光光度計的基本結構光源單色光器吸收池檢測器顯示鎢絲燈可見光源350~1000nm氫燈氘燈紫外光源200~360nm棱鏡衍射光柵玻璃比色杯石英比色杯硒光電池光電管光電倍增管玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見光區。石英——不能吸收紫外光，適用于紫外光區。將光信號轉變為電信號的裝置。記錄裝置：訊號處理和顯示系統。AC0取標準品配置一系列不同濃度的標準溶液，置于液層厚度相同吸收池，測定相應吸光度，以A~C作圖，得一條通過原點的直線Beer’slaw當,b等一定，A與C成正比，A=KC相同條件下，測定樣品吸光度Ax,在標準曲線上查出對應的被測物濃度CxAxCx可見分光光度法（一）標準曲線法:標準曲線可見分光光度法（一）標準曲線法:用空白液(參比液)對儀器進行校正,以消除溶劑、顯色劑對光的吸收，以及光在吸收池中的散射和反射等。標準曲線偏離Beer’slawACA—C線性差，出現彎曲（1）溶液中吸光物質不穩定（2）單色光純度差物理、化學原因可見分光光度法（二）、標準對照法配置一個與被測物濃度相近的標準溶液Cs，在max附近處測出As,則As=kCsAx=kCxCx=AxAsCs適于個別樣品，誤差較大。只有在測定的濃度區間內溶液完全遵從郎伯-比爾定律。Cs和Cx相近時結果準確。可見分光光度法（三）、增量法如果標準試樣和未知試樣不能保持一致時，采用增量法。具體方法：

把未知試樣溶液分成體積相同的若干份溶液（不少于四份），其中一份不加入被測組分的標準溶液，在其他幾份中都加入不同量的標準溶液，然后在相同條件下，測定各試液吸光度，并繪制吸光度對增量的工作曲線。A△C（增量值）Cx····可見分光光度法（一）、顯色反應選擇（1）靈敏度高

>104

（2）選擇性好只與被測物顯色（3）生成的有色物穩定、組成一定（4）顯色劑在測定處無明顯吸收第四節

顯色反應及顯色條件的選擇1、顯色劑用量通過實驗測定，合適用量在a~b之間（平坦區）C顯色劑Aab2、溶液酸度酸度過大---酸效應Mn++nHL

MLn＋nH+酸度過小—水解效應Mn++nOH-M(OH)n（二）、顯色條件的選擇作吸光度A----PH曲線來確定顯色反應及顯色條件的選擇一般加緩沖液，控制溶液酸度（較佳酸度由A-pH實驗曲線確定)3、溶液酸度磺基水楊酸離子Sal2-與Fe3+形成配合物pH配合物顏色1.8~2.5[Fe(Sal)]+

紫色4~8[Fe(Sal)2]-橙色8~11[Fe(Sal)3]3-

黃色﹥12Fe(OH)3顯色反應及顯色條件的選擇4、顯色時間作吸光度A與時間曲線，確定時間5、干擾離子的掩蔽掩蔽：借助一定化學反應（加入掩蔽劑），不經分離而消除干擾的過程。如配合，氧還反應6、顯色溫度（三）、顯色劑無機顯色劑：配位不穩定，靈敏度和選擇性不好，應用不多有機顯色劑螯合物-------------------重要課題一般有生色團和助色團不飽和鍵孤對電子（影響生色團對光的吸收）有機顯色劑分類1、偶氮類2、三苯甲烷類3、三元（或多元）配合物的應用穩定、靈敏度、選擇性好，改善顯色條件Ti-EDTA-H2O2（四）、吸光度測量條件的選擇1、入射光波長選擇一般選maxmaxA但共存物或顯色劑等在max處也有一定吸收時，應選max附近或第二大被測物、干擾物吸收光譜類型：純溶劑---待測物質與顯色劑的產物有吸收試劑空白---除式樣外的其他溶劑試樣溶液----顯色劑無吸收，其他組分有吸收，但不參與顯色反應2、參比溶液的選擇（四）、吸光度測量條件的選擇3、吸光度讀數范圍的選擇（四）、吸光度測量條件的選擇兩式相除：以有限值表示不同透光率時測定濃度的相對誤差ΔcB/cB(ΔT=0.01)

T/%95908070605036.83020105220.610.75.64.03.32.92.72.83.24.36.513.0測定相對誤差與透光率的關系在T=36.8%(A=0.434)時，濃度測定的相對誤差最小。在實際測定時，常將吸光度控制在0.2~0.7(T=20%~65%)之間。一、多組分的測定a不重疊b重疊第五節、吸光光度法的應用了解例：用光程為1cm的吸收池，在兩個測定波長處測定含有K2Cr2O7和KMnO4兩種物質溶液的吸光度。混合物在450nm處的吸光度為0.38，在530nm處的吸光度為0.71，求混合物的組成。已知1.010-3mol/L的K2Cr2O7在450nm處吸光度為0.20，而在530nm處為0.05；1.010-4mol/L的KMnO4在450nm處無吸收，在530nm處吸光度為0.42。了解KMnO4K2Cr2O7450nm530nm530nm第五節、吸光光度法的應用酸堿解離常數的測定配合物組成及穩定常數的測定雙波長分光光度法了解第六節紫外分光光度法可見光：380~780nm紫外光：200~380nm可見分光光度法：只能測定有色或與顯色劑發生顯色的物質；紫外分光光度法：可測定在近紫外區（200~380nm）有特征吸收的任何物質(有無顏色均可)。了解一、751-G型分光光度計P284/13-12光源：氫燈、鎢燈紫外光不能透過玻璃,用石英二、紫外分光光度法的應用（一）、定性鑒別比較max,(max)ora(max)紫外分光光度法醋酸可的松23839.0醋酸潑尼松23838.5maxa(238)了解（二）、定量測定光的吸收符合lambert-Beer定律例：解：已知a(361)=20.7L.g-1.cm-1b=1.00cm