肺炎支原體的實驗室檢測方法綜述,醫學檢驗論文肺炎支原體(myeoplasmapneumoniae,MP)是一類沒有細胞壁,呈高度多形態性,可通過細菌濾器,能在無生命培養基上生長繁衍的最小的原核細胞型微生物.由于這類微生物無細胞壁,常呈絲狀或分支狀,故稱其為支原體[1].肺炎支原體是引起急性呼吸道感染的常見病原體之一,主要由口、鼻分泌物經空氣傳播,是引起人類支原體肺炎(亦稱為原發性非典型性肺炎)的病原體,近年來MP感染率呈逐年上升趨勢[2],尤其多見于兒童,可占小兒肺炎的10%~20%,流行年份可達30%[3,4].支原體感染一年四季均可發生,但以8~10月份發病率最高.支原體肺炎肺部體征較輕,甚至無異常感覺和狀態,根據流行病史、患者的臨床異常感覺和狀態、胸片等檢查經常不容易將其與一般病毒、細菌及結核桿菌感染引起的呼吸道感染相區別[5].由于其與人體某些組織存在著部分共同抗原,故感染后可構成相應的本身抗體,引起血液系統、神經系統、消化系統、心血管系統以及肌肉、皮膚、關節等器官的免疫損害,病情嚴重者還可危及生命.隨著人們對肺炎支原體認識的不斷加深和檢測技術的迅速發展,實驗室診斷方式方法也日益增加.當前針對MP的實驗室診斷技術主要有病原體的分離與培養法、免疫學檢測、分子生物學檢測等幾類,本文通過查閱檢索大量文獻資料將檢測MP的方式方法進展綜述如下.1肺炎支原體的分離與培養培養法是檢測病原體存在的直接證據,是檢測肺炎支原體的金標準.可分為一般的固體培養法和快速培養法.1.1固體培養法肺炎支原體對培養基的營養要求較高,除基礎營養物質外,培養基中需參加10%~20%的人或動物血清,以提供膽固醇和長鏈脂肪酸,并可穩定細胞膜.初次分離培養時需添加10%的酵母浸膏,并提供5%CO2,最適pH值為7.6~8.0,低于7.0時將導致其死亡.最適溫度為36~37℃,支原體生長緩慢,在1.4%血瓊脂培養基上培養3~10d可構成油煎蛋樣菌落.菌落在低倍鏡下觀察核心區較厚呈圓形,好像蛋黃伸入培養基中,周圍薄薄一層顆粒區,形同蛋清,菌落同時能吸附豚鼠紅細胞并能產生溶血素,出現溶血環.在實驗室培養中出現即可確診為肺炎支原體[6].培養法是檢測肺炎支原體的金標準,一旦檢出,即可確診.但其缺點在于需要的時間長,一般培養需2周左右,生長條件苛刻,當標本中MP數量少、培養基營養標準不夠或操作方式方法不當時,就會出現假陰性結果;并且呼吸道存在較多的雜菌,陽性率低,直接影響臨床的快速診斷,使患者得不到及時有效的治療.當前僅在科研單位進行科研活動,臨床一般不采用.1.2快速液體培養法近年來,隨著微生物診斷技術的快速發展,已經出現48~72h,甚至24~48h即可出結果的肺炎支原體培養試劑盒,并可同時做藥敏試驗,這在一定程度上彌補了傳統培養時間慢的缺點.咽部分泌物、支氣管分泌物、痰液等都可作為標本進行MP的培養,該方式方法對實驗室的要求不高,可明顯縮短MP培養法的檢測時間,并且避免了抽血造成的痛苦,尤其適用于年齡較小的兒童.該方式方法的原理是肺炎支原體在生長經過中發酵葡萄糖產酸,使培養基中酸堿指示劑發生顏色變化來作為肺炎支原體生長的指征,并且在培養的同時進行藥敏試驗,可大大縮短檢測的時間.標本中其他支原體和細菌則因培養基中加人了青霉素、醋酸陀和生物抑菌劑而被抑制[7]進而保證該方式方法的特異性[8],但當樣本中有分解葡萄糖的非目的菌對培養基中的抑菌劑無效時可能造成假陽性結果[9],影響到診斷的準確性[10].假如患者檢測前已經服用對MP敏感的藥物會導致檢出率降低.據謝國艷等[11]報道,這種方式方法檢測MP的假陽性率較高,細菌和真菌的培養陽性率已到達了7.9%,因而有必要在培養48h作第一次斷定結果后轉種進一步做一般細菌培養,再一次對培養結果作分析后才能做出準確判定.同時,從試驗結果看出,引起MP培養假陽性的標本中真菌所占比例最大(主要為念珠菌),已到達71.1%,講明真菌感染時MP的培養陽性率會大幅度提高,這可能與念珠菌在呼吸道疾病中多見而MP培養又多取材于呼吸道有關,故此項檢測方式方法有一定的局限性.另外在觀察藥敏結果時,致病病原體所致的假陽性可在一定程度上反映該病原體對抗生素的敏感程度,藥敏結果可提供一定的臨床價值,但是非致病菌所致的假陽性就有可能誤導臨床用藥治療.2肺炎支原體的免疫學檢測2.1肺炎支原體抗原檢測2.1.1采用不同株MP單抗,用雙抗體夾心ELISA法檢測MP抗原,該方式方法技術操作較簡單,特異性也強,與種屬相近的支原體沒有穿插反響,用PCR方式方法做平行測得,結果顯示無顯著性差異[12].2.1.2采用熒光素標記的P1蛋白單克隆抗體檢測痰或咽拭子標本中的P1蛋白抗原.此法特異性強,但單克隆抗體制備復雜、技術要求高,還未普遍開展.2.2肺炎支原體抗體檢測2.2.1非特異性抗體試驗2.2.1.1冷凝集試驗(Coldagglutinationtest,CAT)一種診斷肺炎支原體感染的非特異性試驗.冷凝集素是抗紅細胞I抗原的IgM抗體,在0~4℃條件下可凝集患者的O型紅細胞或本身紅細胞,在37℃時呈可逆性的散開.多數肺炎支原體患者于感染后第2周血中冷凝集素效價到達1∶32或更高層次,一般以效價達1∶64或動態檢測增長4倍以上時有診斷意義.抗體滴度和特異性隨肺炎嚴重程度增加.但本試驗特異性不強,除肺炎支原體患者外,如傳染性單核細胞增加癥,肝病,溶血性貧血,流行性感冒,風疹,嬰幼兒腺病毒、副流感病毒等引起的肺炎和呼吸道感染等病毒性疾病的患者,血中都可檢測到冷凝集素,出現假陽性反響.因而,臨床診斷價值不大,但因其方式方法簡單,在長時間內作為輔助診斷肺炎支原體的方式方法,隨著檢測技術的不斷發展,如今已基本被淘汰.2.2.1.2MG鏈球菌凝集試驗肺炎支原體感染后,約有1/3的患者血清中可出現能和甲型鏈球菌MG株凝集的抗體,效價1∶20,而病毒性肺炎不出現此抗體,有助于兩者的區別.2.2.2特異性抗體試驗肺炎支原體感染后可產生特異性的IgM、IgG類抗體.華而不實IgM類抗體出現最早,檢測MP-IgM可作為早期感染的診斷指標,但重癥感染及再感染者可能無此抗體產生.因而MP-IgM陰性不能否認MP感染,需檢測MP-IgG和IgA抗體,但特異性不如IgM.2.2.2.1補體結合試驗(Complementfixationtest,CFT)人感染MP后,MP的抗原糖脂成分刺激機體產生特異性抗體,與肺炎支原體細胞膜成分致敏的綿羊紅細胞結合構成固著補體使之不發生溶血反響,反之則激活補體,與后參加指示系發生溶血反響.抗體滴度在1:32以上有診斷價值.補體結合試驗的敏感性高,特異性很好,缺陷是初次感染時出現陽性率高,再次感染時容易出現假陰性反響.并且與生殖道支原體及嗜肺軍團菌存在穿插反響,在某些神經系統疾病和急性胰腺炎時可出現假陽性,且補體結合試驗操作較繁瑣,不適用于臨床常規檢測.因而這種方式方法當前臨應上不常用.2.2.2.2被動凝集試驗是當前廣泛應用于臨床的診斷肺炎支原體感染的一種方式方法,大多使用由日本富士瑞必歐株式會社生產的SERODIA@一MYCOⅡ試劑盒.其采用肺炎支原體(Mac株)細胞膜成分致敏人工明膠粒子,通過致敏粒子與人血清中的MP抗體發生凝集反響,操作簡單,影響因素少,并盡可能消除以往被動凝集試驗以動物紅細胞為載體所引起的非特異性凝集,凝集圖像清楚明晰,過夜后再判讀不發生顯著變化,并且結果判定容易.具有操作簡單、特異性強、設備要求低等優點,較合適臨床使用,是一項值得推廣的技術.缺乏之處是該技術的靈敏度仍然不夠高,隨著MP特異性抗原的不斷發現,被動凝集法診斷技術將愈加完善,檢測靈敏度也必將提高.2.2.2.3酶聯免疫吸附試驗(Engyme-linkedimmu-nosorbentassay,ELlSA)酶免疫測定技術中應用最廣的技術.ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優點,應用于肺炎支原體,可檢測IgM和IgG抗體,方式方法敏感,特異性高,是診斷肺炎支原體感染實用可靠的手段,如今已有多家廠商出售ELISA試劑盒,在臨床上應用也很廣泛.ELISA法是國內應用較為成熟的實驗方式方法,其有較高敏感度的優點為大家長期所接受,但其反響時間長,反響步驟也相對較多,檢出率雖與PCR法檢出率相當.但也需要洗板機、酶標儀等設備,而且所需時間較長.2.2.2.4間接免疫熒光試驗(Immuno-fluorescencetest,IFT)免疫熒光技術是標記免疫技術中發展最早的一種.該方式方法是用MP在培養基上生長的菌落做抗原,檢測MP-IgM、IgG抗體.該方式方法特異性高,但敏感性稍差,并且需要購置熒光顯微鏡才能觀察.2.2.2.5金標滲濾法(GIFA)和金標免疫層析法(GICA)二者都是一種以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體檢測的免疫標記技術,反響原理基本一樣.兩種檢測方式方法均無需任何儀器設備,操作簡單快速,最適宜一般基層醫院開展應用,但結果報告只能告之以陰性陽性,不能報告滴度.2.2.3MP外膜蛋白抗體測定通過研究證明MP的某些膜蛋白具有抗原性及免疫原性.P蛋白是主要免疫原之一.Jocobs用免疫印跡法分析MP患者血清,發如今感染急性期、恢復期及感染后5個月能測出P蛋白抗體,以為P蛋白可用于MP感染的實驗室診斷.3肺炎支原體的分子生物學檢測隨著分子生物學的不斷進展及實驗診斷學的進步,分子生物學技術在支原體研究領域也被廣泛地應用,發展了聚合酶鏈反響(PCR)和基因探針等分子生物學檢測方式方法[13-14],對疾病的診療起了較大的推動作用.3.1聚合酶鏈反響(PCR)可分為普通PCR、熒光定量PCR、實時定量熒光PCR.1992年PCR法開場應用于MP感染的臨床標本的檢測,在MP感染早期診斷優于血清學試驗和生物芯片法,被以為是診斷MP感染的一種有價值的方式方法,但引物的選擇是關鍵.MP含DNA和RNA兩種核酸,其基因組為環狀雙鏈DNA.Jensen根據16rRNA基因的可變區P1蛋白基因的序列設計出兩對引物擴增上述兩基因的一部分(583bp和153bp),經實驗證明此法快速、特異、敏感[11],可檢出10cFu/ml的MP.PCR法檢測快速、特異性和敏感性高,檢測標本中的MP不需要是活體,不受患者免疫功能、病程、感染程度、有無使用藥物治療及未到達血清檢測水平的影響,能夠更早期地檢測到MP的感染,使MP的早期診斷和抗生素的正確選擇成為可能.對早期及未生成抗體者及抗體已消失的感染患者有積極的意義;有助于早期診斷,及時治療,并且不存在穿插反響和放射性污染,易標準化.固然PCR法檢測快速,在某種意義上可替代培養法,但其高敏感性也使PCR法對實驗環境和儀器要求比擬高,存在著技術條件要求高、操作復雜、不易普及的問題,一般基層實驗室難以開展,且價格也相對較高.實時定量熒光PCR將基因擴增的敏感性以及分子雜交的特異性以及光化學的精到準確性合二為一來對肺炎支原體進行檢測,通過基因技術,能夠在較短的時間內使含量極低的核酸片段擴展至數百萬個拷貝,因而靈敏度、特異性均較高,且操作簡單,是當前公認的準確性和重復性最好的核酸分子技術.3.2基因探針隨著分子生物學的發展,DNA探針雜交技術被用于MP的檢測,提高了特異性和敏感性,但由于操作復雜,又需防放射性污染,因而限制了它的臨床應用.基因檢測法的高敏感性、高特異性在能夠對微量樣本和早期感染樣本進行檢測的同時,也容易由于操作不當或環境因素而遭到污染導致結果的不可靠,另外該法要求特殊的儀器、較高的人員素質,也是限制其使用的因素.3.3蛋白芯片法蛋白芯片是近年來在生命科學領域中迅速發展起來的一項高新技術,是一種高通量、高靈敏度、高特異性,且微型化的蛋白質分析技術.蛋白芯片分析本質上就是利用蛋白質之間的互相作用對樣本中存在的特定蛋白質進行檢測,可同時快速發現多個生物標記物.但芯片法成本高,同時大量不同蛋白質的高效表示出與純化問題有待提高.蛋白芯片法檢測肺炎支原體感染具有重復性好、操作簡便、快速等優點[15],但是利用蛋白芯片技術對于蛋白質功能的研究仍然存在著種種問題.因而,蛋白質芯片法檢測肺炎支原體感染的臨床應用價值還需要進一步探尋求索.4肺炎支原體的活體檢測利用超高倍顯微鏡直接檢測肺炎支原體,該方式方法經濟、簡便、快速、直觀,并配有彩圖,最大限度地增加了患者的信任度[16-17].病理研究證實肺炎支原體是呼吸道及其他器官感染的重要病因之一.支原體肺炎的治療關鍵在于及時確診并予以針對性治療,能夠在早期快速地對感染MP的患者進行確診,避免濫用抗生素,給患者提供及時有效的治疔,減輕患者的經濟負擔,所以建立有效、敏感的早期檢測方式方法特別重要.綜上所述,隨著科學技術的不斷發展,檢測肺炎支原體的方式方法日益增加,各有其優缺點.傳統的分離培養方式方法要求高、敏感性低、耗時長等,限制了其在臨床上的應用.免疫學檢測,其特異性和敏感性適中,簡便快速,尤其是血清被動凝集試驗和ELISA這兩種檢測方式方法更為合適一般實驗室常規檢測.分子生物學檢測法具有高敏感性和高特異性、檢測快速,在某種意義上可替代培養,但其高敏感性也對實驗環境和儀器要求高,其高假陽性制約了方式方法的廣泛使用.這就要求在選擇試驗方式方法時,要根據各自實驗室的技術條件和經濟條件選擇敏感性和特異性相對較高,又合適臨床檢測要求的檢測方式方法,必要時結合患者的臨床表現,可選用一種或多種方式方法聯合檢測.參考文獻[1]陸曙梅.微生物學與免疫學基礎[M].鄭州:河南科學技術出版社,2007:61.[2]徐慧香,張慧燕,車大鈿,等.小兒肺炎支原體肺炎106例臨床分析[J].中國實用兒科雜志,2007,22(1):51.[3]安黎云,冉向陽,王縛鯤,等,肺炎支原體肺炎患兒外周血白細胞和炎性因子檢測的臨床意義[J].醫學動物防制,2018,27(6):499-501.[4]王縛鯤,賈恒川,安黎云,等,肺炎支原體肺炎患兒微量元素含量變化及結果分析[J].醫學動物防制,2018,27(4):326-327.[5]曹玉璞.肺炎支原體感染的實驗室診斷[J].中國實用兒科雜志,1993,8(3):203.[6]袁育康.醫學免疫學與病原生物學[M].北京:北京醫科大學出版社,2000[7]蔣玉蓮,黃彩芝,賴源,等.兒童三種肺炎支原體檢測法的臨床應用分析[J].中華當代臨床醫學雜志,2007,5(1):56-57.[8]屈玲,李芳芹,艾芳.肺炎支原體快速培養法在兒童呼吸道感染中的應用[J].延安大學學報,2018,7(3):121-124.[9]呂泰霞,趙水娣.