IKCa1與內膜容受性和胚胎植入的關系,人體生理學論文摘要：目的檢測中電導鈣激活性鉀離子通道〔IKCa1〕在圍著床期子宮內膜的表示出及其在胚胎著床經過中的作用。方式方法分別取分泌和增生早、中、晚期子宮內膜組織各5例。應用qPCR和免疫組化技術檢測各期IKCa1mRNA和蛋白的表示出。體外培養人子宮內膜癌Ishikawa細胞，不同濃度〔0、10、20、30?mol/L〕IKCa1阻滯劑TRAM-34干涉后，qPCR檢測細胞IKCa1表示出，CCK-8法檢測細胞增殖能力，Transwell實驗檢測細胞體外胚胎黏附能力，Westernblot檢測細胞上皮-間質轉化〔EMT〕相關蛋白E盒結合蛋白1(Zeb1)和上皮型鈣黏蛋白〔E-cadherin〕表示出。結果IKCa1在人子宮內膜中呈時序性表示出，分泌期表示出水平較增生期顯著增高，以分泌中期最高。TRAM-34抑制IKCa1表示出后，Ishikawa細胞增殖和胚胎黏附能力減弱；EMT標志蛋白E-cadherin表示出顯著上調，Zeb1表示出顯著下調〔P0.05〕。結論IKCa1可能介入圍著床期子宮內膜容受性的建立，并通過影響子宮內膜細胞增殖和EMT調控胚胎著床。本文關鍵詞語：瞬時電導鈣激活鉀通道;子宮內膜;胚胎植入;上皮-間質轉化;鈣黏著糖蛋白類;E盒結合鋅指蛋白1;Abstract：ObjectiveTodetecttheexpressionofintermediate-conductance-Ca2+-activatedK+channels(IKCa1)inendometriumduringperi-implantationandexploretheroleofIKCa1inembryoimplantation.Methodstissuesamplesofearly,middleandlatesecretorystagesandearly,middleandlateproliferativestagesweretakenrespectivelyin5cases.ImmunohistochemistryandquantitativePCR(qPCR)wereusedtodetecttheexpressionofIKCa1mRNAandproteininendometrialtissuesofdifferentstages.Ishikawacellswereculturedinvitroandtreatedwithdifferentconcentrations(0,10,20and30?mol/L)ofIKCa1blockerTRAM-34.TheexpressionofIKCa1wasdetectedbyqPCR,cellproliferationwasdetectedbyCCK8,thecelladhesionwasdetectedbyTranswellandtheexpressionsofEMTrelatedproteins,E-boxbindingprotein1(Zeb1)andE-cadherinweredetectedbyWesternblotassay.ResultsTheexpressionofIKCa1wastime-dependentinhumanendometrium.TheexpressionlevelofIKCa1wassignificantlyhigherinsecretoryphasethanthatinproliferativephase,especiallyinmiddlesecretoryphase.TheexpressionofIKCa1wasinhibitedbyTRAM-34inIshikawacells.Thecellproliferationandembryoadhesiondecreased,theexpressionofEMTmarkerproteinEcadherinwassignificantlyup-regulated,andtheexpressionofZeb1proteinwassignificantlydownregulated(P0.05).ConclusionregulateembryoimplantationbyinfluencingendometrialcellproliferationandEMT.Keyword：intermediate-conductancecalcium-activatedpotassiumchannels;endometrium;embryoimplantation;epithelial-mesenchymaltransition;cadherins;zincfingerE-box-bindinghomeobox1;胚胎的成功著床取決于胚胎的侵入能力和子宮內膜的容受性。胚胎植入時需要迅速重塑子宮內膜上皮屏障和恢復其免疫功能，而子宮內膜上皮細胞的上皮-間質轉化〔EMT〕對子宮內膜上皮細胞的容受性起著重要作用[1]。血管生成和血管重塑也為內膜容受性的建立提供物質基礎[2]。胚胎著床是一個母胎互相辨別、互相融合的復雜經過。圍著床期母胎免疫調節的任一環節失常都可能導致著床失敗。中電導鈣激活性鉀離子通道〔IKCa1〕屬鈣激活鉀通道〔KCa〕蛋白家族成員，由IKCa1基因編碼。研究證實IKCa1在子宮內膜上皮及其癌細胞株中表示出，可促進EMT[3]，并促進細胞增殖、遷移和侵襲[4,5,6]；亦可調節Th1/Th2細胞功能，介入血管生成[7,8,9]。由此揣測IKCa1可能通過促進胚胎侵入，誘導子宮內膜EMT和血管生成，加速子宮內膜重塑和建立容受性，調節母胎免疫耐受等介入調節胚胎植入。為探究IKCa1在胚胎著床經過中的作用，本研究采用免疫組化技術檢測IKCa1和EMT標記蛋白在圍著床期子宮內膜的表示出，并利用IKCa1通道阻滯劑TRAM-34降低子宮內膜細胞IKCa1表示出及活性，討論IKCa1與內膜容受性和胚胎植入的關系。1、材料與方式方法1.1、材料1.1.1、組織標本收集2021年1月12月在西南醫科大學附屬醫院生殖中心接受體外受精-胚胎移植〔IVF-ET〕助孕前1周期行子宮內膜活檢的患者，分別取分泌和增生早、中、晚期子宮內膜組織各5例。納入標準：年齡38歲，月經周期規律且有排卵，基礎性激素水平正常，周期25～35d，近3個月無激素類藥物使用史及宮腔操作史，宮腔形態正常。排除標準：有子宮黏膜下肌瘤、子宮畸形、內膜息肉、宮腔粘連者，宮腔形態異常、染色體異常者，性傳播疾病者。所有標本一部分經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后用于免疫組化染色，一部分凍存于液氨內用于后續研究。本研究經醫院倫理委員會討論通過，所有患者均簽署知情同意書。1.1.2、細胞系人子宮內膜癌Ishikawa細胞株和人絨毛膜癌JAR細胞購自西南醫科大學附屬醫院醫學實驗中心，復蘇后單層培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養。1.1.3、主要試劑SP-9000免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，DAB染色試劑盒、4%多聚甲醛溶液、兔抗E-cadherin多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，TRAM-34、DMSO購自美國Sigma公司，胎牛血清、DMEM培養液、Transwell小室購自美國Corning公司，結晶紫、SDS凝膠試劑盒、PVDF膜、ECL發光液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，兔抗GAPDH多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司，兔抗IKCa1、E盒結合蛋白1(Zeb1〕多克隆抗體購自美國SAB公司，SYBRGreen熒光定量PCR(qPCR〕檢測試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，辣根過氧化物酶〔HRP〕標記山羊抗兔IgG二抗購自安徽合肥蘭杰柯科技有限公司，引物委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。1.2、方式方法1.2.1、qPCR檢測子宮內膜組織和Ishikawa細胞IKCa1mRNA表示出增生期和分泌期子宮內膜組織以及Ishikawa細胞，根據TRIzol一步法提取總RNA，用Oligo(dT)18進行逆轉錄。IKCa1引物序列：上游5-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3，下游5-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3；內參照GAPDH引物序列：上游5-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3，下游5-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3。PCR總反響體系：cDNA1?L，上、下游引物各1?L,2UltraSYBRMix10?L,ddH2O補充至20?L。PCR擴增反響條件：95℃預變性10min;94℃變性10s,65℃退火20s,72℃延伸15s，循環40次；72℃終末延伸10min。以2-Ct方式方法分析IKCa1mRNA的相對表示出量。1.2.2、免疫組化檢測子宮內膜組織IKCa1蛋白表示出石蠟切片經脫蠟、水化后，置于檸檬酸鹽緩沖液中加熱至95～100℃12min進行抗原修復。經PBS清洗3min3次，3%過氧化氫孵育10min，清洗，5%山羊血清封閉20min。參加IKCa1一抗〔1∶100)4℃孵育過夜，清洗，生物素結合山羊抗兔IgG聚合物室溫30min,HRP標記的鏈霉親和素溶液室溫30min。DAB顯色劑顯色1～2min，自來水沖洗，蘇木素復染2min，鹽酸乙醇分化2s。經脫水、透明、封片后，于顯微鏡下觀察染色結果并拍照。染色強度分級：0分〔無染色〕，1分〔弱染色〕，2分〔中度染色〕，3分〔強烈染色〕。陽性細胞百分率：0分〔0～5%〕、1分〔6%～25%〕、2分〔26%～50%〕和3分〔51%～100%〕。免疫組化評分即兩者乘積，總分3分為陽性，3分為陰性[10]。1.2.3、細胞培養與分組對數生長期Ishikawa細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM中，置于37℃、5%CO2培養箱中常規培養。采用DMSO配制10mmol/LTRAM-34儲備液，待細胞貼壁后，實驗組參加不同濃度TRAM-34，使其終濃度分別為0〔僅參加等量DMSO〕、10、20、30?mol/L，各組細胞繼續培養48h后分別收集細胞進行后續實驗。1.2.4、CCK-8法檢測子宮內膜細胞增殖取對數生長期Ishikawa細胞制備成細胞懸液，接種到96孔板中，每孔添加200?L細胞懸液，各組設3個重復樣本。37℃，5%CO2培養48h后每孔參加10?LCCK-8試劑，用酶標儀檢測其在450nm處的光密度〔OD〕值。1.2.5、體外模擬胚胎植入實驗〔Transwell法〕取對數生長期Ishikawa細胞用含10%胎牛血清的DMEM制成細胞懸液，每孔1105個接種培養于24孔板，待細胞貼壁后參加不同濃度的TRAM-34。放置Transwell小室，JAR細胞接種前予無血清DMEM處理細胞24h，每孔1104個JAR細胞接種培養于小室上室，置CO2培養箱〔5%CO2、37℃〕中培養48h。取出小室，將小室內側面的細胞去除，保存外側面的細胞。4%多聚甲醛固定細胞30min。甩干，結晶紫孵育30min，自來水沖洗5min，室溫下自然枯燥。在倒置相差顯微鏡〔OLYMPUS，日本〕下觀察并拍照。隨機讀取5個視野并計數穿膜細胞數。1.2.6、Westernblot檢測子宮內膜細胞EMT標記蛋白表示出變化Ishikawa細胞裂解后12000g離心15min，收集上清，以BCA法測蛋白濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，蛋白樣品煮沸10min預變性，上樣，以濃縮膠80V40min，分離膠120V70min進行恒壓電泳，250mA恒流轉膜，PVDF膜置于5%脫脂牛奶室溫2h;TBST洗膜，一抗E-cadherin(1∶500〕、Zeb1(1∶500〕和GAPDH(1∶8000)4℃過夜，二抗〔1∶10000〕室溫孵育2h。洗膜后添加ECL發光液，置于Bio-Rad凝膠成像系統顯影后分析目的蛋白的相對表示出量。SPSS19.0Graphpad6.01.3、統計學方式方法所有數據采用SPSS19.0和Graphpad6.0進行統計學分析，符合正態分布的計量資料以均數標準差〔s〕表示，2組均數間比擬采用獨立樣本t檢驗，多組均數間比擬用單因素方差分析，組間多重比擬采用LSD-t法。P0.05為差異有統計學意義。2、結果2.1、IKCa1在正常月經周期子宮內膜的表示出情況qPCR結果顯示，IKCa1mRNA在人子宮內膜月經周期各期均有表示出，增生各期表示出處于低水平，差異無統計學意義〔F=0.563,P0.05〕。IKCa1mRNA在分泌期子宮內膜的表示出，以分泌中期〔即圍著床期〕最為顯著〔F=27.750,P0.01〕，見圖1。免疫組化染色結果顯示，IKCa1在子宮內膜增生各期呈低表示出或不表示出，在分泌期呈高表示出，分泌中期表示出最強，主要表示出于腺上皮和腔上皮細胞胞漿，見圖2。圖1正常月經各周期子宮內膜IKCa1mRNA表示出水平Fig.1TheexpressionsofIKCa1mRNAinendometriumofnormalmenstrualcycle2.2、不同濃度TRAM-34對Ishikawa細胞增殖的影響qPCR結果顯示，與0?mol/L組相比，10、20、30?mol/LTRAM-34處理組IKCa1mRNA表示出水平隨藥物濃度增加明顯下降〔F=26.230,P0.01〕，見圖3。CCK-8結果顯示，隨TRAM-34濃度的增加，Ishikawa細胞增殖能力明顯下降〔F=275.100,P0.01〕；華而不實以30?mol/L組下降最為顯著，見圖4。2.3、不同濃度TRAM-34對Ishikawa細胞體外胚胎植入能力的影響Transwell結果顯示TRAM-34干涉子宮內膜Ishikawa細胞48h，其對體外胚胎的黏附能力顯著下降，穿過小室基底膜的JAR細胞數顯著減少，差異有統計學意義〔F=40.520,P0.01〕，見圖5、6。圖2正常月經各周期子宮內膜IKCa1蛋白表示出〔免疫組化染色，200)Fig.2TheIKCa1expressionsinendometriumofnormalmenstrualcycle(Immunohistochemicalstaining,200)圖3不同濃度TRAM-34處理后IKCa1mRNA在子宮內膜細胞的表示出Fig.3ExpressionsofIKCa1mRNAinendometrialcarcinomaIshikawacellstreatmentwithTRAM-34圖4不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞增殖能力變化Fig.4ChangesofIshikawacellproliferationabilityaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofTRAM-34圖5不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞對體外胚胎的黏附能力變化〔Transwell實驗,200)Fig.5ChangesofIshikawacelladhersionabilitytoembryosinvitroaftertreatmentwithdifferentconcentrationsofTRAM-34(Transwellassay，200)圖6不同濃度TRAM-34處理后Ishikawa細胞侵襲數量比擬Fig.6ComparisonofthenumberofIshikawacellsinvadedbydifferentconcentrationsofTRAM-342.4、不同濃度TRAM-34對子宮內膜細胞EMT相關蛋白表示出的影響與0?mol/L組相比，30?mol/L組細胞E-cadherin蛋白表示出明顯上調〔t=29.275,P0.01),Zeb1蛋白表示出明顯下調〔t=15.487,P0.01〕，見圖7。3、討論胚胎著床是妊娠的關鍵環節，是具備著床能力的胚胎與子宮建立嚴密聯絡的經過[11]。圍著床期子宮內膜處于容受狀態，允許胚胎黏附并侵入子宮內膜，子宮內膜基質細胞廣泛增殖和分化，發生蛻膜化構成初級蛻膜區，進而完成胚胎著床[12]。胚胎著床不僅需要發育成熟的囊胚，容受態的子宮內膜也是必不可少的，只要子宮內膜處于容受態時才會發生囊胚黏附[13]。在輔助生殖經過中胚胎移植成功率低的主要原因之一是胚胎移植時子宮內膜處于非容受態[14]。胚胎的正常著床對于后續妊娠維持和分娩均起重要作用，異常的胚胎著床可致流產、早產等[15]。圖7TRAM-34處理后Ishikawa細胞EMT相關蛋白表示出變化Fig.7ExpressionofEMT-relatedproteinsinIshikawacellsaftertreatmentwithTRAM-34KCa包括大電導KCa通道[BK(Ca〕]、IKCa1和小電導KCa通道〔SK3〕，均在子宮內膜細胞中表示出，BK(Ca〕通過介導子宮內膜感受性因子的表示出來影響胚胎著床，SK3表示出減少與妊娠失敗相關，IKCa1則介入細胞增殖的調控[16,17]。IKCa1可促進血管內皮細胞增殖和血管生成[18]，血管生成即建立血竇與血管網絡系統，在胎盤構成之前，其為胚泡提供營養和輸送氧，以保證胚胎生存和成功妊娠[19,20,21]。因而筆者揣測，IKCa1通道可能也與胚胎著床有一定關系。本研究發現，子宮內膜分泌中期IKCa1表示出明顯升高，此期正處于圍著床期，提示IKCa1可能介入子宮內膜著床窗的開放，有可能作為子宮內膜容受性的潛在分子標志物，促使子宮內膜到達容受態進而有利于胚胎黏附和植入。胚胎著床時，胚胎外滋養層的細胞穿透子宮內膜上皮細胞并侵襲入子宮內膜間質細胞，此時子宮內膜上皮細胞遷移和轉化的生物學行為和腫瘤細胞的侵襲和轉移具有極大的類似性[22]。當前常利用人子宮內膜癌細胞與人絨毛膜癌細胞模擬體外胚胎著床經過[23]。有研究發現EMT也介入了胚胎植入的調節，其誘發植入部位的子宮內膜上皮細胞的運動和遷移，進而在胚胎到達之前使子宮內膜獲得容受態[8]。本研究借鑒其實驗方式方法，結果發現，TRAM-34降低子宮內膜癌Ishikawa細胞IKCa1表示出后，細胞的增殖能力降低，EMT經過遭到抑制，對體外胚胎黏附能力降低，提示IKCa1通道可能通過EMT介入了胚胎植入的調節，發揮促進胚胎著床的作用。綜上所述，IKCa1在子宮內膜的表示出呈周期性，在圍著床期高表示出，有可能作為子宮內膜容受性的潛在標志物。因而，體外受精-胚胎移植前檢測子宮內膜IKCa1的表示出量，以評估子宮內膜的容受性，有助于提高胚胎移植成功率。以下為參考文獻[1]XuZ,ZhaoS,ZhouT,etal.LipoxinA4interfereswithembryoimplantationviasuppressionofepithelial-mesenchymaltransition[J].AmJReprodImmunol,2022,81(5):e13107.doi:10.1111/aji.13107.[2]KimM,ParkHJ,SeolJW,etal.VEGF-Aregulatedbyprogesteronegovernsuterineangiogenesisandvascularremodellingduringpregnancy[J].EMBOMolMed,2020,5(9):1415-1430.doi:10.1002/emmm.202002618.[3]ZhangP,YangX,YinQ,etal.InhibitionofSK4potassiumchannelssuppressescellproliferation,migrationandtheepithelialmesenchymaltransitionintriple-negativebreastcancercells[J].PLoSOne,2021,11(4):e0154471.doi:10.1371/journal.pone.0154471.[4]程慧，高蘭陽，詹平，等.IKCa1通道對HeLa細胞遷移、侵襲及miRNA表示出譜的影響[J].山東醫藥，2021,57(41):24-27.ChenH,GaoLY,ZhanP,etal.EffectsofIKCa1channelsonmigration,invasion,andmiRNAexpressionprofileofhumancervicalcancerHeLacells[J].ShandongMedicalJournal,2021,57(41):24-27.doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2021.41.007.[5]LiuL,ZhanP,NieD,etal.Intermediate-conductance-Ca2-activatedKchannelIKCa1isupregulatedandpromotescellproliferationincervicalcancer[J].MedSciMonitBasicRes,2021,23:45-57.doi:10.12659/msmbr.901462.[6]ZhangY,ZhangP,ChenL,etal.Thelongnon-codingRNA-14327.1promotesmigrationandinvasionpotentialofendometrialcarcinomacellsbystabilizingthepotassiumchannelKca3.1[J].OncoTargetsTher,2022,12:10287-10297.doi:10.2147/OTT.S226737.[7]ToldiG,LegnyN,OcsovszkiI,etal.CalciuminfluxkineticsandthecharacteristicsofpotassiumchannelsinperipheralTlymphocytesinsystemicsclerosis[J].Pathobiology,2020,87(5):311-316.doi:10.1159/000509674.[8]OrbnC,SzabD,BajnokA,etal.AlteredcalciuminfluxofperipheralTh2cellsinpediatricCrohnsdisease:infliximabmaynormalizeactivationpatterns[J].Oncotarget,2021,7(29):44966-44974.doi:10.18632/oncotarget.10036.[9]MohrCJ,SteudelFA,GrossD,etal.Cancer-associatedintermediateconductanceCa2+-activatedK+channelKCa3.1[J].Cancers(Basel),2022,11(1):109.doi:10.3390/cancers11010109.[10]ChenD,ZhouH,LiuG,etal.SPOCK1promotestheinvasionandmetastasisofgastriccancerthroughSlug-inducedepithelialmesenchymaltransition[J].JCellMolMed,2021,22(2):797-807.doi:10.1111/jcmm.13357.[11]LiuS,HeJ,ChenX,etal.CostimulatorymoleculeCD28participatesintheprocessofembryoimplantationinmice[J].ReprodSci,2020,21(6):686-695.doi:10.1177/1933719113512537.[12]LiaoXG,LiYL,GaoRF,etal.Folatedeficiencydec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