病毒感染的檢查方法

與防治原則11/19/2023012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染檢測：病毒感染的檢測方法:（針對病原體，針對特異性免疫反應）細胞培養鑒定病毒直接觀察檢測病毒抗原檢測病毒核酸中和檢測IgM檢測IgG4倍以上升高細胞因子檢測1/19/20233特異性檢測病毒特異性檢測抗病毒免疫標本采集與運送

標本的采集采樣時間盡可能在發病的初期，急性期或患者人院的當天進行。1/19/20234標本的采集標本種類的選擇根據臨床感染的癥狀及流行病學資料，判斷可能感染病毒種類，選擇相應部位采取標本。1/19/20235常見分離病毒標本的選擇1/19/20236病毒咽拭子糞便血液腦脊液唾液組織柯薩奇A和B組+++心單純皰疹病毒+腦膜腮腺炎病毒+++流感病毒+輪狀病毒+HAV+HIV+

精液常見標本的采集方法血液：以無菌取抗凝血10ml。抗凝選用100n／ml肝素鈉。用于分離CMV、HSV、黃病毒、EBV、HIV-1及新生兒腸道病毒。腦脊液：以無菌取腦脊液1～2ml，冰浴立即送檢。在4℃可存放72h。用于分離柯薩奇病毒、ECHO病毒、腸道病毒、腮腺炎病毒。宮頸或陰道拭子：采取病灶部位分泌物，或將拭子伸人宮頸約lcm停留5秒取出，冰浴立即送檢。用于分離HSV、CMV。糞便標本：取2～4ｇ糞便加10ml運送液立即送檢，用于分離腺病毒、腸道病毒和輪狀病毒。1/19/20237常見標本的采集方法含漱液：用無菌生理鹽水讓患者含漱。用于分離流感病毒、副流感病毒、鼻病毒、RSV等。喉拭子：用壓舌板避免唾液污染，用拭子采取咽喉部表面。用于分離腺病毒、CMV、腸道病毒、HSV、流感病毒等。尿道拭子及尿液標本：尿道拭子伸入尿道4cm轉動3次，以獲得較多的上皮細胞，用于分離CMV和HSV。尸檢標本：死亡后盡早采集各種器官，分別使用器械和容器。1/19/20238標本的運送和保存病毒抵抗力弱，室溫中容易滅活，用于分離培養的標本要盡快送檢，4℃下數ｈ或-70℃。凍存液中加入甘油或二甲基亞砜(DMSO)等作保護。病毒傳送培養基以Hanks液為基礎加滅活的小牛血清。為抑制細菌生長加青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml，為了抑制真菌的生長加入2．5μg／ml二性霉素B或40μg／ml制霉菌素。1/19/20239病毒感染檢測（標本采集）：病毒感染的檢測方法:（針對病原體，針對特異性免疫反應）細胞培養鑒定病毒直接觀察檢測病毒抗原檢測病毒核酸中和檢測IgM檢測IgG4倍以上升高細胞因子檢測1/19/202310特異性檢測病毒（感染位點/血液）特異性檢測抗病毒免疫（血液）病毒培養細胞分離培養原代細胞培養：由供體組織直接分離培養的細胞，稱之為原代細胞。二倍體細胞株：仍保持二倍體特性。壽命一般為40～50代，如人胚肺細胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。傳代細胞系：來于腫瘤細胞，染色體特征類似腫瘤細胞。常用的有人宮頸癌細胞(Hela)、人喉上皮癌細胞(Hep-2)。1/19/202311（常作為確證檢測的第一步）常用于病毒分離的細胞1/19/202312雞胚接種雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。雞胚對多種病毒敏感。一般采用孵化9～14天的雞胚，根據病毒種類不同，將病毒標本接種于雞胚的不同部位，最常用的雞胚接種部位有：羊膜腔、尿囊腔、絨毛尿囊膜和卵黃囊等。動物接種動物對病毒的敏感性是不同的，選擇合適動物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分離病毒。1/19/202313細胞培養的結果觀察細胞病變效應(CPE)：細胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，細胞溶解出現空斑，細胞融合形成多核巨細胞，胞漿內或核內出現嗜酸性或嗜堿性包涵體等；不出現細胞病變現象。（紅細胞吸附）細胞培養液pH的變化。1/19/202314基于細胞培養的檢測手段Transformation

lossofcontactinhibition1/19/202315CPE:Measles(風疹病毒)onhumanlungcarcinoma(A549)FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202316CPE:vaccinia(痘病毒)UninfectedInfectedFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202317RSV(呼吸道合胞病毒)-syncytia1/19/202318CPE:inclusionbodiesNegribodiesNegribodiesneuronImmunohistochemicalstainingofintra-cytoplasmicviralinclusionsintheneuronofahumanrabiespatient.(FieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.39.9)1/19/202319紅細胞吸附抑制試驗正粘病毒，副粘病毒感染的宿主細胞，病毒增殖后產生細胞病變，但在細胞表面含有病毒某些抗原成分(血凝素)，能吸附雞、豚鼠或猴紅細胞。可作為初步鑒定。如果在培養瓶中加入相應的血凝素抗血清后，不出現紅細胞吸附現象，是為紅細胞吸附抑制試驗陽性，可作為病毒鑒定的依據。1/19/202320紅細胞吸附addredbloodcells1/19/202321Hemadsorptionoferythrocytestocellsinfectedwithinfluenzaviruses,mumpsvirus,parainfluenzaviruses,ortogaviruses.Thesevirusesexpressahemagglutininontheirsurfaces,whichbinderythrocytesofselectedanimalspecies.(FromMedicalMicrobiology,5thed.,Murray,Rosenthal&Pfaller,MosbyInc.,2005,Fig.51-5.)Hemadsorption1/19/202322Plaqueformation1/19/202323PlaqueFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.51/19/202324Plaqueformation1/19/2023251:1001:101:101:101:101:1010-210-310-410-510-610-7virusserialdilutionplate1mlplaques100101(1000)(100,000)(10,000)Titer=1x107pfu/mlPlaqueassay:method1/19/202326PlaqueassayTiter=1.2x108pfu/ml1/19/202327免疫熒光1/19/202328免疫熒光可以直接用來檢測采集的標本中是否含有病毒抗原、細胞培養的病毒，或者用來檢測血清中是否存在特異性抗體。細胞蛋白表達檢測1/19/20232900h4h6h4h8h10h12h14h16h18h20h22h24h1/19/202330=infected=uninfectedEndpointtitrationFivereplicatewellsofcellsareinfectedwithonemlofeachoffourdifferentvirusdilutions,incubated,andscoredforinfectionbylookingforCPE.Inthisexample,thefinaltiteris106.3TCID50perml.(TCID=tissuecultureinfectivedose)10-510-610-710-85replicatesamplings12345dilution1/19/202331Endpointtitration1/19/202332106.35

TCID50perml病毒中和實驗(特異性抗體檢測)1/19/2023331/19/202334Hemagglutination(血凝檢測)RBC1/19/202335Titer=32HAunits/mlHemagglutinationtest1:81:21:21:21:21:28163264128256virusserialdilutiontopviewmixwithredbloodcellssideview1/19/202336Hemagglutinationassay.Sevendifferentsamplesofinfluenzavirus,numbered1through7attheleft,wereseriallydilutedasindicatedatthetop,mixedwithchickenredbloodcells(RBC),andincubatedonicefor1to2hours.Wellsinthebottomrowcontainnovirus.AgglutinatedRBCscoatwellsevenly,incontrasttononagglutinatedcells,whichformadistinctbuttonatthebottomofthewell.TheHAtiter,shownattheright,isthelastdilutionthatshowscompletehemagglutinationactivity.(FromFieldsVriology(2007)5thedition,Knipe,DM&Howley,PM,eds,WoltersKluwer/LippincottWilliams&Wilkins,PhiladelphiaFig.2.9)Hemagglutinationassay:influenzavirus1/19/202337血凝抑制實驗1/19/2023381/19/202339核酸類型鑒別及序列測定利用5—溴-2-脫氧尿苷(BUDR)抑制DNA復制的特性，在細胞培養液中加入該物質，可抑制DNA病毒的復制和增殖，抑制細胞病變的出現，但對RNA病毒無抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。對病毒核酸特異序列或全序列的堿基排列測定或DNA雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。1/19/202340耐酸試驗腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環境下易被滅活。乙醚敏感試驗病毒外圍如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細胞。可作為病毒是否具有類脂包膜的依據，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進行試驗。1/19/2023412、電鏡觀察病毒的很多特征如大小、形態、結構等必須借助電子顯微鏡進行檢查。對于目前尚難培養而形態又非常典型的病毒，可直接從感染組織或分泌液，或者接種病料的雞胚和細胞培養收獲的材料作電子顯微鏡檢查，直接觀察病毒粒子。1/19/202342雞痘病毒（超薄切片）1/19/202343Adenovirus電鏡負染1/19/202344腺病毒HumanRotavirus電鏡負染1/19/202345輪狀病毒Paramyxovirus(Parainfluenza)電鏡負染1/19/202346副流感病毒1/19/202347免疫電鏡1/19/202348通過測定病毒的特異標志成分，如特殊形態、特異的抗原成分及病毒的核酸，早期確認病毒的感染，是病毒學診斷的重大發展。——分子診斷3、快速診斷1/19/202349免疫檢測核酸檢測檢測機體免疫反應檢測病毒抗原檢測病毒核酸檢測特異性抗體檢測病毒組成1/19/202350方法學A間接法Ab1Ab2B夾心法Ab2Ab1C捕獲法D競爭法抗原標記物抗體支持介質免疫檢測ELISA1/19/2023511/19/2023521/19/2023531/19/202354A、納米微球膠體金彩色乳膠微球納米磁性微球納米熒光微球B、酶免紙條免疫檢測進展－化學發光1/19/202355

所謂化學發光(CL),就是化學反應的能量把體系中共存的某種分子從基態激發到激發態從而產生發光的現象。化學發光反應能級圖時間發光信號輝光坪區速率法測量原位進樣積分法測量閃光尖峰閃光與輝光及其測量方式的差別酶促發光化學發光1/19/202356免疫檢測進展－時間分辨熒光1/19/202357Antibodydetection:westernblot1/19/202358病毒感染檢測：病毒感染的檢測方法:（針對病原體，針對特異性免疫反應）細胞培養鑒定病毒直接觀察檢測病毒抗原檢測病毒核酸中和檢測IgM檢測IgG4倍以上升高細胞因子檢測1/19/202359特異性檢測病毒特異性檢測抗病毒免疫012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION核酸檢測模板擴增－PCR、NASBA、TMA、HDA、SDA探針擴增－RCA、Expar信號擴增－Invader、雜交1/19/202361RealtimePCR1/19/2023625’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI

PCR-probe1/19/2023635’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission1/19/202364RQExcitationXRQQRExcitationEmissionMolecularBeacon1/19/2023651/19/202366Taqman1/19/202367Scorpionprimers5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQRAmplifluorProbe1/19/202368Isothermal-NASBA1/19/202369Isothermal-TMA1/19/2023701/19/2023國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心福建省醫學分子病毒學研究中心71Amplification1/19/2023國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術研究中心福建省醫學分子病毒學研究中心72Detection(TMA)AE：吖啶酯InhighpHIsothermal-RCA1/19/202373Isothermal-HDA1/19/202374Isothermal-SDA1/19/202375Isothermal-Expar1/19/2023761/19/202377012345678910111213WeekResponseClinicalillnessALTIgMIgGHAVinstoolInfectionViremiaEVENTSINHEPATITISAVIRUSINFECTION病毒感染的特異性預防

主動免疫–疫苗被動免疫–免疫球蛋白1/19/202379HEV疫苗可預防的28種疾病Smallpox天花Rabies狂犬Cholera霍亂Typhoidfever傷寒Diphteria白喉Pert