會計學(xué)1DNA重組技術(shù)的基本工具上課用蘇云金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細(xì)菌的毒蛋白基因在棉花細(xì)胞中表達(dá)，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。普通棉花抗蟲棉第1頁/共37頁提取目的基因基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定第2頁/共37頁第3頁/共37頁1.1DNA重組技術(shù)的基本工具基本工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體——“分子運輸車”第4頁/共37頁（一）限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”①來源：主要從原核生物中分離純化出來。②種類：已從近300種微生物中分離出4000種限制酶。③作用：1.能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列2.使每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。第5頁/共37頁磷酸二酯鍵：第6頁/共37頁T磷酸二酯鍵1234512345A第7頁/共37頁具有特異性。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且能在特定的切點上切割DNA分子，④作用特點：大多數(shù)限制酶的識別序列由6個核苷酸組成少數(shù)的識別序列由4、5或8個核苷酸組成⑤限制酶的識別序列：第8頁/共37頁EcoRI限制酶的切割：黏性末端黏性末端在G與A之間切割

大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。第9頁/共37頁什么叫黏性末端？

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，他們之間正好互補配對，這樣的切口叫黏性末端。第10頁/共37頁CCCG

GGGGGCCC中軸線SmaI限制酶的切割：CCCG

GGG

GGCCC平末端平末端只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。第11頁/共37頁產(chǎn)生黏性末端或平末端。⑥限制酶的作用結(jié)果：第12頁/共37頁如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，會怎樣呢？

會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端，然后讓兩者的黏性(平)末端黏合起來，就似乎可以合成重組的DNA分子了。思考?第13頁/共37頁（二）“分子縫合針”——DNA連接酶1、種類：⑴E·coliDNA連接酶⑵T4DNA連接酶2、作用：第14頁/共37頁

可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，E·coliDNA連接酶或T4DNA連接酶即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵第15頁/共37頁

T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低第16頁/共37頁③類型：類型E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶來源功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別第17頁/共37頁將外源基因送入受體細(xì)胞。(三)基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體

——“分子運輸車”①載體的作用：質(zhì)粒λ噬菌體的衍生物動植物病毒等②載體的種類：第18頁/共37頁1.能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。2.具多個限制酶切點，以便與外源基因連接。3.具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。4.對受體細(xì)胞無害、容易提取

③作為載體的必要條件：第19頁/共37頁質(zhì)粒：

裸露的、結(jié)構(gòu)簡單的、獨立于細(xì)菌染色體（即擬核DNA）之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。第20頁/共37頁質(zhì)粒：能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制有切割位點有標(biāo)記基因的存在，可用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基鑒別。第21頁/共37頁限制酶DNA解旋酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制酶DNA水解酶區(qū)別限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。第22頁/共37頁比較：DNA連接酶與DNA聚合酶DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板第23頁/共37頁相同點：形成磷酸二酯鍵不同點：1）DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2）DNA聚合酶需要以一條DNA鏈為模板；而DNA連接酶不需要模板。不是一回事。第24頁/共37頁1）不屬于質(zhì)粒被選為基因載體的理由是（）

A、能復(fù)制

B、有多個限制酶切點

C、具有標(biāo)記基因

D、它是環(huán)狀DNAD練習(xí)第25頁/共37頁2）有關(guān)基因工程的敘述中，正確的是（）

A、所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的載體

C、載體必須具備的條件之一是：具有多個限制酶切點，以便與目的基因連接

D、DNA連接酶使黏性末端的堿基之間形成氫鍵C第26頁/共37頁3.下列四條DNA分子，彼此間具有粘性末端的一組是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D第27頁/共37頁４、關(guān)于限制酶的說法中，正確的是（）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是G—A之間的氫鍵C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C第28頁/共37頁５.（多選）有關(guān)基因工程的敘述中，錯誤的是

A、基因工程技術(shù)能定向地改造生物的遺傳性狀，培育生物新品種

B、重組DNA的形成在細(xì)胞內(nèi)完成

C、目的基因須由運載體導(dǎo)入受體細(xì)胞

D、質(zhì)粒都可作為運載體答案：BD第29頁/共37頁思考與探究P72、為什么限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？

通過長期的進(jìn)化，細(xì)菌中含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。第30頁/共37頁3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示：基因工程中作為載體使用的DNA分子很多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細(xì)菌擬核處染色體DNA之外的一種可以自我復(fù)制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：第31頁/共37頁1）載體DNA必需有一個或多個限制酶的切割位點，以便目的基因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣才不至于因目的基因的插入而失活。2）載體DNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNA上隨染色體DNA的復(fù)制而同步復(fù)制。3）載體DNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。4）載體DNA必需是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。5）載體DNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太大就不便操作。實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。第32頁/共37頁4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？

迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。第33頁/共37頁DNA聚合酶DNA連接酶區(qū)別1區(qū)別2相同點DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來，不需要模板第34頁/共37頁

限制酶所識別的序列，無論是6個堿基還是4個堿基，都可以找到一條中心軸線（如圖），中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向、對稱、重復(fù)排列的