黃芪對肺癌小鼠模型的干預機制研究

導師:孫廣仁教授學生：黃芪對肺癌小鼠模型的干預機制研究導師:孫廣仁教授1選題依據選題目的：通過建立小鼠肺癌模型，探討黃芪對肺癌的抑制和轉移的作用機制，以期在臨床上能有效的運用黃芪對肺癌治療提供實驗依據。建立肺癌小鼠肺模型，觀察黃芪對小鼠生存時間，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對小鼠腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制，為臨床防治提供實驗依據。選題依據選題目的：2選題意義根據中國衛生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國腫瘤發病率和十大惡性腫瘤發病率排序顯示，肺癌居男性惡性腫瘤發病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌[2]。2000年世界衛生組織的統計資料表明，每年全球的肺癌新發病例位1.2百萬，占全部惡性腫瘤的12.3％，死亡1.1百萬，占腫瘤全部死因的17.8％。更為嚴重的是，凡是煙草消費大國，其肺癌新發病率乃在不斷增長，成為越來越嚴重的危害人民生命和健康的常見疾病[3]。原發性肺癌是發達國家的主要腫瘤，以美國為例，1997年全美國肺癌的發生數男性為98300例，女性為79800例，分別是男女腫瘤發病率第二位。1997年因肺癌死亡的人數為160400人，居惡性腫瘤死亡率第1位，占全美國腫瘤死亡病人的29％[4]。選題意義根據中國衛生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國腫瘤3中醫藥在治療肺癌上有其自己的優勢，近幾年來應用辨證論治、專方、專藥及新藥新劑型等方法治療肺癌均有一定的進展，在穩定病灶、改善癥狀、提高生存質量、延長生存期等方面都具有一定的療效和優勢。因此研究中醫藥在肺癌治療中的作用有其很高的應用價值，能更好的服務于臨床中肺癌的治療。肺癌屬“肺積”、“息責”等范疇，屬于祖國醫學“咳嗽”、“咯血”、“肺積”，這與肺癌的臨床表現有相似之處。中醫學認為，肺癌是由于人體正氣不足，尤其是肺脾腎虛損，再加上六淫和七情等因素長期作用，導致肺氣不足，肺陰虧虛，升降失調，氣血瘀滯，內結于肺，形成積塊而發生的[6]。中醫藥在治療肺癌上有其自己的優勢，近幾年來應用辨證論治、專方4本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎上用黃芪對該病進行治療，通過觀察小鼠的一般情況，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對荷瘤小鼠腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制。預期成果不僅可為防治該病證提供新思路和理論依據，指導臨床對肺癌的預防、治療和康復，同時為的深層次機制和研究中藥微觀作用機制的研究進行資料積累，提供新思路和理論支撐。本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎上用黃芪對該病進行5課題設計研究內容與研究方法：以小鼠轉移肺癌模型為研究對象，采用中西藥對比進行治療，動態觀察小鼠的體重改變、抑瘤率的比較、肺組織內基質金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細胞因子的變化，從細胞分子水平闡釋這些變化，及黃芪和紫杉醇對肺癌的作用的相關性，觀察探討黃芪對肺癌的干預作用的動態變化及時效性，為防治肺癌提供新思路和理論依據。課題設計研究內容與研究方法：6技術路線動物實驗1.肺癌的臨床診斷：肺癌的臨床診斷必須依據臨床表現和各種影像結果進行綜合分析，但最后的確診必須取得細胞學或病理組織學的證據。任何沒有病理學或病理組織學證據的診斷，都不能為最后的診斷結果。依據這樣的原則，肺癌的診斷可分為肺癌的定位診斷和肺癌的定性診斷兩種，所有的影像學診斷法方可認為是定位診斷，而所有以獲取細胞學或病理組織學為目的的診斷科認為是定性診斷。定位診斷是基礎，定性診斷是關鍵。技術路線動物實驗72.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級動物實驗室中，無菌操作，取肺癌瘤小鼠腹水，稀釋至含瘤細胞2×1010/L，置冰上，每小鼠右腋皮下接種0.2ml，分別給模型組、中藥組和西藥組接種。接種次日24h后進行藥物抑藥瘤試驗；實驗設空白組和模型對照組，中藥組和西藥組。模型對照組中，每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，中藥組中每只小鼠腹灌胃0.4ml，100mg/ml。西藥對照組中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml，20mg/ml。每只小鼠每天用藥1次，連續用藥15天，停藥次日處死小鼠，剝離腫瘤，稱體重及瘤重，計算抑瘤率。2.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級動物8（2）藥物干預階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥物干預，以生理鹽水灌胃。中藥治療組小鼠黃芪煎湯灌胃。藥物制備：黃芪25g加8倍水，浸泡半小時，頭次煎煮半小時，濾出藥渣后加水至藥面以上3ml，再煎20分鐘。將兩次藥液混合、過濾，加壓濃縮至100%（即每毫升含生藥1.0g）的水提劑。用藥方法：將藥物按成人日服量換算，計算出小鼠日服量，每日對治療組小鼠灌服中藥煎劑0.4ml/100g體重，對空白組及肺癌模型組小鼠灌服生理鹽水0.4ml/100g體重。連續用藥15天，第16天處理所有小鼠。后脫頸處死小鼠,完整剖取接種的瘤塊,電子天平稱重，按公式:抑瘤率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。小鼠處死后，將整個肺取下。在雙盲條件下,計數肺轉移瘤灶的數目，按公式:肺轉移抑制率=(空白組平均肺轉移瘤灶數目-給藥組平均肺轉移瘤灶數目)/空白組平均肺轉移瘤灶數目×100%。（2）藥物干預階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥93.檢測指標（1）整體觀測：在實驗過程中觀察小鼠癥狀、體重、生存時間、呼吸、被毛情況、食量、飲水量，胸腔，縱膈，胸水。（2）瘤體重測定：小鼠處死后，去腫瘤組織，精密電子天平稱重。（3）血生化指標檢測：小鼠腹主動脈取血，以ELISA法測定、TNF-α的含量，放免法測定血漿中MMP-9的含量（4）瘤組織處理：腫瘤組織用福爾馬林液充分固定，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡下觀察期組織學變化。肺組織用福爾馬林固定12h,進行HE染色,在光學顯微鏡下觀察讀片,以進一步確認轉移灶的病理性質及特征。3.檢測指標（1）整體觀測：在實驗過程中觀察小鼠癥狀、體重104.統計學處理計量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異，均用SAS軟件進行統計學處理。4.統計學處理計量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分11技術路線圖SPF級昆明級小鼠55只隨機分組空白組10只模型組15只中藥組15只實驗全過程觀察小鼠的體重、一般情況、生存時間、胸腔、縱隔、胸水腫瘤接種血生化指標檢測：TNF-α、MMP-9的蛋白表達肺組織切片：肺病理觀察瘤體重的測定14天后停止用藥西藥組15只24h后開始用藥，模型組用生理鹽水，中藥組用黃芪，西藥組用紫杉醇技術路線圖SPF級昆明級小鼠55只隨機分組空白組10只模型組12可行性分析1．根據《內經》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而化生萬物矣”，“五氣入鼻，藏于心肺”，“肺者，氣之本。”，“諸氣者，皆屬于肺。”等論述，腫瘤的病因不外乎內因和外因兩個方面。“正氣存內，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。所以肺癌的發生也不外乎是氣虛所致。以此采用以補氣為主的黃芪治療。肺癌的發生與人體的免疫力下降有很大的關系，而現代的藥理研究顯示黃芪具有提高人體免疫力的作用，故采用黃芪干預肺癌的形成機制是可行的。所以理論上通過腫瘤種植建立轉移性肺癌的造模方法，建立肺癌的模型是可行的。可行性分析1．根據《內經》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而132．實驗方法：本課題針對中醫對腫瘤的病因病機和臨床表現的認識，借鑒現代醫學實驗方法，在建立肺癌小鼠模型的基礎上，并對模型進行了病理檢查、炎癥因子等方面的檢測以及方藥驗證。研究的思路和方法注重中醫藥理論的指導，對實驗結果的分析和相應對策也是從中醫學中氣的本源出發，立足于病藥相應的原則。3．實施保障：我們依托于山東中醫藥大學細胞生物學實驗室，屬國家中醫藥管理局三級重點實驗室，為開放實驗室，具備完成該項研究的實驗條件和所用儀器設備基本能夠滿足，實驗室操作人員經驗豐富，具體實驗操作熟練，預計可以實現本項目的預期目標。實驗中所涉及到的材料和試劑均為商品，在國內能夠買到。2．實驗方法：本課題針對中醫對腫瘤的病因病機和臨床表現的認識14本課題特色、預期取得的結果創新點：1．采用中醫學和現代醫學相比較的治療的方法，在肺癌病因和臨床表現的基礎上，用直接種植腫瘤的辦法建立轉移性肺癌的小鼠模型。2．在肺癌小鼠模型建立的基礎上用單味中藥黃芪和紫杉醇相比較對該病證進行對照治療，分析小鼠肺改變，明確肺組織內基質金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細胞因子的變化規律，從微觀角度闡釋該病證在治療過程中的動態變化，并初步明確藥物的作用機制或作用靶點。3．該課題觀察肺癌小鼠模型在黃芪的干預下的變化，以評價模型的穩定性和確定中藥干預的最佳時機，具有創新性。本課題特色、預期取得的結果創新點：15國內外研究動態1．小鼠肺癌模型研究概況目前常用的小鼠肺癌動物模型有：（1）將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。（2）將小鼠的氣管分離，經過反復凍融處理，然后將肺癌細胞接種到氣管，結扎氣管兩端后[12]，再將氣管移植到重度復合免疫缺陷小鼠的皮下。（3）切開胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺內[13-14]。此方法有一定的創傷性和死亡率，肺癌細胞生長在肺實質內，但只能使70%-90%的接種小鼠產生腫瘤，對進行進一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細胞直接注入重度復合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細支氣管內的肺癌模型[15]。國內外研究動態1．小鼠肺癌模型研究概況16有學者采用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨床特征，但是其技術要求較高，成功率較低[8-9]。也有人采用外科手術移植方法，同樣也是成功率低于10%[10]。彭鵬[11]采用清潔級小鼠C57BL/6小鼠的腋后線第6肋間胸腔(胸腔模型組)或小鼠腋部皮下（皮下模型組）分別移植鼠源性Lewis肺癌細胞0.2ml可作為晚期肺癌動物模型。。有學者采用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可17現在常用的轉移性肺癌動物模型有：①將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。②將小鼠的氣管分離,經過反復凍融處理,然后將肺癌細胞接種到氣管，結扎氣管兩端后，再將氣管移植到重度復合免疫缺陷小鼠的皮下[21]。③胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺臟內[22，23]。也有經靜脈注射或心室內注射等，建立肺癌轉移模型。現在常用的轉移性肺癌動物模型有：①將肺癌細胞接種于裸鼠或其他182．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據病人的身體情況及肺癌的類型和分期采取不同的治療方案。一般而言，非小細胞肺癌采取手術為主的綜合治療，小細胞肺癌則采用以化療放療為主的綜合治療[3]。在化療方面，臨床上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種化療方案。小細胞癌被列入有可能用化療治愈的疾病，目前的標準化療方案是CAV(環磷酰胺CTX，阿霉素ADR，長春新堿VCR)和EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）非小細胞肺癌對化療不敏感，常用的化療方案有EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）NP（去長春花堿NVB,順鉑DDP）GP(吉西他濱GEM，順鉑和卡鉑Carboplatin）TP(紫杉醇TAX，順鉑和卡鉑Carboplatin）DP（多西紫杉醇DOP，順鉑和卡鉑Carboplatin）。并且21世紀惡性腫瘤一個重要的治療方向是分子靶向治療，目前應用于肺癌的分子靶向藥物有表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼和埃羅替尼。這類藥物有一個非常顯著的特點是靶人群，如吉非替尼對女性不吸煙的肺腺癌有特別的效果[3]。2．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據病人的身體情況及肺癌的19從中醫理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發生腫瘤。周延峰用消瘤方治療非小細胞肺癌顯示消瘤方能提高機體免疫功能，降低患者血液粘度，抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，下調突變性P53基因[27]。陳璐[7]指出補腎化癖解毒方藥對小鼠移植性肺癌及小鼠肺轉移均有明顯的抑制作用并且補腎化癖解毒方藥能提高西藥順鉑(DDP)對兩者的抑制率。黃健飛[28]指出極低濃度的丹參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤有明顯抑制作用，其余濃度的丹參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤無明顯抑制作用，不同濃度的丹參注射液無明顯抑制荷瘤小鼠肺部轉移的作用，但低濃度和中濃度的丹參注射液能降低轉移相關因子MMP-9的表達。李保國[29]指出復方紫杉醇注射液對移植于C57BL/6小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。裘維焰[30]等指出四君子湯與IFN-γ，合用時免疚調節作用有著明顯影響，并可提高抑瘤率。王立強[31]等指出蘆薈苦素是蘆薈抗腫瘤、抗白血病的有效成分之一。其抗腫瘤機制可能為促進分裂中期微管聚集，干擾腫瘤細胞的有絲分裂過程和提高機體免疫力。從中醫理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發生腫瘤。周延峰用203．黃芪、腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶的變化癌的發生是一個多因素多階段復雜的過程，不僅有外因，還有遺傳因素，免疫狀態等宿主因素。據最新統計，中國死于惡性腫瘤的前五位癌癥主要依次為：胃癌，肝癌，食管癌，肺癌，大腸癌[32]。目前每年全世界至少有700萬人死于癌癥，我國約130萬。因此21世紀攻克癌癥這一世界難題，具有十分重要的意義。3．黃芪、腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶的變化癌的發生是一個多21（1）黃芪現代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調節包括對抗免疫抑制劑、增強體液免疫和細胞免疫功能、調整補體系統、提高紅細胞的免疫功能等方面作用。研究證實，黃芪能增加脾臟的重量、細胞數及抗體反應，對抗由強的松造成的免疫抑制及由環磷酞胺造成的脾臟重量下降，并能提高“虛證”小鼠血漿cAMP含量，加速淋巴細胞轉化，增強T細胞功能，顯著提高E一玫瑰花結形成率，還有誘生和促誘生干擾素、增強NK細胞及巨噬細胞活性的功能。黃芪的有效成分黃芪多糖能提高抗體形成細胞數，抑制Ts細胞，其對正常人及腫瘤患者外周血單個核細胞在體外分泌腫瘤壞死因子具有明顯的促進作用[32]。（1）黃芪現代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調節包括對抗免疫抑22黃芪免疫調節作用機制尚不完全清楚。一般認為黃芪的作用多系整體調節的結果，即所謂“虛者補之，損者益之”。黃芪在生長過程中從土壤中選擇性吸收硒，因而黃芪富含硒。硒對各種金屬如福、汞、甲基汞等一些化學致癌物質有拮抗作用；硒是谷膚甘膚過氧化酶的一個組成部分，此酶可以保護細胞免受生物氧化過程的損害;硒還能抑制癌細胞的氧化磷酸化作用。最近一項對過敏性哮喘豚鼠的研究顯示黃芪能顯著抑制過敏性哮喘豚鼠氣道壁細胞NF-kB的表達，此可為黃芪的作用機制之一[37]。此外黃芪總貳可使小鼠肝癌(HepA)和肉瘤(5180)細胞阻止于GO/G1期，并可誘導其凋亡[38]；使活化T淋巴細胞內游離鈣增加并增強鈣離子內流的驅動力[39]通過提高細胞表面粘附分子的表達而促進淋巴細胞與內皮細胞的粘附，從而促進淋巴細胞再循環[40]。柏長青等[41]指出黃芪提取物注射液能夠明顯降低肺癌患者化療期間常見毒副反應的發生率和嚴重程度，改善患者化療期間的生存質量。趙鐵華[42]等指出黃芪等中草藥具有較強的免疫調節作用。黃芪免疫調節作用機制尚不完全清楚。一般認為黃芪的作用多系整23（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細胞分泌，局部注射TNF-α會誘導小鼠腫瘤壞死，因此被命名為腫瘤壞死因子（TNF）。TNF-α為一種重要的炎癥介質，由巨噬細胞、淋巴細胞、肺泡上皮細胞等釋放，能激活中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等促進炎癥顆粒釋放，而且還能與香煙煙霧、LPS等協同活化炎癥細胞的核因子-κB(NF-κB)系統，促使炎性細胞因子的mRNA轉錄，從而合成炎性細胞因子如IL-1β、IL-8、TNF-α等，而這些炎癥因子又可以反過來活化炎癥細胞，促進炎癥細胞的合成及釋放炎性介質。這就構成了炎癥細胞-細胞因子之間的逐步放大環，促使炎癥慢性化。TNF-α最初是在移植腫瘤的小鼠血清中被發現的[43]。腫瘤壞死因子（TNF）是體內具有多種生物活性的細胞因子，根據其來源不同可分為兩種，TNF-α和TNF-β。（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細胞24TNF-α水平升高可以促進腫瘤血管新生、促進腫瘤細胞生長，還激活金屬基質蛋白酶等某些降解酶的活性，有利于腫瘤細胞的浸潤和轉移[55-56]。有研究表明TNF-α表達的強弱與腫瘤細胞的分化程度，臨床分期有關[57-58]，但其機制尚不清楚。Selfart等[59]研究了117名肺癌患者（包括77名非小細胞肺癌患者和40名小細胞肺癌患者）和131名健康人TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態性，發現非小細胞肺癌組TNF－α－238和TNF－β－Intron1－252的基因多態性與對照組相比有顯著性差異，而小細胞肺癌組與對照組相比則無明顯差異。TNF-α水平升高可以促進腫瘤血管新生、促進腫瘤細胞生長，還25（3）基質金屬蛋白酶基質金屬蛋白酶(martixmetalloproteinase，MMp)是一組具有相同功能、結構高度同源、依賴鋅離子的內肽酶的總稱，其主要作用是降解細胞外基質(ECM)和基底膜。在正常肺組織中ECM能維持肺泡結構，其合成與降解保持動態平衡以保證正常肺功能。平衡破壞時，將會產生以肺結構改變為特征的肺泡疾病，如肺癌、肺纖維化(IPF)等。基質金屬蛋白酶具有降解細胞外基質的功能，因此是腫瘤細胞向周圍生長乃至向遠處轉移的重要工具[60-61]，幾乎所有類型的人類腫瘤包括肺癌和食管癌中都有MMp尤其是MMP-l、MMP-2、MMP-3和MMP-9的高表達[62-66]。大多數MMP由腫瘤細胞產生和分泌，但腫瘤細胞周圍的間質細胞也能產生MMP。研究表明，MMP高表達與腫瘤進展，癌細胞侵襲和轉移程度，病人的生存期等臨床轉歸密切相關，是腫瘤病人預后的重要指標之一[67-69]。（3）基質金屬蛋白酶基質金屬蛋白酶(martixmetall26MMPs是一大組金屬離子依賴的蛋白酶，它能降解ECM中的各種蛋白成分。在肺癌的研究中，大多數結果顯示MMPS的過度表達與肺癌的發生和發展有關，尤其是MMp-2和MMP-9與肺癌關系密切[70]。MMPs在腫瘤生長和轉移過程的機制：①降解ECM：由膠原、糖蛋白、蛋白多糖等構成的EcM是細胞生存的重要內環境，其中含有大量的細胞因子、砧附分子、蛋白酶等。MMP是降解ECM最重要的酶類，大量的研究證明MMP活性上調與許多實體瘤的侵襲轉移有關[71-72]。②促進新生血管形成：MMP在以下幾方面促進血管形成：l)增強內皮細胞移動的能力；2)作為促進血管形成的因子直接參與新生血管的形成；3)MMP通過提高促血管生成因子如VEGF、bFGF、TGF2a的作用，間接參與血管的形成；4)MMP降解ECM的作用，使細胞間質的空隙增大，為腫瘤血管的形成提供有利的空間。③調節細胞間的勃附：MMP以及勃附分子的相互作用，改變了腫瘤細胞之間及宿主細胞之間的載附性，從而促進腫瘤細胞的侵襲與轉移MMPs是一大組金屬離子依賴的蛋白酶，它能降解ECM中的各種27綜上所述，國內外雖然對黃芪和肺癌做了大量研究，積累了一定的經驗，也指導了臨床的治療用藥。但迄今尚未見文獻報道黃芪單味藥直接給肺癌的動物模型灌胃研究。所以在小鼠肺癌模型的基礎上用黃芪和紫杉醇對其干預，并進行比較，可為中醫藥治療提供肺癌提供理論依據，以提高臨床診治水平，并為研制預防和治療肺癌的中成藥搭建一個研究平臺，以便探索中藥的作用機制或作用靶點。綜上所述，國內外雖然對黃芪和肺癌做了大量研究，積累了一定的經28謝謝!謝謝!29黃芪對肺癌小鼠模型的干預機制研究

導師:孫廣仁教授學生：黃芪對肺癌小鼠模型的干預機制研究導師:孫廣仁教授30選題依據選題目的：通過建立小鼠肺癌模型，探討黃芪對肺癌的抑制和轉移的作用機制，以期在臨床上能有效的運用黃芪對肺癌治療提供實驗依據。建立肺癌小鼠肺模型，觀察黃芪對小鼠生存時間，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對小鼠腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制，為臨床防治提供實驗依據。選題依據選題目的：31選題意義根據中國衛生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國腫瘤發病率和十大惡性腫瘤發病率排序顯示，肺癌居男性惡性腫瘤發病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌[2]。2000年世界衛生組織的統計資料表明，每年全球的肺癌新發病例位1.2百萬，占全部惡性腫瘤的12.3％，死亡1.1百萬，占腫瘤全部死因的17.8％。更為嚴重的是，凡是煙草消費大國，其肺癌新發病率乃在不斷增長，成為越來越嚴重的危害人民生命和健康的常見疾病[3]。原發性肺癌是發達國家的主要腫瘤，以美國為例，1997年全美國肺癌的發生數男性為98300例，女性為79800例，分別是男女腫瘤發病率第二位。1997年因肺癌死亡的人數為160400人，居惡性腫瘤死亡率第1位，占全美國腫瘤死亡病人的29％[4]。選題意義根據中國衛生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國腫瘤32中醫藥在治療肺癌上有其自己的優勢，近幾年來應用辨證論治、專方、專藥及新藥新劑型等方法治療肺癌均有一定的進展，在穩定病灶、改善癥狀、提高生存質量、延長生存期等方面都具有一定的療效和優勢。因此研究中醫藥在肺癌治療中的作用有其很高的應用價值，能更好的服務于臨床中肺癌的治療。肺癌屬“肺積”、“息責”等范疇，屬于祖國醫學“咳嗽”、“咯血”、“肺積”，這與肺癌的臨床表現有相似之處。中醫學認為，肺癌是由于人體正氣不足，尤其是肺脾腎虛損，再加上六淫和七情等因素長期作用，導致肺氣不足，肺陰虧虛，升降失調，氣血瘀滯，內結于肺，形成積塊而發生的[6]。中醫藥在治療肺癌上有其自己的優勢，近幾年來應用辨證論治、專方33本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎上用黃芪對該病進行治療，通過觀察小鼠的一般情況，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對荷瘤小鼠腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制。預期成果不僅可為防治該病證提供新思路和理論依據，指導臨床對肺癌的預防、治療和康復，同時為的深層次機制和研究中藥微觀作用機制的研究進行資料積累，提供新思路和理論支撐。本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎上用黃芪對該病進行34課題設計研究內容與研究方法：以小鼠轉移肺癌模型為研究對象，采用中西藥對比進行治療，動態觀察小鼠的體重改變、抑瘤率的比較、肺組織內基質金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細胞因子的變化，從細胞分子水平闡釋這些變化，及黃芪和紫杉醇對肺癌的作用的相關性，觀察探討黃芪對肺癌的干預作用的動態變化及時效性，為防治肺癌提供新思路和理論依據。課題設計研究內容與研究方法：35技術路線動物實驗1.肺癌的臨床診斷：肺癌的臨床診斷必須依據臨床表現和各種影像結果進行綜合分析，但最后的確診必須取得細胞學或病理組織學的證據。任何沒有病理學或病理組織學證據的診斷，都不能為最后的診斷結果。依據這樣的原則，肺癌的診斷可分為肺癌的定位診斷和肺癌的定性診斷兩種，所有的影像學診斷法方可認為是定位診斷，而所有以獲取細胞學或病理組織學為目的的診斷科認為是定性診斷。定位診斷是基礎，定性診斷是關鍵。技術路線動物實驗362.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級動物實驗室中，無菌操作，取肺癌瘤小鼠腹水，稀釋至含瘤細胞2×1010/L，置冰上，每小鼠右腋皮下接種0.2ml，分別給模型組、中藥組和西藥組接種。接種次日24h后進行藥物抑藥瘤試驗；實驗設空白組和模型對照組，中藥組和西藥組。模型對照組中，每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，中藥組中每只小鼠腹灌胃0.4ml，100mg/ml。西藥對照組中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml，20mg/ml。每只小鼠每天用藥1次，連續用藥15天，停藥次日處死小鼠，剝離腫瘤，稱體重及瘤重，計算抑瘤率。2.肺癌模型建立的方法（1）肺癌小鼠造模：在本院三級動物37（2）藥物干預階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥物干預，以生理鹽水灌胃。中藥治療組小鼠黃芪煎湯灌胃。藥物制備：黃芪25g加8倍水，浸泡半小時，頭次煎煮半小時，濾出藥渣后加水至藥面以上3ml，再煎20分鐘。將兩次藥液混合、過濾，加壓濃縮至100%（即每毫升含生藥1.0g）的水提劑。用藥方法：將藥物按成人日服量換算，計算出小鼠日服量，每日對治療組小鼠灌服中藥煎劑0.4ml/100g體重，對空白組及肺癌模型組小鼠灌服生理鹽水0.4ml/100g體重。連續用藥15天，第16天處理所有小鼠。后脫頸處死小鼠,完整剖取接種的瘤塊,電子天平稱重，按公式:抑瘤率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100%。小鼠處死后，將整個肺取下。在雙盲條件下,計數肺轉移瘤灶的數目，按公式:肺轉移抑制率=(空白組平均肺轉移瘤灶數目-給藥組平均肺轉移瘤灶數目)/空白組平均肺轉移瘤灶數目×100%。（2）藥物干預階段造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥383.檢測指標（1）整體觀測：在實驗過程中觀察小鼠癥狀、體重、生存時間、呼吸、被毛情況、食量、飲水量，胸腔，縱膈，胸水。（2）瘤體重測定：小鼠處死后，去腫瘤組織，精密電子天平稱重。（3）血生化指標檢測：小鼠腹主動脈取血，以ELISA法測定、TNF-α的含量，放免法測定血漿中MMP-9的含量（4）瘤組織處理：腫瘤組織用福爾馬林液充分固定，常規脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規切片，HE染色，光鏡下觀察期組織學變化。肺組織用福爾馬林固定12h,進行HE染色,在光學顯微鏡下觀察讀片,以進一步確認轉移灶的病理性質及特征。3.檢測指標（1）整體觀測：在實驗過程中觀察小鼠癥狀、體重394.統計學處理計量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗，計數資料用χ2檢驗，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異，均用SAS軟件進行統計學處理。4.統計學處理計量資料以±S表示，多組間比較用單因素方差分40技術路線圖SPF級昆明級小鼠55只隨機分組空白組10只模型組15只中藥組15只實驗全過程觀察小鼠的體重、一般情況、生存時間、胸腔、縱隔、胸水腫瘤接種血生化指標檢測：TNF-α、MMP-9的蛋白表達肺組織切片：肺病理觀察瘤體重的測定14天后停止用藥西藥組15只24h后開始用藥，模型組用生理鹽水，中藥組用黃芪，西藥組用紫杉醇技術路線圖SPF級昆明級小鼠55只隨機分組空白組10只模型組41可行性分析1．根據《內經》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而化生萬物矣”，“五氣入鼻，藏于心肺”，“肺者，氣之本。”，“諸氣者，皆屬于肺。”等論述，腫瘤的病因不外乎內因和外因兩個方面。“正氣存內，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。所以肺癌的發生也不外乎是氣虛所致。以此采用以補氣為主的黃芪治療。肺癌的發生與人體的免疫力下降有很大的關系，而現代的藥理研究顯示黃芪具有提高人體免疫力的作用，故采用黃芪干預肺癌的形成機制是可行的。所以理論上通過腫瘤種植建立轉移性肺癌的造模方法，建立肺癌的模型是可行的。可行性分析1．根據《內經》中“在天為氣，在地成形，形氣相感而422．實驗方法：本課題針對中醫對腫瘤的病因病機和臨床表現的認識，借鑒現代醫學實驗方法，在建立肺癌小鼠模型的基礎上，并對模型進行了病理檢查、炎癥因子等方面的檢測以及方藥驗證。研究的思路和方法注重中醫藥理論的指導，對實驗結果的分析和相應對策也是從中醫學中氣的本源出發，立足于病藥相應的原則。3．實施保障：我們依托于山東中醫藥大學細胞生物學實驗室，屬國家中醫藥管理局三級重點實驗室，為開放實驗室，具備完成該項研究的實驗條件和所用儀器設備基本能夠滿足，實驗室操作人員經驗豐富，具體實驗操作熟練，預計可以實現本項目的預期目標。實驗中所涉及到的材料和試劑均為商品，在國內能夠買到。2．實驗方法：本課題針對中醫對腫瘤的病因病機和臨床表現的認識43本課題特色、預期取得的結果創新點：1．采用中醫學和現代醫學相比較的治療的方法，在肺癌病因和臨床表現的基礎上，用直接種植腫瘤的辦法建立轉移性肺癌的小鼠模型。2．在肺癌小鼠模型建立的基礎上用單味中藥黃芪和紫杉醇相比較對該病證進行對照治療，分析小鼠肺改變，明確肺組織內基質金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-α等細胞因子的變化規律，從微觀角度闡釋該病證在治療過程中的動態變化，并初步明確藥物的作用機制或作用靶點。3．該課題觀察肺癌小鼠模型在黃芪的干預下的變化，以評價模型的穩定性和確定中藥干預的最佳時機，具有創新性。本課題特色、預期取得的結果創新點：44國內外研究動態1．小鼠肺癌模型研究概況目前常用的小鼠肺癌動物模型有：（1）將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。（2）將小鼠的氣管分離，經過反復凍融處理，然后將肺癌細胞接種到氣管，結扎氣管兩端后[12]，再將氣管移植到重度復合免疫缺陷小鼠的皮下。（3）切開胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺內[13-14]。此方法有一定的創傷性和死亡率，肺癌細胞生長在肺實質內，但只能使70%-90%的接種小鼠產生腫瘤，對進行進一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細胞直接注入重度復合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細支氣管內的肺癌模型[15]。國內外研究動態1．小鼠肺癌模型研究概況45有學者采用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨床特征，但是其技術要求較高，成功率較低[8-9]。也有人采用外科手術移植方法，同樣也是成功率低于10%[10]。彭鵬[11]采用清潔級小鼠C57BL/6小鼠的腋后線第6肋間胸腔(胸腔模型組)或小鼠腋部皮下（皮下模型組）分別移植鼠源性Lewis肺癌細胞0.2ml可作為晚期肺癌動物模型。。有學者采用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可46現在常用的轉移性肺癌動物模型有：①將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。②將小鼠的氣管分離,經過反復凍融處理,然后將肺癌細胞接種到氣管，結扎氣管兩端后，再將氣管移植到重度復合免疫缺陷小鼠的皮下[21]。③胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺臟內[22，23]。也有經靜脈注射或心室內注射等，建立肺癌轉移模型。現在常用的轉移性肺癌動物模型有：①將肺癌細胞接種于裸鼠或其他472．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據病人的身體情況及肺癌的類型和分期采取不同的治療方案。一般而言，非小細胞肺癌采取手術為主的綜合治療，小細胞肺癌則采用以化療放療為主的綜合治療[3]。在化療方面，臨床上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種化療方案。小細胞癌被列入有可能用化療治愈的疾病，目前的標準化療方案是CAV(環磷酰胺CTX，阿霉素ADR，長春新堿VCR)和EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）非小細胞肺癌對化療不敏感，常用的化療方案有EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）NP（去長春花堿NVB,順鉑DDP）GP(吉西他濱GEM，順鉑和卡鉑Carboplatin）TP(紫杉醇TAX，順鉑和卡鉑Carboplatin）DP（多西紫杉醇DOP，順鉑和卡鉑Carboplatin）。并且21世紀惡性腫瘤一個重要的治療方向是分子靶向治療，目前應用于肺癌的分子靶向藥物有表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼和埃羅替尼。這類藥物有一個非常顯著的特點是靶人群，如吉非替尼對女性不吸煙的肺腺癌有特別的效果[3]。2．肺癌的治療研究概況肺癌的治療需依據病人的身體情況及肺癌的48從中醫理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發生腫瘤。周延峰用消瘤方治療非小細胞肺癌顯示消瘤方能提高機體免疫功能，降低患者血液粘度，抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，下調突變性P53基因[27]。陳璐[7]指出補腎化癖解毒方藥對小鼠移植性肺癌及小鼠肺轉移均有明顯的抑制作用并且補腎化癖解毒方藥能提高西藥順鉑(DDP)對兩者的抑制率。黃健飛[28]指出極低濃度的丹參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤有明顯抑制作用，其余濃度的丹參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤無明顯抑制作用，不同濃度的丹參注射液無明顯抑制荷瘤小鼠肺部轉移的作用，但低濃度和中濃度的丹參注射液能降低轉移相關因子MMP-9的表達。李保國[29]指出復方紫杉醇注射液對移植于C57BL/6小鼠的Lewis肺癌具有明顯的抑制作用，其機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。裘維焰[30]等指出四君子湯與IFN-γ，合用時免疚調節作用有著明顯影響，并可提高抑瘤率。王立強[31]等指出蘆薈苦素是蘆薈抗腫瘤、抗白血病的有效成分之一。其抗腫瘤機制可能為促進分裂中期微管聚集，干擾腫瘤細胞的有絲分裂過程和提高機體免疫力。從中醫理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發生腫瘤。周延峰用493．黃芪、腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶的變化癌的發生是一個多因素多階段復雜的過程，不僅有外因，還有遺傳因素，免疫狀態等宿主因素。據最新統計，中國死于惡性腫瘤的前五位癌癥主要依次為：胃癌，肝癌，食管癌，肺癌，大腸癌[32]。目前每年全世界至少有700萬人死于癌癥，我國約130萬。因此21世紀攻克癌癥這一世界難題，具有十分重要的意義。3．黃芪、腫瘤壞死因子及基質金屬蛋白酶的變化癌的發生是一個多50（1）黃芪現代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調節包括對抗免疫抑制劑、增強體液免疫和細胞免疫功能、調整補體系統、提高紅細胞的免疫功能等方面作用。研究證實，黃芪能增加脾臟的重量、細胞數及抗體反應，對抗由強的松造成的免疫抑制及由環磷酞胺造成的脾臟重量下降，并能提高“虛證”小鼠血漿cAMP含量，加速淋巴細胞轉化，增強T細胞功能，顯著提高E一玫瑰花結形成率，還有誘生和促誘生干擾素、增強NK細胞及巨噬細胞活性的功能。黃芪的有效成分黃芪多糖能提高抗體形成細胞數，抑制Ts細胞，其對正常人及腫瘤患者外周血單個核細胞在體外分泌腫瘤壞死因子具有明顯的促進作用[32]。（1）黃芪現代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調節包括對抗免疫抑51黃芪免疫調節作用機制尚不完全清楚。一般認為黃芪的作用多系整體調節的結果，即所謂“虛者補之，損者益之”。黃芪在生長過程中從土壤中選擇性吸收硒，因而黃芪富含硒。硒對各種金屬如福、汞、甲基汞等一些化學致癌物質有拮抗作用；硒是谷膚甘膚過氧化酶的一個組成部分，此酶可以保護細胞免受生物氧化過程的損害;硒還能抑制癌細胞的氧化磷酸化作用。最近一項對過敏性哮喘豚鼠的研究顯示黃芪能顯著抑制過敏性哮喘豚鼠氣道壁細胞NF-kB的表達，此可為黃芪的作用機制之一[37]。此外黃芪總貳可使小鼠肝癌(HepA)和肉瘤(5180)細胞阻止于GO/G1期，并可誘導其凋亡[38]；使活化T淋巴細胞內游離鈣增加并增強鈣離子內流的驅動力[39]通過提高細胞表面粘附分子的表達而促進淋巴細胞與內皮細胞的粘附，從而促進淋巴細胞再循環[40]。柏長青等[41]指出黃芪提取物注射液能夠明顯降低肺癌患者化療期間常見毒副反應的發生率和嚴重程度，改善患者化療期間的生存質量。趙鐵華[42]等指出黃芪等中草藥具有較強的免疫調節作用。黃芪免疫調節作用機制尚不完全清楚。一般認為黃芪的作用多系整52（2）腫瘤壞死因子（TNF-α）TNF-α是由受激的巨噬細胞分泌，局部注射TNF-α會誘導小鼠腫瘤壞死，因此被命名為腫瘤壞死因子（TNF）。TNF-α為一種重要的炎癥介質，由巨噬細胞、淋巴細胞、肺泡上皮細胞等釋放，能激活中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等促進炎癥顆粒釋放，而且還能與香煙煙霧、LPS等協同活化炎癥細胞的