發酵工程制藥張忠山發酵工程制藥張忠山1為什么要利用微生物抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微生物發酵來生產？這與微生物的生長和代謝特點有什么關系？為什么要利用微生物抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微21、某些微生物因爭奪生存環境或營養物，會產生抗生素將其他種類的微生物殺死。2、微生物會產生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養物質水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖。3、微生物細胞會通過合成或分解代謝生產它必需的一些物質，包括氨基酸、核苷酸等。1、某些微生物因爭奪生存環境或營養物，會產生抗生素將其他種類3微生物的優點微生物繁殖非常迅速微生物培養易于控制微生物本身也容易改造微生物的優點微生物繁殖非常迅速4微生物發酵發酵：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經過特定的代謝途徑轉化為人類所需要的產物的過程。發酵工程：采用現代化工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產有用的產品，或直接把微生物應用于工業生產過程的一種新技術。微生物發酵發酵：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經過特定的5微生物的應用酒類：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用釀酒酵母，在厭氧條件下進行發酵，將葡萄糖轉化為酒精生產的。白酒經過蒸餾，因此酒的主要成分是水和酒精，以及一些加熱后易揮發物質，如各種酯類、其他醇類和少量低碳醛酮類化合物。果酒和啤酒是非蒸餾酒，發酵時酵母將果汁中或發酵液中的葡萄糖，轉化為酒精，而其他營養成分會部分被酵母利用，產生一些代謝產物，如氨基酸、維生素等，也會進入發酵的酒液中。因此，果酒和啤酒營養價值較高。

微生物的應用酒類：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用釀酒酵6微生物的應用醋：食品店或超市出售的醋中，除了白醋是由化學合成的食品級醋酸勾兌的外，其他的則是由醋酸菌在好氧條件下發酵，將固體發酵產生的酒精轉化為醋酸生產的。由于使用的微生物菌種或曲種的差異，在葡萄糖發酵過程中會產生乳酸或其他有機酸，因而使醋有不同的風味。

微生物的應用醋：食品店或超市出售的醋中，除了白醋是由化學合成7微生物的應用醬油：醬油生產以大豆為主要原料，其他有麥麩、小麥、玉米等，將上述原料經粉碎制成固體培養基，在好氧條件下，利用產生蛋白酶的霉菌，如黑曲霉進行發酵。微生物在生長過程中會產生大量的蛋白酶，將培養基中的蛋白質水解成小分子的肽和氨基酸，然后淋洗、調制成醬油產品。醬油富含氨基酸和肽，具有特殊香味。

微生物的應用醬油：醬油生產以大豆為主要原料，其他有麥麩、小麥8微生物的應用醬：以大豆和少量面粉為原料，蒸煮后在空氣中自然發酵。發酵過程主要是能夠產生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的霉菌，將大豆中的蛋白質、脂肪、淀粉分解，產生出氨基酸、多肽、甘油、脂肪酸等多種物質。這些物質使醬具有獨特的醬香味。微生物的應用醬：以大豆和少量面粉為原料，蒸煮后在空氣中自然發9微生物的應用酸奶：牛奶在厭氧條件下，由乳酸菌發酵，將乳糖分解，并進一步發酵產生乳酸和其他有機酸，以及一些芳香物質和維生素等；同時蛋白質也部分水解。因此，酸奶是營養豐富、易消化，少含乳糖，是適合于有乳糖不適應癥者的優良食品。

微生物的應用酸奶：牛奶在厭氧條件下，由乳酸菌發酵，將乳糖分解10微生物的應用醪糟：又稱酒釀，是大米經蒸煮后，接種根霉，在好氧條件下，發酵生產的含低濃度酒精和不同糖分的食品。根霉在生長時會產生大量的淀粉酶，將大米中的淀粉水解成葡萄糖，同時利用部分葡萄糖發酵產生酒精。由于使用的根霉菌種不同，可以生產不同酒精度、不同甜度和不同香味的醪糟。

微生物的應用醪糟：又稱酒釀，是大米經蒸煮后，接種根霉，在好氧11微生物的應用面包：現在的面包均是利用活性干酵母（面包酵母）經活化后，與面粉混合發酵，再加入各種添加劑，經烤制生產的。面粉發酵后淀粉結構發生改變，變得易于消化、營養易于吸收。微生物的應用面包：現在的面包均是利用活性干酵母（面包酵母）經12微生物的應用饅頭：以前做饅頭的面粉是經自然發酵后蒸制的，如果連續使用面肥發酵，經幾代發酵，微生物會因生長優勢而單一化。發酵的菌種一般多為乳酸菌。因為發酵產酸，在蒸制前要用堿中和酸，制得的饅頭才松軟適口、帶有特殊香味。現在，大批量生產是采用干酵母發酵，所以不產酸，不需要再用堿中和即可蒸制。微生物的應用饅頭：以前做饅頭的面粉是經自然發酵后蒸制的，如果13微生物的應用制藥業：抗生素、氨基酸、維生素的生產；食品業：醋、醬油、醬、酒等的生產；輕工業：檸檬酸、乳酸、味精、肌苷酸、干酵母、色素、黃原膠、甘油等的生產；化工業：酒精、丙酮、丁醇、衣康酸、丙烯酰胺和聚丙烯酰胺等的生產；飼料業：飼料添加劑的生產；農藥業：農用抗生素、微生物肥料、微生物農藥等的生產。微生物的應用制藥業：抗生素、氨基酸、維生素的生產；14

發酵工程是一門具有悠久歷史，又融合了現代科學的技術，是現代生物技術的組成部分。本章主要介紹發酵工程的基本內容和基本原理，重點介紹了工業發酵的工藝流程,還介紹了典型產品的發酵生產工藝，如青霉素，谷氨酸和維生素C的生產。發酵工程是一門具有悠久歷史，又融合了現代科學的技術15

微生物發酵制藥是利用微生物進行藥物研究、生產和制劑的綜合性應用技術科學。研究內容包括微生物制藥用菌的選育，發酵以及產品的分離和純化工藝等。主要討論用于各類藥物發酵的微生物來源和改造、微生物藥物的生物合成和調控機制、發酵工藝與主要參數的確定、藥物發酵過程的優化控制、質量控制等。微生物發酵制藥是利用微生物進行藥物研究、生產和制劑的16第一節微生物發酵概論1857年巴斯德提出著名發酵理論：“一切發酵過程都是微生物作用的結果。”1929年Flemming爵士發現了青霉素，增加一大類新產品-抗生素。一、微生物發酵的概念及發展史第一節微生物發酵概論1857年巴斯德提出著名發酵理論：“1720世紀40年代，以獲取細菌的次生代謝產物-抗生素為主要特征的抗生素工業成為微生物發酵工業技術的支柱產業。20世紀50年代，氨基酸發酵工業又成為微生物技術產業的又一個成員，實現了對微生物的代謝進行人工調節，這又使微生物技術進了一步。20世紀40年代，以獲取細菌的次生代謝產物-抗生素為主要特征1820世紀60年代，微生物技術產業又增加了酶制劑工業這一成員。20世紀70年代，為了解決由于人迅速增長而帶來的糧食短缺問題，進行了非碳水化合物代替碳水化合物的發酵，如利用石油化工原料進行發酵生產，培養單細胞蛋白，進行污水處理，能源開發等。20世紀60年代，微生物技術產業又增加了酶制劑工業這一成員。1980年代以來，隨著重組DNA技術的發展，可以按人類社會的需要，定向培養出有用的菌株，這為微生物發酵技術引入了遺傳工程的技術，使微生物技術進入了一個新的階段。目前，人們把利用微生物在有氧或無氧狀態下生命活動來制備微生物菌體或其它代謝產物的過程統稱為發酵。80年代以來，隨著重組DNA技術的發展，可以按人類社會的需要20

1.微生物菌體發酵

是以獲得具有某種用途的菌體為目的的發酵。用于面包制作的酵母發酵及用于人類或動物食品的微生物菌體蛋白發酵是比較傳統的菌體發酵工業。新的菌體發酵可用來生產藥用真菌，如香菇菌、依賴蟲蛹而生存的冬蟲夏草菌、與天麻共存的密環菌等藥用菌。二、微生物發酵的類型1.微生物菌體發酵二、微生物發酵的類型212.微生物酶發酵

酶普遍存在于動物、植物和微生物中。因為微生物種類多、產酶的品種多、生產容易和成本低等特點，所以目前工業應用的酶大多來自微生物發酵。如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治療血栓的納豆激酶和鏈激酶等。2.微生物酶發酵22

3.微生物代謝產物發酵

微生物代謝產物很多。在菌體對數生長期所產生的產物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質和糖類等是菌體生長繁殖所必需的，這些產物叫做初級代謝產物。在菌體生長靜止期，某些菌體能合成一些具有特定功能的產物，如抗生素、生物堿、植物生長因子等。這些產物與菌體生長繁殖無明顯關系，叫做次級代謝產物。

3.微生物代謝產物發酵23

4.微生物的轉化發酵

微生物的轉化是利用微生物細胞的一種或多種酶，把一種化合物轉變成結構相關的更有經濟價值的產物。可進行的轉化反應包括：脫氫反應、氧化反應、脫水反應、縮合反應、氨化反應、脫氨反應等。

4.微生物的轉化發酵245.生物工程細胞的發酵是指利用生物工程技術所獲得的細胞，如DNA重組的“工程菌”，細胞融合所得的“雜交”細胞等進行培養的新型發酵。此類發酵的產物多種多樣，如用基因工程菌生產胰島素、干擾素等。5.生物工程細胞的發酵25優良的微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，微生物資源非常豐富，廣泛分布于土壤、水和空氣中，尤以土壤中為最多。1.從微生物分類學的角度把所需菌種分為：細菌類如短桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、漢遜酵母和假絲酵母等；霉菌如黃曲霉、紅曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放線菌如各種抗生素，鏈、慶大等。三、微生物發酵工業所用菌種優良的微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，微生物資源非26

2.作為工業微生物發酵使用的菌種，通常有以下特點：(1)具有穩定的遺傳學特性。(2)微生物生長和產物的合成對于基質沒有嚴格的要求。(3)生長條件易于滿足。(4)具有較高的各種酶活力。（5）對于包含體，要求在細胞破碎是不易破碎，而在目的產物的分離提出時，則易破碎。2.作為工業微生物發酵使用的菌種，通常有以下特點：(1271.微生物發酵過程是一個典型的化工過程。2.微生物發酵過程是一個典型的代謝控制發酵。3.微生物發酵工業又是一個有別于化工過程的一個工業。四、微生物發酵的基本特征1.微生物發酵過程是一個典型的化工過程。四、微生物發酵的基本28啤酒制造工藝流程啤酒制造工藝流程29

啤酒制造工藝流程啤酒制造工藝流程30

微生物發酵主要有以下幾個特征：（1）反應條件溫和。通常由于微生物的生理特性，要求溫度為30℃～40℃、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放線菌的發酵和pH值中性偏堿性如細菌的發酵。（2）無菌發酵，整個反應過程要求無菌。培養基無菌、空氣無菌、補料和取樣要求無菌操作、某些工程菌，其尾氣也要求進行無菌處理。微生物發酵主要有以下幾個特征：31（3）非連續性生產。微生物的生理特性決定了發酵過程的非連續性，大部分的工業發酵是以間歇操作為基礎進行的，目前可以實現連續化生產的是啤酒的連續化生產。（3）非連續性生產。微生物的生理特性決定了發酵過程的非連續32第二節工業發酵的工藝流程

生物發酵工藝多種多樣，但基本上包括菌種的選育、菌種培養基的配制、擴大培養和接種、發酵過程下游處理即分離提純等幾個過程。第二節工業發酵的工藝流程生物發酵工藝多種多樣33找到合適的菌種是發酵工程的前提。人們最初是從自然界尋找所需要的菌種，如谷氨酸發酵時常用菌有谷氨酸棒狀桿菌等。但這種方法得到的菌種，產量一般都比較低。20世紀40年代，微生物學家開始用紫外線、激光、化學誘變劑等處理菌種，使菌種產生突變，以篩選出符合要求的優良菌種。隨著細胞工程、基因工程等技術的日益成熟，科學家開始構建工程細胞或工程菌，用它們進行發酵，甚至能生產出一般微生物所不能生產的產品。一、菌種的選育找到合適的菌種是發酵工程的前提。人們最初是從自然界尋一、菌34菌種選育的必要性和重要性

必要性：1、經誘變劑處理的細胞中只有一部分是突變型菌株，而有害突變往往占有很大比例；2、從自然界篩選得來的菌株，藥物代謝合成能力均很低，野生型菌株由于長時間生長在非最適條件下，產物濃度很低，對于工業生產來說，如果不進行菌種改良，勢必造成生產成本過高。菌種選育的必要性和重要性必要性：35重要性：1、菌種選育是提高單位產量和改進產品質量的重要措施；2、能夠改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業生產，例如抗噬菌體的菌株能利用廉價發酵原料或需氧量較小的菌株等。重要性：36選育方法1、自然選育：是指微生物細胞群體不經過人工處理而利用菌種的自發突變（spontaneousmutation）進行菌種篩選的育種方法。效率低、進展緩慢。選育方法1、自然選育：是指微生物細胞群體不經過人工處理而利用372、誘變育種：是用不同的誘變劑（mutagen）處理微生物的細胞群體，以誘發各種遺傳突變，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中選出所需要的突變株（mutant）。發酵工業中使用的高產菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產性能的菌株，故至今仍是菌種改良的主要方法。2、誘變育種：是用不同的誘變劑（mutagen）處理微生物的38（一）方法和原理A.誘變機制（1）微小損傷突變：堿基置換，碼組移動（2）染色體畸變：易位，逆位，缺失，重復（3）染色體組突變：數目變化（單倍體變多倍體）B.誘變劑及其作用方式：物理誘變劑，化學誘變劑，生物誘變劑常用誘變劑p-263（一）方法和原理39（二）誘變和篩選初步篩選是關鍵步驟A.自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素，提高產量B.結構類似物或前體類似物的耐受突變株：解除反饋抑制（二）誘變和篩選40C.營養缺陷型及其回復突變株通過誘變導致某些基因的突變，而需要添加一些物質（氨基酸、核苷酸等）才能生長的突變體。營養缺陷型的作用：（1）解除末端產物的反饋調節作用。（2）作為標記，在雜交育種中作為出發菌株有利于雜交重組的分析。（3）作為基因工程的受體菌，檢出克隆基因的表達。C.營養缺陷型及其回復突變株413、雜交育種：是將兩個基因型不同的親株的某些遺傳信息，通過雜交重組于同一重組體中，形成新的遺傳型個體的過程。傳統的雜交育種在真核微生物中可以通過有性雜交及準性雜交兩種途徑；在原核微生物中（如細菌和放線菌）則可通過接合雜交進行。3、雜交育種：是將兩個基因型不同的親株的某些遺傳信息，通過雜42a.準性生殖（parasexualreproduction）：是指真菌中不通過有性生殖的基因重組過程。b.接合（conjugation）：在細菌和放線菌中，接合是最常見的雜交方式。二親株的細胞在固體培養基上混合培養時，一親株細胞的基因組片段進入另一親株的細胞，發生部分染色體的轉移或遺傳信息的交換，形成部分合子，經過二次交換形成單倍重組體。a.準性生殖（parasexualreproductio43c.原生質體融合（protoplastfusion）：兩親本菌株的原生質體在高滲條件下混合，以聚乙二醇作為助融劑，或在一定電場條件下，通過電脈沖作用促進原生質體互相聚集，誘導融合，接著兩親本遺傳物質交換，從而實現遺傳重組。在適宜的條件下，融合細胞可再生成新的完整細胞，就有可能獲得具有合乎理想的新遺傳性狀的重組子。c.原生質體融合（protoplastfusion）：兩44二、發酵的基本過程基本過程為：菌種種子制備發酵發酵液預處理提取精制二、發酵的基本過程基本過程為：45生物制藥-發酵工程制藥課件46菌種發酵工程中所用的菌種多要求是純培養的，即整個發酵過程不能混有雜菌，否則將導致產量大大下降，甚至得不到產品。例如，如果青霉素生產過程中污染了雜菌，這些雜菌會分泌青霉素酶，將形成的青霉素分解掉。因此，培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌。菌種發酵工程中所用的菌種多要求是純培養的，即整個發酵過程不能47種子制備在搖瓶或小罐內進行。種子罐一般用鋼或不銹鋼制成，相當于小型發酵罐。接種前所有設備及培養基要經過嚴格滅菌。在大規模的發酵生產中，需要將選育出的優良菌種經過多次擴大培養，讓它們達到一定數量以后，再進行接種。種子制備在搖瓶或小罐內進行。48發酵接種量：5-20%通氣量：0.3-1m3/m3攪拌功率消耗：1-2kW/m3罐溫：26-37℃罐壓：0.3-0.5kg/cm2發酵周期：2～8d發酵接種量：5-20%49生物制藥-發酵工程制藥課件50生物制藥-發酵工程制藥課件51發酵結束后，要對發酵液或生物細胞進行分離和提取精制，將發酵產物制成合乎要求的產品。對發酵產品的要求不同，分離提純的方法也相應有些區別。利用發酵工程生產的產品有菌種代謝產物和菌種本身（如酵母菌和細菌）兩大類，如果產品是菌種，分離方法一般是通過過濾、沉淀從培養液中分離出；如果產品是代謝產物，則采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。分離提純后的產品，還要經過質量檢查合格后，才能成為正式產品。產物提取發酵結束后，要對發酵液或生物細胞進行分離和提取精制，將52發酵方式1、分批(間歇)發酵：物料一次投入反應器中，滅菌、接種、發酵。特點：一次性；發酵過程中，營養不斷減少，微生物不斷增殖，環境非穩態；微生物生長的四個時期明顯；應用廣泛，改善（在線檢測，計算機控制）。發酵方式1、分批(間歇)發酵：物料一次投入反應器中，滅菌、接532、補料分批發酵：補加新鮮培養基。特點：可以解除底物抑制、產物抑制或克服微生物過度生長；提高有用產物的轉化率；應用廣泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業；2、補料分批發酵：補加新鮮培養基。543、連續發酵：恒化器（基質恒）、恒濁器（菌體密度恒），連續進料出料平衡，保持恒定的發酵液密度。易實現自動化生產，如啤酒，乙醇的發酵。優點：操作穩定；利于機械、自動化；提高設備的利用率；減少滅菌次數；易于過程優化。缺點：易染菌；微生物易變異；對產品類型的適應性不廣；對設備及附件要求高。3、連續發酵：恒化器（基質恒）、恒濁器（菌體密度恒），連續進55第三節發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制二、溫度的影響及其控制三、溶氧的影響及其控制四、pH的影響及其控制第三節發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制56一、培養基的影響及其控制

1、碳源：糖類，脂肪，有機酸，碳氫化合物（速效碳源葡萄糖；遲效碳源淀粉，乳糖）（菌體干物質的50%以上是碳）。主要功能：①提供能源；②菌體成分；③產物碳架；來源：葡萄糖、糖蜜、淀粉及水解物是常用的碳源。一、培養基的影響及其控制572、氮源：無機氮源，有機氮源（速效氮源氨基酸，玉米漿；遲效氮源黃豆餅粉，花生餅粉、棉籽餅粉）。速效促生長，遲效利代謝。（占干物質量的10%）。主要功能：①構成細胞物質。②構成產物。來源：花生粉、黃豆餅粉、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽、尿素和氨水等是常使用的氮源。2、氮源：無機氮源，有機氮源（速效氮源氨基酸，玉米漿；遲583、無機鹽和微量元素

主要功能：①構成菌體成分（S）②激活酶（Mg2+）③輔酶或輔基的組成部分④參與能量轉移反應⑤調節滲透壓、pH、氧化還原電位來源：無機鹽、原料、灰分。4、特殊生長因子：不可缺、量微，自身不能合成或量不夠。主要功能：①構成輔酶②促進生命活動來源：玉米漿、糖蜜、甜菜糖、麩皮、米糠。3、無機鹽和微量元素595、水：物質溶解和生化反應的基礎。功能：①機體的重要組成成分；②參加一些代謝反應；③良好溶劑（介質）和熱導體；6、發酵培養基的配制提供必要的營養成分；配制合適的濃度；主成分與其他成分的配比；控制合適的pH5、水：物質溶解和生化反應的基礎。60二、溫度的影響及其控制

1.影響發酵溫度變化的因素（1）生物熱：生長，呼吸，繁殖（2）攪拌熱：摩擦（3）蒸發熱：（4）輻射熱：罐內外溫差二、溫度的影響及其控制612.溫度的選擇與控制（1）最適溫度：生長溫度，生產溫度變溫發酵，如青霉素發酵：30℃5h25℃35h20℃85h25℃40h放罐；青霉素產量比25℃恒溫發酵高14.7%。（2）溫度控制一般不需加熱，冷卻水（冷凍鹽水）通過夾層循環冷卻。2.溫度的選擇與控制62

三、溶氧的影響及其控制1.溶氧的影響：最適氧濃度溶氧對菌體生長和產物的性質及產量都影響谷氨酸發酵VB12發酵天冬酰胺酶發酵三、溶氧的影響及其控制632.發酵過程的溶氧變化紅霉素發酵：前期，中期，后期溶氧異常下降（污染好氣雜菌，菌體代謝異常），溶氧異常升高（污染噬菌體）3.溶氧濃度的控制供氧方面（提高氧傳遞）；需氧量（菌體濃度，基質種類，培養條件）2.發酵過程的溶氧變化64四、pH的影響及其控制1.

pH對發酵的影響最適生長pH（3～6）最適生產pH2.pH的變化3.發酵pH的確定和控制（1）發酵pH的確定：菌種，培養基組成，培養條件，溫度（2）pH的控制：補料，酸，堿，尿素，測定代謝曲線的pH變化，穩定工藝條件。常用的控制方法有：①調整生理堿性和酸性鹽類的比例；②選擇不同C、N的種類和比例；③添加緩沖劑。

四、pH的影響及其控制65第四節發酵產物的提取一、吸附法二、沉淀法三、溶劑萃取法四、離子交換法第四節發酵產物的提取一、吸附法66生物制藥-發酵工程制藥課件67培養液預處理的目的在于改變培養液的性質，使其便于過濾和提取。細胞破碎的方法有機械、生物和化學等各種方法。

精制生物制藥-發酵工程制藥課件68一、吸附法吸附劑（活性炭，白陶土，氧化鋁）在一定的pH條件下使發酵液中的抗生素被吸附，然后改變pH，以適當的洗脫劑（一般是有機溶劑）把抗生素從吸附劑上解吸下來，以達到濃縮和提純的目的。如絲裂霉素。還可以脫色和除熱原優點：操作簡單，成本低，缺點：吸附不穩定，選擇性不高，不能連續生產，影響衛生，新型吸附劑（大孔樹脂）一、吸附法吸附劑（活性炭，白陶土，氧化鋁）在一定的pH條件下69

二、沉淀法抗生素等電點沉淀或與酸、堿、離子形成復鹽沉淀析出，改變pH重新溶解。如土霉素、四環素、金霉素優點：設備簡單，節省溶劑，收率高缺點：過濾較困難二、沉淀70三、溶劑萃取法改變pH，改變溶劑，改變溶解度。青霉素，紅霉素，潔霉素，赤霉素，麥迪霉素，新生霉素，更新霉素，創新霉素。帶溶劑（溴代十五烷基吡啶PPB）形成復鹽。優點：產品純度高，濃縮倍數大，能連續生產，周期短缺點：溶劑耗量大，成本高，設備要求高（溶劑回收，防火防爆）三、溶劑萃取法改變pH，改變溶劑，改變溶解度。71

四、離子交換法帶負電荷的酸性抗生素用陰離子交換樹脂：萬古霉素，桿菌肽。帶正電荷的堿性抗生素用陽離子交換樹脂：鏈霉素，卡那霉素，巴龍霉素，慶大霉素。優點：設備簡單，節省溶劑，操作方便缺點：pH變化大，周期長四、離子交換法72理想的微生物細胞生物反應器的基本要求1.生物反應器的材料無毒，穩定性好，一般用不銹鋼制成2.生物反應器的結構：滿足傳質、傳熱、混合的功能3.密封良好，避免污染4.自動檢測、調節控制精度高5.攪拌器轉速和通氣應適當6.容器內表面光滑，無死角，利于清潔、滅菌7.拆裝、連接、清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒8.設備成本低第五節發酵設備理想的微生物細胞生物反應器的基本要求1.生物反應器的材料無毒73主要參數的檢測和控制方法⑴溫度，空氣過濾⑵pH，滅菌系統⑶溶氧⑷攪拌⑸進出液流量主要參數的檢測和控制方法⑴溫度，空氣過濾74生物制藥-發酵工程制藥課件75生物制藥-發酵工程制藥課件76生物制藥-發酵工程制藥課件77生物制藥-發酵工程制藥課件78生物制藥-發酵工程制藥課件79生物制藥-發酵工程制藥課件80生物制藥-發酵工程制藥課件81發酵工程制藥張忠山發酵工程制藥張忠山82為什么要利用微生物抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微生物發酵來生產？這與微生物的生長和代謝特點有什么關系？為什么要利用微生物抗生素、氨基酸、酶制劑等產品為什么能通過微831、某些微生物因爭奪生存環境或營養物，會產生抗生素將其他種類的微生物殺死。2、微生物會產生蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶，將營養物質水解成可吸收的小分子的多肽或氨基酸、葡萄糖。3、微生物細胞會通過合成或分解代謝生產它必需的一些物質，包括氨基酸、核苷酸等。1、某些微生物因爭奪生存環境或營養物，會產生抗生素將其他種類84微生物的優點微生物繁殖非常迅速微生物培養易于控制微生物本身也容易改造微生物的優點微生物繁殖非常迅速85微生物發酵發酵：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經過特定的代謝途徑轉化為人類所需要的產物的過程。發酵工程：采用現代化工程技術手段，利用微生物的某些特定功能，為人類生產有用的產品，或直接把微生物應用于工業生產過程的一種新技術。微生物發酵發酵：利用微生物，在適宜的條件下，將原料經過特定的86微生物的應用酒類：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用釀酒酵母，在厭氧條件下進行發酵，將葡萄糖轉化為酒精生產的。白酒經過蒸餾，因此酒的主要成分是水和酒精，以及一些加熱后易揮發物質，如各種酯類、其他醇類和少量低碳醛酮類化合物。果酒和啤酒是非蒸餾酒，發酵時酵母將果汁中或發酵液中的葡萄糖，轉化為酒精，而其他營養成分會部分被酵母利用，產生一些代謝產物，如氨基酸、維生素等，也會進入發酵的酒液中。因此，果酒和啤酒營養價值較高。

微生物的應用酒類：包括果酒、啤酒、白酒及其他酒均是利用釀酒酵87微生物的應用醋：食品店或超市出售的醋中，除了白醋是由化學合成的食品級醋酸勾兌的外，其他的則是由醋酸菌在好氧條件下發酵，將固體發酵產生的酒精轉化為醋酸生產的。由于使用的微生物菌種或曲種的差異，在葡萄糖發酵過程中會產生乳酸或其他有機酸，因而使醋有不同的風味。

微生物的應用醋：食品店或超市出售的醋中，除了白醋是由化學合成88微生物的應用醬油：醬油生產以大豆為主要原料，其他有麥麩、小麥、玉米等，將上述原料經粉碎制成固體培養基，在好氧條件下，利用產生蛋白酶的霉菌，如黑曲霉進行發酵。微生物在生長過程中會產生大量的蛋白酶，將培養基中的蛋白質水解成小分子的肽和氨基酸，然后淋洗、調制成醬油產品。醬油富含氨基酸和肽，具有特殊香味。

微生物的應用醬油：醬油生產以大豆為主要原料，其他有麥麩、小麥89微生物的應用醬：以大豆和少量面粉為原料，蒸煮后在空氣中自然發酵。發酵過程主要是能夠產生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的霉菌，將大豆中的蛋白質、脂肪、淀粉分解，產生出氨基酸、多肽、甘油、脂肪酸等多種物質。這些物質使醬具有獨特的醬香味。微生物的應用醬：以大豆和少量面粉為原料，蒸煮后在空氣中自然發90微生物的應用酸奶：牛奶在厭氧條件下，由乳酸菌發酵，將乳糖分解，并進一步發酵產生乳酸和其他有機酸，以及一些芳香物質和維生素等；同時蛋白質也部分水解。因此，酸奶是營養豐富、易消化，少含乳糖，是適合于有乳糖不適應癥者的優良食品。

微生物的應用酸奶：牛奶在厭氧條件下，由乳酸菌發酵，將乳糖分解91微生物的應用醪糟：又稱酒釀，是大米經蒸煮后，接種根霉，在好氧條件下，發酵生產的含低濃度酒精和不同糖分的食品。根霉在生長時會產生大量的淀粉酶，將大米中的淀粉水解成葡萄糖，同時利用部分葡萄糖發酵產生酒精。由于使用的根霉菌種不同，可以生產不同酒精度、不同甜度和不同香味的醪糟。

微生物的應用醪糟：又稱酒釀，是大米經蒸煮后，接種根霉，在好氧92微生物的應用面包：現在的面包均是利用活性干酵母（面包酵母）經活化后，與面粉混合發酵，再加入各種添加劑，經烤制生產的。面粉發酵后淀粉結構發生改變，變得易于消化、營養易于吸收。微生物的應用面包：現在的面包均是利用活性干酵母（面包酵母）經93微生物的應用饅頭：以前做饅頭的面粉是經自然發酵后蒸制的，如果連續使用面肥發酵，經幾代發酵，微生物會因生長優勢而單一化。發酵的菌種一般多為乳酸菌。因為發酵產酸，在蒸制前要用堿中和酸，制得的饅頭才松軟適口、帶有特殊香味。現在，大批量生產是采用干酵母發酵，所以不產酸，不需要再用堿中和即可蒸制。微生物的應用饅頭：以前做饅頭的面粉是經自然發酵后蒸制的，如果94微生物的應用制藥業：抗生素、氨基酸、維生素的生產；食品業：醋、醬油、醬、酒等的生產；輕工業：檸檬酸、乳酸、味精、肌苷酸、干酵母、色素、黃原膠、甘油等的生產；化工業：酒精、丙酮、丁醇、衣康酸、丙烯酰胺和聚丙烯酰胺等的生產；飼料業：飼料添加劑的生產；農藥業：農用抗生素、微生物肥料、微生物農藥等的生產。微生物的應用制藥業：抗生素、氨基酸、維生素的生產；95

發酵工程是一門具有悠久歷史，又融合了現代科學的技術，是現代生物技術的組成部分。本章主要介紹發酵工程的基本內容和基本原理，重點介紹了工業發酵的工藝流程,還介紹了典型產品的發酵生產工藝，如青霉素，谷氨酸和維生素C的生產。發酵工程是一門具有悠久歷史，又融合了現代科學的技術96

微生物發酵制藥是利用微生物進行藥物研究、生產和制劑的綜合性應用技術科學。研究內容包括微生物制藥用菌的選育，發酵以及產品的分離和純化工藝等。主要討論用于各類藥物發酵的微生物來源和改造、微生物藥物的生物合成和調控機制、發酵工藝與主要參數的確定、藥物發酵過程的優化控制、質量控制等。微生物發酵制藥是利用微生物進行藥物研究、生產和制劑的97第一節微生物發酵概論1857年巴斯德提出著名發酵理論：“一切發酵過程都是微生物作用的結果。”1929年Flemming爵士發現了青霉素，增加一大類新產品-抗生素。一、微生物發酵的概念及發展史第一節微生物發酵概論1857年巴斯德提出著名發酵理論：“9820世紀40年代，以獲取細菌的次生代謝產物-抗生素為主要特征的抗生素工業成為微生物發酵工業技術的支柱產業。20世紀50年代，氨基酸發酵工業又成為微生物技術產業的又一個成員，實現了對微生物的代謝進行人工調節，這又使微生物技術進了一步。20世紀40年代，以獲取細菌的次生代謝產物-抗生素為主要特征9920世紀60年代，微生物技術產業又增加了酶制劑工業這一成員。20世紀70年代，為了解決由于人迅速增長而帶來的糧食短缺問題，進行了非碳水化合物代替碳水化合物的發酵，如利用石油化工原料進行發酵生產，培養單細胞蛋白，進行污水處理，能源開發等。20世紀60年代，微生物技術產業又增加了酶制劑工業這一成員。10080年代以來，隨著重組DNA技術的發展，可以按人類社會的需要，定向培養出有用的菌株，這為微生物發酵技術引入了遺傳工程的技術，使微生物技術進入了一個新的階段。目前，人們把利用微生物在有氧或無氧狀態下生命活動來制備微生物菌體或其它代謝產物的過程統稱為發酵。80年代以來，隨著重組DNA技術的發展，可以按人類社會的需要101

1.微生物菌體發酵

是以獲得具有某種用途的菌體為目的的發酵。用于面包制作的酵母發酵及用于人類或動物食品的微生物菌體蛋白發酵是比較傳統的菌體發酵工業。新的菌體發酵可用來生產藥用真菌，如香菇菌、依賴蟲蛹而生存的冬蟲夏草菌、與天麻共存的密環菌等藥用菌。二、微生物發酵的類型1.微生物菌體發酵二、微生物發酵的類型1022.微生物酶發酵

酶普遍存在于動物、植物和微生物中。因為微生物種類多、產酶的品種多、生產容易和成本低等特點，所以目前工業應用的酶大多來自微生物發酵。如用于抗癌的天冬酰胺酶和用于治療血栓的納豆激酶和鏈激酶等。2.微生物酶發酵103

3.微生物代謝產物發酵

微生物代謝產物很多。在菌體對數生長期所產生的產物，如氨基酸、核苷酸、蛋白質和糖類等是菌體生長繁殖所必需的，這些產物叫做初級代謝產物。在菌體生長靜止期，某些菌體能合成一些具有特定功能的產物，如抗生素、生物堿、植物生長因子等。這些產物與菌體生長繁殖無明顯關系，叫做次級代謝產物。

3.微生物代謝產物發酵104

4.微生物的轉化發酵

微生物的轉化是利用微生物細胞的一種或多種酶，把一種化合物轉變成結構相關的更有經濟價值的產物。可進行的轉化反應包括：脫氫反應、氧化反應、脫水反應、縮合反應、氨化反應、脫氨反應等。

4.微生物的轉化發酵1055.生物工程細胞的發酵是指利用生物工程技術所獲得的細胞，如DNA重組的“工程菌”，細胞融合所得的“雜交”細胞等進行培養的新型發酵。此類發酵的產物多種多樣，如用基因工程菌生產胰島素、干擾素等。5.生物工程細胞的發酵106優良的微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，微生物資源非常豐富，廣泛分布于土壤、水和空氣中，尤以土壤中為最多。1.從微生物分類學的角度把所需菌種分為：細菌類如短桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、梭狀芽孢桿菌等；酵母菌如啤酒酵母、酒精酵母、漢遜酵母和假絲酵母等；霉菌如黃曲霉、紅曲霉、青霉菌和赤霉菌等；放線菌如各種抗生素，鏈、慶大等。三、微生物發酵工業所用菌種優良的微生物菌種是發酵工業的基礎和關鍵，微生物資源非107

2.作為工業微生物發酵使用的菌種，通常有以下特點：(1)具有穩定的遺傳學特性。(2)微生物生長和產物的合成對于基質沒有嚴格的要求。(3)生長條件易于滿足。(4)具有較高的各種酶活力。（5）對于包含體，要求在細胞破碎是不易破碎，而在目的產物的分離提出時，則易破碎。2.作為工業微生物發酵使用的菌種，通常有以下特點：(11081.微生物發酵過程是一個典型的化工過程。2.微生物發酵過程是一個典型的代謝控制發酵。3.微生物發酵工業又是一個有別于化工過程的一個工業。四、微生物發酵的基本特征1.微生物發酵過程是一個典型的化工過程。四、微生物發酵的基本109啤酒制造工藝流程啤酒制造工藝流程110

啤酒制造工藝流程啤酒制造工藝流程111

微生物發酵主要有以下幾個特征：（1）反應條件溫和。通常由于微生物的生理特性，要求溫度為30℃～40℃、pH值中性偏酸性如酵母、霉菌、放線菌的發酵和pH值中性偏堿性如細菌的發酵。（2）無菌發酵，整個反應過程要求無菌。培養基無菌、空氣無菌、補料和取樣要求無菌操作、某些工程菌，其尾氣也要求進行無菌處理。微生物發酵主要有以下幾個特征：112（3）非連續性生產。微生物的生理特性決定了發酵過程的非連續性，大部分的工業發酵是以間歇操作為基礎進行的，目前可以實現連續化生產的是啤酒的連續化生產。（3）非連續性生產。微生物的生理特性決定了發酵過程的非連續113第二節工業發酵的工藝流程

生物發酵工藝多種多樣，但基本上包括菌種的選育、菌種培養基的配制、擴大培養和接種、發酵過程下游處理即分離提純等幾個過程。第二節工業發酵的工藝流程生物發酵工藝多種多樣114找到合適的菌種是發酵工程的前提。人們最初是從自然界尋找所需要的菌種，如谷氨酸發酵時常用菌有谷氨酸棒狀桿菌等。但這種方法得到的菌種，產量一般都比較低。20世紀40年代，微生物學家開始用紫外線、激光、化學誘變劑等處理菌種，使菌種產生突變，以篩選出符合要求的優良菌種。隨著細胞工程、基因工程等技術的日益成熟，科學家開始構建工程細胞或工程菌，用它們進行發酵，甚至能生產出一般微生物所不能生產的產品。一、菌種的選育找到合適的菌種是發酵工程的前提。人們最初是從自然界尋一、菌115菌種選育的必要性和重要性

必要性：1、經誘變劑處理的細胞中只有一部分是突變型菌株，而有害突變往往占有很大比例；2、從自然界篩選得來的菌株，藥物代謝合成能力均很低，野生型菌株由于長時間生長在非最適條件下，產物濃度很低，對于工業生產來說，如果不進行菌種改良，勢必造成生產成本過高。菌種選育的必要性和重要性必要性：116重要性：1、菌種選育是提高單位產量和改進產品質量的重要措施；2、能夠改變菌種的某些遺傳性狀，使之更適合于工業生產，例如抗噬菌體的菌株能利用廉價發酵原料或需氧量較小的菌株等。重要性：117選育方法1、自然選育：是指微生物細胞群體不經過人工處理而利用菌種的自發突變（spontaneousmutation）進行菌種篩選的育種方法。效率低、進展緩慢。選育方法1、自然選育：是指微生物細胞群體不經過人工處理而利用1182、誘變育種：是用不同的誘變劑（mutagen）處理微生物的細胞群體，以誘發各種遺傳突變，然后采用簡便、快速和高效的篩選方法，從中選出所需要的突變株（mutant）。發酵工業中使用的高產菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產性能的菌株，故至今仍是菌種改良的主要方法。2、誘變育種：是用不同的誘變劑（mutagen）處理微生物的119（一）方法和原理A.誘變機制（1）微小損傷突變：堿基置換，碼組移動（2）染色體畸變：易位，逆位，缺失，重復（3）染色體組突變：數目變化（單倍體變多倍體）B.誘變劑及其作用方式：物理誘變劑，化學誘變劑，生物誘變劑常用誘變劑p-263（一）方法和原理120（二）誘變和篩選初步篩選是關鍵步驟A.自身耐藥突變株：耐受自身分泌的抗生素，提高產量B.結構類似物或前體類似物的耐受突變株：解除反饋抑制（二）誘變和篩選121C.營養缺陷型及其回復突變株通過誘變導致某些基因的突變，而需要添加一些物質（氨基酸、核苷酸等）才能生長的突變體。營養缺陷型的作用：（1）解除末端產物的反饋調節作用。（2）作為標記，在雜交育種中作為出發菌株有利于雜交重組的分析。（3）作為基因工程的受體菌，檢出克隆基因的表達。C.營養缺陷型及其回復突變株1223、雜交育種：是將兩個基因型不同的親株的某些遺傳信息，通過雜交重組于同一重組體中，形成新的遺傳型個體的過程。傳統的雜交育種在真核微生物中可以通過有性雜交及準性雜交兩種途徑；在原核微生物中（如細菌和放線菌）則可通過接合雜交進行。3、雜交育種：是將兩個基因型不同的親株的某些遺傳信息，通過雜123a.準性生殖（parasexualreproduction）：是指真菌中不通過有性生殖的基因重組過程。b.接合（conjugation）：在細菌和放線菌中，接合是最常見的雜交方式。二親株的細胞在固體培養基上混合培養時，一親株細胞的基因組片段進入另一親株的細胞，發生部分染色體的轉移或遺傳信息的交換，形成部分合子，經過二次交換形成單倍重組體。a.準性生殖（parasexualreproductio124c.原生質體融合（protoplastfusion）：兩親本菌株的原生質體在高滲條件下混合，以聚乙二醇作為助融劑，或在一定電場條件下，通過電脈沖作用促進原生質體互相聚集，誘導融合，接著兩親本遺傳物質交換，從而實現遺傳重組。在適宜的條件下，融合細胞可再生成新的完整細胞，就有可能獲得具有合乎理想的新遺傳性狀的重組子。c.原生質體融合（protoplastfusion）：兩125二、發酵的基本過程基本過程為：菌種種子制備發酵發酵液預處理提取精制二、發酵的基本過程基本過程為：126生物制藥-發酵工程制藥課件127菌種發酵工程中所用的菌種多要求是純培養的，即整個發酵過程不能混有雜菌，否則將導致產量大大下降，甚至得不到產品。例如，如果青霉素生產過程中污染了雜菌，這些雜菌會分泌青霉素酶，將形成的青霉素分解掉。因此，培養基和發酵設備都必須經過嚴格的滅菌。菌種發酵工程中所用的菌種多要求是純培養的，即整個發酵過程不能128種子制備在搖瓶或小罐內進行。種子罐一般用鋼或不銹鋼制成，相當于小型發酵罐。接種前所有設備及培養基要經過嚴格滅菌。在大規模的發酵生產中，需要將選育出的優良菌種經過多次擴大培養，讓它們達到一定數量以后，再進行接種。種子制備在搖瓶或小罐內進行。129發酵接種量：5-20%通氣量：0.3-1m3/m3攪拌功率消耗：1-2kW/m3罐溫：26-37℃罐壓：0.3-0.5kg/cm2發酵周期：2～8d發酵接種量：5-20%130生物制藥-發酵工程制藥課件131生物制藥-發酵工程制藥課件132發酵結束后，要對發酵液或生物細胞進行分離和提取精制，將發酵產物制成合乎要求的產品。對發酵產品的要求不同，分離提純的方法也相應有些區別。利用發酵工程生產的產品有菌種代謝產物和菌種本身（如酵母菌和細菌）兩大類，如果產品是菌種，分離方法一般是通過過濾、沉淀從培養液中分離出；如果產品是代謝產物，則采用蒸餾、萃取、離子交換等方法提取。分離提純后的產品，還要經過質量檢查合格后，才能成為正式產品。產物提取發酵結束后，要對發酵液或生物細胞進行分離和提取精制，將133發酵方式1、分批(間歇)發酵：物料一次投入反應器中，滅菌、接種、發酵。特點：一次性；發酵過程中，營養不斷減少，微生物不斷增殖，環境非穩態；微生物生長的四個時期明顯；應用廣泛，改善（在線檢測，計算機控制）。發酵方式1、分批(間歇)發酵：物料一次投入反應器中，滅菌、接1342、補料分批發酵：補加新鮮培養基。特點：可以解除底物抑制、產物抑制或克服微生物過度生長；提高有用產物的轉化率；應用廣泛，用于面包酵母、氨基酸、抗生素等工業；2、補料分批發酵：補加新鮮培養基。1353、連續發酵：恒化器（基質恒）、恒濁器（菌體密度恒），連續進料出料平衡，保持恒定的發酵液密度。易實現自動化生產，如啤酒，乙醇的發酵。優點：操作穩定；利于機械、自動化；提高設備的利用率；減少滅菌次數；易于過程優化。缺點：易染菌；微生物易變異；對產品類型的適應性不廣；對設備及附件要求高。3、連續發酵：恒化器（基質恒）、恒濁器（菌體密度恒），連續進136第三節發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制二、溫度的影響及其控制三、溶氧的影響及其控制四、pH的影響及其控制第三節發酵工藝控制一、培養基的影響及其控制137一、培養基的影響及其控制

1、碳源：糖類，脂肪，有機酸，碳氫化合物（速效碳源葡萄糖；遲效碳源淀粉，乳糖）（菌體干物質的50%以上是碳）。主要功能：①提供能源；②菌體成分；③產物碳架；來源：葡萄糖、糖蜜、淀粉及水解物是常用的碳源。一、培養基的影響及其控制1382、氮源：無機氮源，有機氮源（速效氮源氨基酸，玉米漿；遲效氮源黃豆餅粉，花生餅粉、棉籽餅粉）。速效促生長，遲效利代謝。（占干物質量的10%）。主要功能：①構成細胞物質。②構成產物。來源：花生粉、黃豆餅粉、玉米漿、銨鹽、硝酸鹽、尿素和氨水等是常使用的氮源。2、氮源：無機氮源，有機氮源（速效氮源氨基酸，玉米漿；遲1393、無機鹽和微量元素

主要功能：①構成菌體成分（S）②激活酶（Mg2+）③輔酶或輔基的組成部分④參與能量轉移反應⑤調節滲透壓、pH、氧化還原電位來源：無機鹽、原料、灰分。4、特殊生長因子：不可缺、量微，自身不能合成或量不夠。主要功能：①構成輔酶②促進生命活動來源：玉米漿、糖蜜、甜菜糖、麩皮、米糠。3、無機鹽和微量元