農桿菌介導法農桿菌介導法1農桿菌感染柳樹產生冠癭瘤農桿菌2原理：根癌農桿菌和發根農桿菌細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。原理：3

因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的4農桿菌介導法課件5農桿菌介導法課件6Story冠癭瘤病：雙子葉植物經常發生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形似帽狀而得名。1907年，Smith&Townsent

農桿菌誘發冠癭瘤病。1947年，Braunetal.

證實倆者的關系，但發現有的菌株不致病。提出了假說：tumour-inducingprinciple,TIP.腫瘤誘導因子。60’s,腫瘤組織中含高濃度的氨基酸（octopine,nopaline）

總稱冠癭堿（opine)

。Petitetal.證實腫瘤組織合成的冠癭堿取決于菌株，而且菌株能專一地利用冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實了TIP)Story7Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.生長素和細胞分裂素；4um，分子質量為（90－150）×106Da。d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.近年來人們對農桿菌介導法機理作了深入研究，發現了酚類化合物在外源基因導入植物細胞的作用。5)

processinganddeliveryoftheT-DNA1986)，能夠在T-DN

A邊界重復序列的特異位點切開T-DNA單鏈，因此T-DNA往往以單鏈形式進入植物細胞。usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)T37(T37chromosome,pTi37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)誘導因子。可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。證實倆者的關系，但發現有的菌株不農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。當外源基因插入后，重組質粒可在輔助質粒的幫助下從大腸桿菌轉移到根癌農桿菌。C58(C58chromosome,pTiC58)最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。1974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.

從致瘤農桿菌中分離出一類巨大的質粒

(tumorinducingplasmid)，稱為Ti質粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子雜交技術證實腫瘤細胞中存在外源的DNA,與Ti質粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色體的農桿菌質粒DNA片段，

T-DNA(transferredDNA),其內有致瘤和冠癭堿合成酶等基因。1981年，Oomsetal.發現Ti質粒上有致瘤區(virulenceregion)，Vir區。Agropine:pRi1855,pRi158Ti質粒Ti質粒9Ti質粒是根癌農桿菌細胞核外存在的一種環狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.1－75.4um，分子質量為（90－150）×106Da。在溫度低亍28℃的條件下，Ti質粒可穩定地存在于根癌農桿菌細胞內。農桿菌介導法課件10Ti質粒除上述上述誘導受侵染的植物組織產生冠癭瘤外，還具有以下幾種重要功能：1賦予根癌農桿菌附著于植物細胞的能力；2賦予根癌農桿菌分解代謝冠癭堿的能力；3根癌農桿菌的寄主植物范圍；4決定所誘導的冠癭形態和冠癭堿的成分；5參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細胞分裂素的代謝活.Ti質粒除上述上述誘導受侵染的植物組織產生冠癭瘤外，還具有111)Ti質粒的結構來自于不同野生型根癌農桿菌的Ti質粒可根據其產生的冠癭堿類型分為三類：章魚堿(octopine)類胭脂堿(nopaline)類農桿堿（agropine）類。Ti質粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質粒上的冠癭堿分解基因產物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti質粒的結構12農桿菌介導法課件13長度：160-250kb6大功能區：1)致癌區，這個區主要合成植物生長素和細胞分裂素；2)冠癭堿合成區；3)冠癭堿分解區；4)Ti質粒接合轉移區(tra)；5)毒性區（Vir）；6)DNA復制區（Rep）。長度：160-250kb14T-DNAT-DNA15在致癌區和冠癭堿合成區的兩側存在著一個24bp直接重復序列，由這三部分所構成的DNA區域叫做T-DNA，插入植物染色體中的Ti質粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物細胞染色體中的位置不相同的，因此植物染色體上可能并沒有可供T-DNA插入的專一性DNA序列。在致癌區和冠癭堿合成區的兩側存在著一個24bp直接重復序列16脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp的重復序列,構成T-DNA的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(leftborder,LB)和右邊界(rightborder,RB).在某些章魚堿型根癌農根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA是以兩個分開的獨立片段形式存在，即T-DNA左邊區段和T-DNA右邊區段。研究表明，插入在T-DNA邊界序列之間的任何DNA都可被轉到植物染色體中。因此Ti質粒可用做外源目的基因的載體。脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp17T-DNA區域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達.Tms1、Tms2、Tmr這3個基因表達產物催化生成的植物生長素（Tms1、Tms2

）和細胞分裂素（Tmr

）,可調節植物細胞的生長和發育,它們的過量表達刺激植物細胞大量快速增長而形成冠癭.冠癭也是在冠癭堿胞內合并成分泌出來的,構成根癌農桿菌生長所須的碳源和氮源.T-DNA區域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組18在植物轉基因早期階段，由于農桿菌轉化系統即簡單又不需要很多儀器設備，就成為很多科學工作者首先研究的熱點。農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。可見T-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點的效率比右邊界序列低。(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.uphosphatestarvation證實倆者的關系，但發現有的菌株不6)T-DNAintegrationuacidicenvironment農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。Limitedinhostrange,genotype-dependent脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp的重復序列,構成T-DNA的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(leftborder,LB)和右邊界(rightborder,RB).總稱冠癭堿（opine)。最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉化效率更

高。Table1SummaryofvirGeneProducts3)

inductionandinitiationofvirulencegenesuphenols:acetosyringone(strongerinducer)生長素和細胞分裂素；由于這些基因不能直接在植物細胞中表達，因此就把這些基因的編碼區DNA插入某些植物基因的啟動子后面，編碼區后面則是來自植物基因的3'-端DNA順序，其中包括終止子序列。1947年，Braunetal.Ti質粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質粒上的冠癭堿分解基因產物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。Vir區在植物轉基因早期階段，由于農桿菌轉化系統即簡單又不需要很多儀19Vir區（Vir-region），即毒性區，又稱致瘤區域，其長度約為35kb。它們控制根癌農桿菌附著于植物細胞和Ti質粒進入細胞有關部位，與感染后冠癭形成有關。Vir區位于T-DNA區左側，包含義個毒性遺傳點（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因的控制著Ｔ－ＤＮＡ的轉移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAvirＥ20植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創傷誘導分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農桿菌對這一類物質具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創傷誘導分子的刺激，Ti質粒vir區毒性基因被激活和表達。植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創傷誘導分子21目前已經發現9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用較強，兒茶酚、原兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚和對羥基苯酚處理農桿菌時也對Vir區的基因表達起促進作用。雙子葉植物在在農桿菌侵染時可以形成大量的信號因子，而使T-DNA可以成功的轉入；而單子葉植物需要加入外源酚類物質，才能激活Vir區的基因，達到轉基因的目的。目前已經發現9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香22最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經磷酸化由非活性態變為活化狀態，進而激活vir區其他基因表達。virA基因——virG基因最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜23其中virD基因產物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉變為松弛型狀態；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態的T-DNA，2個邊界產生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結合蛋白。可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。其中virD基因產物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使24農桿菌介導法課件25植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創傷誘導分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農桿菌對這一類物質具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創傷誘導分子的刺激，Ti質粒vir區毒性基因被激活和表達。植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創傷誘導分子26最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經磷酸化由非活性態變為活化狀態，進而激活vir區其他基因表達。其中virD基因產物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉變為松弛型狀態；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態的T-DNA，2個邊界產生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結合蛋白。可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。T-復合體依次穿過根癌農桿菌和植物細胞膜及細胞壁。并進入植物細胞核，最終整合進入植物核基因組。T-DNA的轉移機理比較復雜，依賴于T-DNA區和vir區共同參與，涉及多個基因表達及一系列蛋白質和核酸的相互作用。最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜27Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG28Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Vir基因表達調控的問題，知道VirA和VirG基因誘導其它Vir基因的表達，當VirD操縱元的被誘導表達后，其中的VirD1和VirD2蛋白質具有核酸內切酶的活性(Yanofsky

M．F.可見T-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點的效率比右邊界序列低。TGGATATATTGNPuGTGTAAAT1)hostperceptionTGGATATATTGNPuGTGTAAATuphenols:acetosyringone(strongerinducer)homologybetweenplantjunctionsandT-DNAsequences?可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。在這個載體中，有來自Ti質粒的T-DNA兩個末端的片段TL和TR，其中有適合于植物細胞的標記基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位點區（MCS）。發現Ti質粒上有致瘤區(virulence發現Ti質粒上有致瘤區(virulence5)

processinganddeliveryoftheT-DNATGGATATATTGNPuGTGTAAATA208(C58chromosome,Pti37)ulowpH(optimum,approximately5.由于大腸桿菌和根癌農桿菌之間的DNA轉移頻率可達100%，因而整個基因組文庫或cDNA文庫可以全部轉移到農桿菌中。4um，分子質量為（90－150）×106Da。hotspots(activelytranscribed)?1981年，Oomsetal.thesefindingsformfhebasisofthedesignofmodifiedandsimplifiedt-dnamoleculesfhatareusefulasvectorstotransformplantcellswithcloneddnafragmentsofinterest(57,72,113).nuclearlocalization?(VirD2)它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。rhizogenes:provokeshairroots.發現Ti質粒上有致瘤區(virulenceusugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)4um，分子質量為（90－150）×106Da。證實倆者的關系，但發現有的菌株不農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。uacidicenvironment插入植物染色體中的Ti質粒片段只有T-DNA。pre-infectionattachmentLimitedinhostrange,genotype-dependent植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創傷誘導分子。TGGATATATTGNPuGTGTAAAT可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。超聲波予處理植物組織，可以提高轉化效率。在外源的DNA,與Ti質粒的DNA有同源性，是整1977年，Chiltonetal.(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.T-DNA單鏈

的5’端共價的結合著VirD2蛋白質，從而保護T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白質上含有核定位的序列，所以結合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白質象一個“導向儀”(pilot)指引并保護T-DNA進入植物細胞核中。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉化效率更

高。③T-DNA加工和轉移

Vir基因表達調控的問題，知道VirA和VirG基因誘導其它Vir基因的表達，當VirD操縱元的被誘導表達后，其中的VirD1和VirD2蛋白質具有核酸內切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能夠在T-DN

A邊界重復序列的特異位點切開T-DNA單鏈，因此T-DNA往往以單鏈形式進入植物細胞。但是在植物細胞中也發現雙鏈T-DNA分子。Strains:AgrobacteriumStrains29切刻位點(nick

site)可作為DNA從5’向3'合成的起始位點，新的DNA鏈合成后，T-DNA單鏈即被替換(displacement)釋放出來(圖2)。當然這種缺刻也可通過重組系統把T-DNA雙鏈從Ti質粒上解離下來。切刻位點(nick

site)可作為DNA從5’向3'合成的30缺失研究也表明：右邊界重復序列缺失后，T-DNA不能轉移，而左邊界重復序列的缺失會稍稍降低T-DNA轉移頻率(Timmerman

B．1988)，這進一步說明T-DNA單鏈是在從右邊界到左邊界5’向3‘替換合成中釋放出來的。缺失研究也表明：右邊界重復序列缺失后，T-DNA不能轉移，而31右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉移到植物細胞。而左邊界的缺失，僅會影響DNA合成過程的終止，可能會降低導致T-DNA單鏈釋放，而不會明顯影響T-DNA單鏈的形成。右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放32可見T-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點的效率比右邊界序列低。這種不同不是由于左右邊界的24bp重復序列核苷酸不同，而是由于靠近右邊界位置有一個轉移增強子(transfer

enhancer；overdriver．Peralta

EG．1986)存在。這個T-DNA轉移增強序列能極其明顯的增加農桿菌中T-DNA鏈形成，并且這種作用與它的位置、方向及距離均無關系。增強子的缺失能夠使農桿菌對宿主植物的毒性降低。Toro等人發現VirC1蛋白能特異性的結合這個增強子，VirC操縱元的突變也能導致農桿菌的毒性減弱。農桿菌介導法課件33當T-DNA單鏈進入植物細胞后，植物細胞如何處理這些單鏈DNA？Paul等

人利用電轉移法把單鏈DNA轉化到煙草原生質體中，結果表明，在植物細胞中，

單鏈DNA迅速轉變成雙鏈DNA分子。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉化效率更

高。然而T-DNA分子并非以裸露的單鏈DNA形式進入植物細胞的。T-DNA單鏈

的5’端共價的結合著VirD2蛋白質，從而保護T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白質上含有核定位的序列，所以結合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白質象一個“導向儀”(pilot)指引并保護T-DNA進入植物細胞核中。VirE2蛋白

質是一種單鏈結合蛋白質，能夠包裹T-DNA單鏈，和其它T-DNA結合蛋白質共

同構成了T-復合體。當T-DNA單鏈進入植物細胞后，植物細胞如何處理這些單鏈DN34冠癭堿分解區冠癭堿分解區35冠癭也是在冠癭堿胞內合并成分泌出來的,被冠癭堿分解基因分解成根癌農桿菌生長所須的碳源和氮源。冠癭也是在冠癭堿胞內合并成分泌出來的,被冠癭堿分解基因分解成36載體載體37植物是人類和所有動物賴以生存的基礎，因此開展植物基因工程的研究，建立起轉基因植物新材料是十分重要的。象其它生物一樣，植物的克隆載體對于開展植物基因工程是必須，然而十分遺憾的是，至今仍未建立起植物的自主復制型載體。植物是人類和所有動物賴以生存的基礎，因此開展植物基因工程的研38Ti質粒載體

利用Ti質粒構建的植物載體種類很多，常用的是雙元載體(binaryvector)，這是一類能在大腸桿菌和根癌農桿菌中進行復制的廣譜宿主載體。這類載體所使用的復制起點來自細胞質粒RK2，攜帶著兩個T-DNA邊界順序和各種標記基因。當外源基因插入后，重組質粒可在輔助質粒的幫助下從大腸桿菌轉移到根癌農桿菌。這種農桿菌內存在著一種T-DNA已全部丟失的Ti質粒(pAL4404)，它可以幫助重組雙元質粒上的T-DNA轉移到植物細胞中。由于大腸桿菌和根癌農桿菌之間的DNA轉移頻率可達100%，因而整個基因組文庫或cDNA文庫可以全部轉移到農桿菌中。

農桿菌介導法課件39

在這個載體中，有來自Ti質粒的T-DNA兩個末端的片段TL和TR，其中有適合于植物細胞的標記基因新霉素抗性基因Neor和供外源基因插入的多克隆位點區（MCS）。用于植物轉化細胞的選擇標記基因主要是來自細菌的某些抗藥性基因，因為植物細胞對某些抗生素十分敏悉，比如卡那霉素、潮霉素、新霉素等。由于這些基因不能直接在植物細胞中表達，因此就把這些基因的編碼區DNA插入某些植物基因的啟動子后面，編碼區后面則是來自植物基因的3'-端DNA順序，其中包括終止子序列。

40農桿菌介導法課件41早在上世紀初Smith等人就發現作為自然存在的遺傳工程，土壤中生存的根癌農桿菌可以將外源基因轉入植物而導致根腫瘤的生成。農桿菌的致病基因在酸性條件和酚類誘導物（如乙酰丁香酮）的存在下，微生物DNA分子的一部分可以轉入植物細胞并插入到植物基因組中。這類酚類誘導物是大多數雙子葉植物在受到傷害時產生的。在植物轉基因早期階段，由于農桿菌轉化系統即簡單又不需要很多儀器設備，就成為很多科學工作者首先研究的熱點。1977年Chilton等人證明根癌農桿菌的Ti質粒的一部分轉入植物細胞，整合進植物基因組使植物產生腫瘤。農桿菌轉入植物的DNA片段稱為轉移DNA（T-DNA）。Ti質粒可以將外源基因轉入植物的能力引起人們的廣泛興趣，早期的植物轉基因工作既是用它作為植物轉基因的載體，進行大量轉基因研究。早在上世紀初Smith等人就發現作為自然存在的遺傳工程，土42農桿菌介導法目前以根癌農桿菌使用的較多，尤其在早期的雙子葉植物的遺傳轉化研究中上發揮了重要作用。近年來人們對農桿菌介導法機理作了深入研究，發現了酚類化合物在外源基因導入植物細胞的作用。尤其是日本煙草公司的Hiei等人在水稻遺傳轉化上應用農桿菌介導法獲得了明顯的進展，使這一轉化方法在單子葉植物中也有了成功的應用。農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。農桿菌介導法目前以根癌農桿菌使用的較多，尤其在早期的雙子葉植43Ti質粒可以將外源基因轉入植物的能力引起人們的廣泛興趣，早期的植物轉基因工作既是用它作為植物轉基因的載體，進行大量轉基因研究。1)hostperceptiond)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.6)T-DNAintegration③T-DNA加工和轉移早在上世紀初Smith等人就發現作為自然存在的遺傳工程，土壤中生存的根癌農桿菌可以將外源基因轉入植物而導致根腫瘤的生成。pre-infectionattachment它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。T37(T37chromosome,pTi37)發現Ti質粒上有致瘤區(virulenceCleanerinsertsTi質粒是根癌農桿菌細胞核外存在的一種環狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.integrationsites:random?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223DisadvantagesMoloecularmechanismsofT-DNAtransferintotheplantgenomeT-DNA區域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達.nuclearlocalization?(VirD2)5,25,32,48,38cel:cellulosesynthesizinggenes.在雙子葉植物的轉化研究中，可以用植物的葉片、幼莖、懸浮培養物、及發芽的種子等作為外植體進行農桿菌轉化試驗。在進行農桿菌轉化試驗中常常要對不同的農桿菌菌株、農桿菌和植物外植體共培養的時間和溫度及選擇壓力進行優化，以獲得更高的轉化效率。根據Escudero等人研究結果，在自然條件下農桿菌可以滲入植物細胞，因而在作農桿菌轉化時，沒有必要對植物組織制造傷口。超聲波予處理植物組織，可以提高轉化效率。在用農桿菌進行葡萄轉化試驗時，用抗氧化劑如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫蘇糖醇處理可以提高轉化效率。

Ti質粒可以將外源基因轉入植物的能力引起人們的廣泛興趣，早期44Agrobacterium-mediatedtransformation

Advantages:1.

Cleanerinserts2.

Higherco-expression3.

Moreflexibleintissuetypes(inplantatransformation)

almostanytypeoftissuesorcells4.Mostlywidelyusedsystem,bothmonocotanddicot5.Easyinmanipulation,Disadvantages1.

Onlygoodfornucleartransformation2.

Limitedinhostrange,genotype-dependent3.

DetrimentaltosometissuesAgrobacterium-mediatedtransfo45IntroductiontoAgrobacteriumMoloecularmechanismsofT-DNAtransferintotheplantgenomeFactorsinfluencingtheT-DNAdeliveryRegenerationandselectionoftransgenicplantsIntroductiontoAgrobacterium46TypesA.tumefaciens:thecausativeagentofplantdiseasecrownggall.rhizogenes:provokeshairroots.Bothcrowngallandroothairareneoplasticdiseases(planttumors),bothgram-negativesoilbacterium.Basedontheopinesproducedinthetumors,Tiplasmidsaredividedinfourgroups,whiletheRiplasmidsfallinthreegroups.Tiplasmidsu

Octopine:pTiAch5,pTiAg57,orpTi19955Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223Leucinnopine:pTi542,pTiAT4D,L-succinamopine:pTiEU6,pTiAT181

Riplasmidsu

Mannopine:pRi8196,pRiTR7Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4Cucumopine:pRi1659Types47Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Examples:C58(C58chromosome,pTiC58)ABI(C58chromosome,pTiMp90RK,disarmedTiC58)GV3850(C58chromosome,pTiGV3850,disarmedTiC58)A281(C58chromosome,pTiBo542)EHA101(C58chromosome,pTiEHA101,disarmedpTiBo542EHA105(C58chromosome,pTiEHA105,disardisarmedpTiBo542)T37(T37chromosome,pTi37)A208(C58chromosome,Pti37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)LBA4404(Ach5chromosome,TiAL4404,disarmedpTiAch5)Strains:48

Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)Examples:C58(C58chromosome,pTiC58)ABI(C58chromosome,pTiMp90RK,disarmedTiC58)GV3850(C58chromosome,pTiGV3850,disarmedTiC58)A281(C58chromosome,pTiBo542)EHA101(C58chromosome,pTiEHA101,disarmedpTiBo542EHA105(C58chromosome,pTiEHA105,disardisarmedpTiBo542)T37(T37chromosome,pTi37)A208(C58chromosome,Pti37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)LBA4404(Ach5chromosome,TiAL4404,disarmedpTiAch5)Strains:AgrobacteriumStrain49MolecularmechanismsofT-DNAtransferintoplantgenomeStepsinT-DNAdelivery1)hostperception2)

pre-infectionattachment3)

inductionandinitiationofvirulencegenes4)synthesisandassemblyofthepromiscuouspilus5)

processinganddeliveryoftheT-DNA6)T-DNAintegrationMolecularmechanismsofT-DNA501)hostperception:

chemicalsignalsproducednaturallybyplantrootsservechemoattractantssuchassucrose,glucoseandfructoseaswellasaminoacidslikevalineandargininearegoodchemoattractants.plantisofolavomoidssuchasformonetonandcoumestrolinitiatingthetranscriptionofchromosomalgenesofAgrobacteriuminvolvedinfacilitatingrootcolonization.mostoftheVirgenesexceptforgenesofthevirbandvireoperonsarerequiredforAgrobacteriummotility.1)hostperception:512).pre-infectionattachment

a)AgrobacteriummustattachtoitshostcellsbeforetheT-DNAisprocessedandreadiedfortransfer,followingchemotaxistothehostplant.b)

attachmentisindependentofTiorRiplasmid.c)

A.tumefaciensadherencetoplantcellsissaturable.d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.e)

Eachplantcellhasenoughattachmentsitesforseveralbacterlum,butplantcellsaretransformedbyonlyoneorafewbacterium.Nolossofcompetenceofplantcellcausesbythefirsrtagrobacteruminfection.f)

Chromosomalgenesinvolvedinattachment

chva,chcb,exoc:synthesisofacyclicβ-1,2-glucan,implicatedinplantcellbinding.cel:cellulosesynthesizinggenes.agrobacteriumcellsformslargeaggregatesmicroscopically,seenasclumpstethetedbycellulosefibrils.pscA:exopolisaccharidesysthesisandsecretionleadingtothesysthesisofcellulosefibrils.att:rootcolonization2).pre-infectionattachment523)inductionandinitiationofvirulencegenesa)virA:autophosphorilatingproteinrespondtotheenvironmentalsignalsbytransferringaphosphategrouptoVirGprotein.Theinductionofvirgenesexpressionissensitivetotemperature(<28℃).ThreetypesofsignalsarerecognizedbyvirA:

uphenols:acetosyringone(strongerinducer)

usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)andsugarderivatives(galacturonicacid)ulowpH(optimum,approximately5.3)b)VirG:transcriptionalactivator.Rate-limitingproteinforvirgeneinduction,anditstranscriptionincreasesinresponsetothepresenceof:

uinducingphenolics

uacidicenvironmentuphosphatestarvationc)chvE:sugar-bindingprotein3)inductionandinitiationof534)synthesisandassemblyofthepromiscuouspilus

uponinductionofthevirgenes,asystematicsetofmoleculareventsleadingtothesynthesisandassemblyoftheconjugativepilustakeplace(seetableorfigureshownlocationandfunctionofVirBproteins)lowtemperatureat19℃isoptimal4)synthesisandassemblyofth545)

processinganddeliveryoftheT-DNA

T-DNA

leftandrightbordersimperfectdirect21-25bprepeatsVirD1andVirD2:T-DNAborderendonuclease;pilotprotein?nuclearlocalization,nuclearlocalizationsignal(nls)?(vird2)overdrive(24bpDNAsequence):anenhancer,stimulatesT-DNAtransfer,enhancest-dnacopynumberSSDNAVirE2:ssbprotein,nls,enhancestheefficincyoft-strandtransportintothenucleusVirC:Virc1andVirc2bindtooverdrive5)

processinganddelivery55twoconserveddomainsof13and5to7bpasfollows:TGGATATATTGNPuGTGTAAATNCCTTCOnlythese25bpdirectrepeatsattheendsoftheT-DNAarerequiredincisforitsmobilizationtotheplantcell.Becauseitstransferisunaffectedby(a)deletionsoftheinternalportionofnativeT-DNAsor(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.satchel,d.corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.thesefindingsformfhebasisofthedesignofmodifiedandsimplifiedt-dnamoleculesfhatareusefulasvectorstotransformplantcellswithcloneddnafragmentsofinterest(57,72,113).furthermore,deletionofthefirst6bporthelast10bpofthe25bpsequencesblockst-dnatransfer(101).twoconserveddomainsof13an56SSDNA由于這些基因不能直接在植物細胞中表達，因此就把這些基因的編碼區DNA插入某些植物基因的啟動子后面，編碼區后面則是來自植物基因的3'-端DNA順序，其中包括終止子序列。總稱冠癭堿（opine)。致病。Petitetal.在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經磷酸化由非活性態變為活化狀態，進而激活vir區其他基因表達。4um，分子質量為（90－150）×106Da。Vir基因表達調控的問題，知道VirA和VirG基因誘導其它Vir基因的表達，當VirD操縱元的被誘導表達后，其中的VirD1和VirD2蛋白質具有核酸內切酶的活性(Yanofsky

M．F.3)

inductionandinitiationofvirulencegenesAgropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4Nopaline:pTiC58,pTi1D135,pTi223Ti=TIPpre-infectionattachment在用農桿菌進行葡萄轉化試驗時，用抗氧化劑如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或二硫蘇糖醇處理可以提高轉化效率。Petitetal.anditstranscriptionincreasesinresponsetothepresenceof:2賦予根癌農桿菌分解代謝冠癭堿的能力；而單子葉植物需要加入外源酚類物質，才能激活Vir區的基因，達到轉基因的目的。Limitedinhostrange,genotype-dependentT-DNA單鏈

的5’端共價的結合著VirD2蛋白質，從而保護T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白質上含有核定位的序列，所以結合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白質象一個“導向儀”(pilot)指引并保護T-DNA進入植物細胞核中。T-DNAtransferapparatus?6)T-DNAintegration

integrationsites:random?hotspots(activelytranscribed)?homologybetweenplantjunctionsandT-DNAsequences?

Model:illegitimaterecombinationSSDNA6)T-DNAintegration57農桿菌介導法農桿菌介導法58農桿菌感染柳樹產生冠癭瘤農桿菌59原理：根癌農桿菌和發根農桿菌細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。原理：60

因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，借助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然后通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的61農桿菌介導法課件62農桿菌介導法課件63Story冠癭瘤病：雙子葉植物經常發生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形似帽狀而得名。1907年，Smith&Townsent

農桿菌誘發冠癭瘤病。1947年，Braunetal.

證實倆者的關系，但發現有的菌株不致病。提出了假說：tumour-inducingprinciple,TIP.腫瘤誘導因子。60’s,腫瘤組織中含高濃度的氨基酸（octopine,nopaline）

總稱冠癭堿（opine)

。Petitetal.證實腫瘤組織合成的冠癭堿取決于菌株，而且菌株能專一地利用冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實了TIP)Story64Agropine:pRi1855,pRi15834,pRiA4(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.生長素和細胞分裂素；4um，分子質量為（90－150）×106Da。d)

Theattachmentsitesarethoughttobespecificreceptors(2,000suchreceptorsoncarrotsuspensionculturecells)whereonlylivebacteriumbinds.Strains:AgrobacteriumStrainsandtheoriginsofAgrobacteriumstrains(seeattachedtable1and2)refernceplasmid1:238-253(1978)corbin,unpublishedresults)intranstothetiplasmidvirregion.近年來人們對農桿菌介導法機理作了深入研究，發現了酚類化合物在外源基因導入植物細胞的作用。5)

processinganddeliveryoftheT-DNA1986)，能夠在T-DN

A邊界重復序列的特異位點切開T-DNA單鏈，因此T-DNA往往以單鏈形式進入植物細胞。usugars(arabinose,glucose,xylose,mannose,galactose)T37(T37chromosome,pTi37)Ach5(Ach5chromosome,pTiAch5)誘導因子。可使T-DNA形成1個細長的核酸蛋白復合物（T-復合體），以此保護T-DNA不被包內外的核酸酶降解。證實倆者的關系，但發現有的菌株不農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。當外源基因插入后，重組質粒可在輔助質粒的幫助下從大腸桿菌轉移到根癌農桿菌。C58(C58chromosome,pTiC58)最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。1974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.

從致瘤農桿菌中分離出一類巨大的質粒

(tumorinducingplasmid)，稱為Ti質粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子雜交技術證實腫瘤細胞中存在外源的DNA,與Ti質粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色體的農桿菌質粒DNA片段，

T-DNA(transferredDNA),其內有致瘤和冠癭堿合成酶等基因。1981年，Oomsetal.發現Ti質粒上有致瘤區(virulenceregion)，Vir區。Agropine:pRi1855,pRi1565Ti質粒Ti質粒66Ti質粒是根癌農桿菌細胞核外存在的一種環狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.1－75.4um，分子質量為（90－150）×106Da。在溫度低亍28℃的條件下，Ti質粒可穩定地存在于根癌農桿菌細胞內。農桿菌介導法課件67Ti質粒除上述上述誘導受侵染的植物組織產生冠癭瘤外，還具有以下幾種重要功能：1賦予根癌農桿菌附著于植物細胞的能力；2賦予根癌農桿菌分解代謝冠癭堿的能力；3根癌農桿菌的寄主植物范圍；4決定所誘導的冠癭形態和冠癭堿的成分；5參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細胞分裂素的代謝活.Ti質粒除上述上述誘導受侵染的植物組織產生冠癭瘤外，還具有681)Ti質粒的結構來自于不同野生型根癌農桿菌的Ti質粒可根據其產生的冠癭堿類型分為三類：章魚堿(octopine)類胭脂堿(nopaline)類農桿堿（agropine）類。Ti質粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質粒上的冠癭堿分解基因產物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti質粒的結構69農桿菌介導法課件70長度：160-250kb6大功能區：1)致癌區，這個區主要合成植物生長素和細胞分裂素；2)冠癭堿合成區；3)冠癭堿分解區；4)Ti質粒接合轉移區(tra)；5)毒性區（Vir）；6)DNA復制區（Rep）。長度：160-250kb71T-DNAT-DNA72在致癌區和冠癭堿合成區的兩側存在著一個24bp直接重復序列，由這三部分所構成的DNA區域叫做T-DNA，插入植物染色體中的Ti質粒片段只有T-DNA。由于T-DNA插入植物細胞染色體中的位置不相同的，因此植物染色體上可能并沒有可供T-DNA插入的專一性DNA序列。在致癌區和冠癭堿合成區的兩側存在著一個24bp直接重復序列73脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp的重復序列,構成T-DNA的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(leftborder,LB)和右邊界(rightborder,RB).在某些章魚堿型根癌農根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA是以兩個分開的獨立片段形式存在，即T-DNA左邊區段和T-DNA右邊區段。研究表明，插入在T-DNA邊界序列之間的任何DNA都可被轉到植物染色體中。因此Ti質粒可用做外源目的基因的載體。脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp74T-DNA區域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達.Tms1、Tms2、Tmr這3個基因表達產物催化生成的植物生長素（Tms1、Tms2

）和細胞分裂素（Tmr

）,可調節植物細胞的生長和發育,它們的過量表達刺激植物細胞大量快速增長而形成冠癭.冠癭也是在冠癭堿胞內合并成分泌出來的,構成根癌農桿菌生長所須的碳源和氮源.T-DNA區域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組75在植物轉基因早期階段，由于農桿菌轉化系統即簡單又不需要很多儀器設備，就成為很多科學工作者首先研究的熱點。農桿菌介導法與其它方法比較，具有轉入的基因經常是單拷貝，因而表達水平高并可以轉入大的DNA片段（可達150kb）、不需貴重儀器等優點。可見T-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點的效率比右邊界序列低。(b)placementofclonedfragmentscarryingonlyT-DNAborderrepeats,eitheronaseparateplasmid(19,36)orontheAgrobacteriumchromosome(37;s.uphosphatestarvation證實倆者的關系，但發現有的菌株不6)T-DNAintegrationuacidicenvironment農桿菌介導法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。Limitedinhostrange,genotype-dependent脂堿型根癌農桿菌Ti質粒中T-DNA的左右兩側是一段24bp的重復序列,構成T-DNA的邊界序列(bordersequence),分別稱為左邊界(leftborder,LB)和右邊界(rightborder,RB).總稱冠癭堿（opine)。最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區，可接受環境中的信號分子。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉化效率更

高。Table1SummaryofvirGeneProducts3)

inductionandinitiationofvirulencegenesuphenols:acetosyringone(strongerinducer)生長素和細胞分裂素；由于這些基因不能直接在植物細胞中表達，因此就把這些基因的編碼區DNA插入某些植物基因的啟動子后面，編碼區后面則是來自植物基因的3'-端DNA順序，其中包括終止子序列。1947年，Braunetal.Ti質粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農桿菌中表