細胞培養1一原代培養（略）2二.傳代培養

準備及注意事項換液傳代凍存復蘇

MTT3換液

把細胞培養瓶從培養箱中拿出,擰緊蓋子;觀察瓶內培養基的顏色,是否渾濁等;放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。放入超凈工作臺內,點燃酒精燈,拿培養瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上,至少三秒.取下蓋子,燒瓶口;倒掉培養基,燒瓶口;拿出PBS液瓶子,燒瓶口和鑷子;用鑷子將塞子取出,燒瓶口（至少10圈）。56.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養瓶內。燒培養瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出培養基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取5ml-8ml的培養基打入培養瓶內，燒瓶口，鑷子和蓋子；9.蓋上蓋子，倒置顯微鏡下觀察，之后標明名稱和日期，酒精棉球擦瓶口和瓶身，放入培養箱內即可。注意：1.打開培養箱時盡量不要說話；2.步驟9中培養瓶放入培養箱時，應把蓋子擰開少許。6傳代1.把細胞培養瓶從培養箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀察瓶內培養基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內，點燃酒精燈，拿培養瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。76.用吸管吸取3ml的PBS，打入培養瓶內。燒培養瓶口，來回晃動PBS100次后到掉PBS。重復此操作一次。7.拿出胰酶瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培養瓶內，燒培養瓶口和蓋子，蓋上蓋子；9.拿出工作臺外，在倒置顯微鏡下觀察細胞，然后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養箱內；5分鐘后取出；8凍存1.把細胞培養瓶從培養箱中拿出，擰緊蓋子；2.觀察瓶內培養基的顏色，是否渾濁等；放在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況。3.放入超凈工作臺內，點燃酒精燈，拿培養瓶口在酒精燈火焰上轉兩圈以上，至少三秒。4.取下蓋子，燒瓶口；倒掉培養基，燒瓶口；5.拿出PBS瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。1011.拿到工作臺內，燒瓶口，取下蓋子，燒瓶口。用吸管吸出胰酶，燒瓶口。12.拿出培養基瓶子，燒瓶口和鑷子；用鑷子將塞子取出，燒瓶口（至少10圈）。13.用吸管吸取5ml的培養基打入培養瓶內，用吸管吹打成單個細胞懸液。14.用吸管將細胞懸液移至5ml離心管中，蓋上蓋子，在離心機內離心，1500轉/分鐘，時間為15分鐘。15.離心結束后，拿至工作臺內，燒離心管口。去掉塞子，燒管口。12復蘇

1.

取一敞口瓶，內裝蒸餾水，放入電熱恒溫水槽中，溫度設置為39.0℃。2.

等達到39.0℃30分鐘后，用鑷子將欲復蘇的細胞從液氮管中取出，快速放入敞口瓶內，晃動，使凍存管內完全液化。3.

用酒精擦拭凍存管，放入工作臺內。4.

用鑷子將封口膜夾掉，輕燒管口；5.

用吸管吸出凍存管內的細胞懸液，打入已裝有5ml新鮮培養基的培養瓶內。146.燒瓶口，鑷子和蓋子；蓋上蓋子，在倒置顯微鏡下觀察。7.用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培養箱內.注意：步驟2中，蒸餾水不要沒過凍存管口所有步驟結束過24小時后一定要換液；15MTT法1.實驗開始前，96孔板應在超凈臺紫外燈下照射2個小時以上。2.從培養箱中拿出培養瓶，觀察，加PBS，加胰酶消化，加培養基，計數。（方法及步驟同傳代1-13步。）3.加培養基，調整細胞濃度為10000個/200μl.4.加到96孔板內,每板6行8列共48孔,每孔200μl.5.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，標明名稱，序號和日期。166.用酒精棉球擦板，放入培養箱內，培養24小時。7.從培養箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內，用200μl的槍將孔內的培養基吸出；8.加入不同濃度的藥物的無血清培養基,每孔200μl。9.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，用酒精棉球擦板，放入培養箱內，培養24小時。10.從培養箱中取出，鏡下觀察，拿到工作臺內，每孔加MTT液20μl。1711.蓋上96孔板的蓋子，拿出工作臺，倒置顯微鏡下觀察，用酒精棉球擦板，放入培養箱內，培養4小時。12.取出96孔板，倒掉孔內的液體，每孔加

DMSO150μl，放入酶標儀內，振蕩600秒，讀數即可。注意：

本實驗以CHL細胞為例.加DMSO時，帶口罩和手套。放入酶標儀內時，96孔板勿蓋蓋子。多重復幾次。18PBS配制之后，加1000ml三蒸水,調節PH值在7.2-7.4之間,高壓121℃,30分鐘,4℃備用。名稱質量(單位:克)NaClKClNa2HPO4.12H2OKH2PO48.000.203.490.2020RPMI1640培養基的配制：取一小袋1640培養粉，加高壓過的三蒸水800ml，在1000ml的燒杯中用玻璃棒攪拌溶解；加碳酸氫鈉2.0g，再加三蒸水定容至1000ml；加青霉素(100U/ml)，鏈霉素（100μg/ml）；在超凈工作臺內過濾除菌，分裝成180ml，-20℃備用。注意燒杯要泡過酸，并在紫外線下照射至少30分鐘。21凍存液的配制

高壓過的二甲基亞砜DMSO，胎牛血清和無血清培養基按1:3:6的比例配制。例如配制10ml的凍存液：高壓的小瓶中加3ml過濾的胎牛血清，再加6ml培養基，最后加1ml的DMSO,混勻即可。23一般常用次強液。新配制的清潔液為棕紅色，多次使用后，成綠色時就不能再用,需重新配制。注意：保護自己；先將重鉻酸鉀完全溶解于水中（必要時可加熱幫助溶解），然后緩慢加入濃硫酸，以免產生熱量太多，使容器破裂。25噻唑藍MTT液配制方法稱取25mgMTT,加入5mlPBS液,混勻,即成5mg/ml的MTT液；用0.22μm的微孔濾器除菌,避光,4℃保存一周內使用.原理

活細胞的線粒體的乳酸脫氫酶可使MTT（黃綠色）分解，產生蘭紫色結晶狀甲贊顆粒，積淤細胞內和細胞周圍；其量與細胞數成正比，也與細胞活力成正比。注意MTT法只能測定細胞相對數和相對活力,不能測定細胞絕對數.26其它溶液的配制

95%到75%的酒精的配制比例為4:1，

例如,配制100ml75%的酒精,80ml95%酒精加20ml三蒸水即可。36%-38%的濃HCL到5%的稀HCL的配制比例為3:17，

例如,配制1000ml的5%的稀鹽酸,150ml的濃HCL加850ml的蒸餾水即可。27細胞計數方法吸出細胞懸液少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。靜置三分鐘鏡下觀察，計數板四大格細胞總數。公式為：細胞數/ml=四大格細胞總數/4×104個注意鏡下見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算;若細胞團數量占10%以上，重新制備細胞懸液。計數時，計左側和上方的壓線細胞，右側和下方的壓線細胞不應該計在本方格之內。28實驗用品的洗滌橡膠，塑料用品玻璃器皿30橡膠，塑料用品

用自來水沖洗后放入專用燒杯內,加入蒸餾水，使之淹沒物品稍許，放在電爐上加熱；等水開時開始記時，三十分鐘后取下，倒掉燒杯內的水，自來水沖洗3遍，蒸餾水沖洗2遍，放烤箱下層中烘干；烘干后浸泡在５％鹽酸中，至少30分鐘；將鹽酸倒掉，用