原料純化工藝培訓原料純化部簡介原料純化部由單抗、多抗、基因、合成4組組成其產品主要涉及DOA系列、HCG、ID系列等單克隆抗體基本概念制備流程純化方法檢驗方法制備難點制備流程純化方法鹽析（1020007301制備）凝膠過濾離子交換層析（1020002801制備）

辛酸沉淀法（1020000201制備）

原理

用中性鹽使蛋白質沉淀析出的方法為鹽析。硫酸銨是最常用的中性鹽特點成本低，步驟簡單。抗體的回收率比較高。抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,不適合于做各種標記。

工作示意圖特點成本高，步驟較簡單。抗體回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。抗體純度較高

原理利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結合力的差異進行物質分離工作示意圖步驟硫酸銨沉淀抗體，粗提；樣品過柱；洗去沒有結合的物質；用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液；紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品；匯集樣品，濃縮，測定濃度

特點成本較低，步驟較簡單。抗體回收率較高。抗體純度較高，電泳后可見少量雜帶，適合于各種標記。純化后抗體體積大，需要濃縮。需要冷柜，自動收集器。

步驟調節樣品pH值,加入正辛酸,攪拌30min室溫高速離心,收集上清液；再加入硫酸銨（40%飽和度）；4℃高速離心,棄上清；溶解沉淀，透析，測定濃度

特點成本較低，步驟較復雜。抗體回收率很低。抗體純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標記

檢驗方法Elisa:親合力、特異性蛋白印跡試驗WB(WestBlotting):抗體特異性、相應蛋白質抗原分析免疫組化：抗體特異性、相應抗原表位定位HPLC：樣品組分分析、純度鑒定制備難點

細胞株的構建及篩選：生物階段的不確定性。純化抗體的有效檢控指標概念多克隆抗體（polyclonalantibody）針對多種抗原決定簇的混合抗體，簡稱多抗制備流程基礎免疫：首次，抗原用量大，用佛式完 全佐劑加強免疫：抗原量減半，多次，間隔2-4 周，用佛式不完全佐劑測效價：加強免疫兩次或三次以后的第 7天取血，測效價制備血清：最后一次免疫后7-10天放血， 離心取血清（多抗）親和層析法原理將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復合物，然后改變條件，使抗原抗體復合物解離洗脫出純化的抗體步驟(1028004003制備)將ProteinA與活化的柱子相結合將腹水或血清處理后過柱用結合緩沖液洗柱子，直到A280值為零用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品匯集樣品，濃縮，測定濃度

特點成本高，步驟較簡單抗體回收率低抗體純度高，適合于各種標記純化后抗體體積大，需要濃縮

多抗特點

比單抗更容易捕捉抗原多抗特異性一般比單抗差，更易有交叉反應抗體的純化、標記比單抗難基因

基本概念制備流程純化方法常用測定方法概念基因體外重組即在離體條件下對DNA分子切割并將其與載體DNA分子連接，得到重組DNA。受體細胞通過轉化直接吸收來自供體細胞的DNA片段，并使它整合到自己的基因組中，從而獲得供體細胞部分遺傳性狀。基因上游流程圖純化流程菌體蛋白可溶蛋白不可溶蛋白超聲破碎洗IB，裂解細胞裂解液過柱純化洗脫有活性蛋白無活性蛋白樣品收集樣品收集(稀釋、透析)(復性)

備注包涵體存在于大腸桿菌細胞質中，采用的生物學技術導入的外源基因，在細菌中獲得外源蛋白的高效表達，造成相當多的蛋白質產物在細菌內凝集為沒有活性的固體顆粒。可溶性的蛋白質最終會分泌到周質空間，或分泌到培養液中。超聲機理：強聲波作用溶液時，氣泡產生，長大，和破碎的空化現象有關。空化現象引起的沖擊波和剪切力使細胞破碎純化方法大腸桿菌表達蛋白以可溶和不溶兩種形式存在，需要不同的純化策略蛋白質的性質方法電荷（等電點）離子交換（IEX）分子量凝膠過濾（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特異性結合親和（AC）常用測定方法280nm光吸收法Bradford檢測法Lowry法280nm光吸收法原理：蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比優點：快速，對蛋白無破壞缺點：不是嚴格定量，此法是根據酪氨酸，苯丙氨酸，和色氨酸殘基的強吸收值來測定的，不同的蛋白有不同的消光系數；核酸有強干擾作用Bradford檢測法原理：考馬氏亮蘭G-250，這種染料具有負電荷，可以與蛋白質分子上的正電荷結合后，產生蘭色化合物，反應化合物在465-595nm有最大光吸收值。優點：快速，靈敏度高，干擾物質少缺點：對各種純化蛋白反應不同；對蛋白質引起不可逆的反應Lowry法原理：又稱Folin-酚試劑法。首先在堿性溶液中形成銅-蛋白復合物，然后這一復合物還原磷鉬酸-磷鎢酸，產生鉬藍-鎢藍復合物的深蘭色，反應化合物在655nm有最大光吸收值。優點：一種可靠的蛋白質定量方法。缺點：干擾物質多，有些試劑不穩定，蛋白不可逆變性合成抗原基本概念半抗原與載體的連接影響因素常用測定方法基本概念半抗原是指本身無免疫原性，只具有反應原性的物質半抗原不能直接用作免疫原，只有把這些半抗原和大分子物質結合后，才具有免疫原性。這種經過人工修飾的半抗原稱之為人工抗原半抗原與載體載體用于偶聯半抗原的大分子物質稱為載體常用的載體蛋白質類多肽聚合物大分子聚合物蛋白質類蛋白質是一類結構復雜的膠體兩性化合物，是一種常用的良好載體。常用為載體的免疫原性蛋白質有牛血清蛋白（BSA）、牛血清丙種球蛋白（BGG）、鑰孔嘁血藍蛋白（KLH）等半抗原與載體的連接物理方法：借電荷、微孔吸附半抗原化學方法：含有-COOH、-NH2或-SH

不含-COOH、-NH2或-SH含有-COOH、-NH2或-SH利用偶聯劑通過功能基團（-COOH、-NH2或-SH等）直接把半抗原連接到載體上偶聯方法碳二亞胺法

活潑酯法

重氮化法戊二醛法混和酸酐法過碘酸氧化法等等碳二亞胺法碳化二亞胺含有N=C=N結構的官能團，是一種化學性質非常活躍的雙功能試劑DCCDCC(N,N‘-dicyclohexylcarbodiimide）DCC特點反應可以在多數溶劑中進行，反應速度較快，而且可以通過適當的控制方法，抑制副反應的發生。價格相對較便宜副產物N,N'-二環己基脲(DCU)混在連接產物中而很難完全除盡，不能得到高純度的產品

EDCEDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidehydrochloride)EDC特點EDC是水溶性的，因此其介導的縮合反應可以在水溶液中進行，不需要加入有機溶劑。使用高純度的、結晶EDC可以獲得高純度的活性中間體

中間體在水溶液中不穩定，并易于水解由于碳二亞胺的縮合反應沒有選擇性；易形成蛋白分子間的自身聚合，產生非均一性產物活潑酯法含有羧基的半抗原碳二亞胺的作用下，與N—羥基琥珀酰亞胺反應，生成活潑酯衍生物，后者與載體蛋白上的氨基反應，形成以酰胺鍵連接的偶聯物特點本法是對碳二亞胺法的改進：由于避免了碳二亞胺對蛋白的直接作用，從而避免了蛋白分子間的交聯。EDC介導的縮合反應在NHS的存在下，效率大大提高屬于一種中性連接，過量的試劑及縮合副產物可以很容易地用水或稀酸洗去。不含-COOH、-NH2或-SH半抗原經過改造后，引入功能基團再用上述方法進行連接以1020001702制備為例（琥珀酸酐法）琥珀酸酐法本法用于帶有羥基的半抗原的改造將帶有羥基的半抗原和琥珀酸酐反應，即可得到帶有羧基的半抗原琥珀酸的衍生物將嗎啡與BSA蛋白質連接。因嗎啡結構中只有-OH而無-NH2及-C