第四章植物組織與細胞培養4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養1第四章植物組織與細胞培養4.1植物組織培養與細胞培養的4.1植物組織培養與細胞培養的區別植物組織培養：指取出機體內組織與細胞，模擬機體內生理條件，使之在體外生長成組織或完整植株。植物細胞培養：植物細胞在體外條件下的存活或生長，不再形成組織，以生產次生代謝產物為目的。意義：能夠有效地保持優良品種的特性；生產無病毒種苗，快速繁殖新品種；生成藥物成分如紫杉醇等24.1植物組織培養與細胞培養的區別意義：能夠有效地保持優良4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養34.1植物組織培養與細胞培養的區別34.2發展歷史和研究意義：4.2.1發展歷史：自學4.2.2研究意義：具有重要的經濟意義44.2發展歷史和研究意義：4.2.1發展歷史：自學44.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養54.1植物組織培養與細胞培養的區別54.3植物組織與器官培養4.3.1植物組織培養的定義：在無菌條件下，將離體的植物器官，組織，細胞，胚胎，原生質體等在人工培養的條件下，誘發產生愈傷組織，潛在芽或者長成新的完整植物的一門實驗技術，又稱為“試管植物”。64.3植物組織與器官培養4.3.1植物組織培養的定義：4.3.2幾個重要概念全能性細胞：是能夠表達生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內任何一種類型的細胞，進而發育為一個完全相同的生物體。外植體：用來進行離體無菌培養的離體材料。愈傷組織：外植體在離體培養條件下，細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定型的疏散排列的薄壁細胞（具有未分化細胞的特性）。胚狀體：由愈傷組織細胞誘導分化出具有胚芽，胚根和胚軸的胚狀結構。不定芽：愈傷組織中的細胞發生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽和根。74.3.2幾個重要概念全能性細胞：是能夠表達生物體基因組的4.3.3植物組織培養的基本步驟培養材料的采集培養材料的消毒制備外植體愈傷組織形成根和芽的誘導組培苗的練苗移栽基本步驟84.3.3植物組織培養的基本步驟培養材料的采集基本步驟8試管植物的兩個核心步驟：一是愈傷組織的形成，二是愈傷組織的分化愈傷組織的形成愈傷組織的分化9試管植物的兩個核心步驟：一是愈傷組織的形成，二是愈傷組織的分1）培養材料的采集：可以取受精卵，發育中的分生組織（根尖，莖尖），雌雄配子等。最常用的培養材料是莖尖，通常切塊0.5cm以下，如果是培養無病毒苗，其長度在0.1mm以下。101）培養材料的采集：可以取受精卵，發育中的分生組織（根尖，外植體（培養材料）選擇的原則必須含有活細胞。幼嫩組織所含活躍分裂的細胞比例高。母株必須健康并且無任何腐爛或生病的跡象。母株必須活躍生長并且不會立即進入休眠。

總的原則：健康無病的年幼組織。11外植體（培養材料）選擇的原則必須含有活細胞。總的原則：健康無2）培養材料的消毒材料自來水和蒸餾水沖洗酒精中浸泡30-60秒0.01%升汞（HgCl2)消毒10分鐘無菌水沖洗3遍122）培養材料的消毒材料自來水和蒸餾水沖洗酒精中浸泡30-603）制備外植體在無菌條件下將材料切成0.2-0.5cm厚的小片，剝去芽的鱗片，嫩枝的外皮或種皮胚乳。133）制備外植體在無菌條件下將材料切成0.2-0.5c4）接種和培養（愈傷組織的形成，生長和分化）接種：無菌環境下，外植體接種在培養基上，每瓶接種4-10個。144）接種和培養（愈傷組織的形成，生長和分化）接種：無菌環境培養基的主要成分：水無機成分：無機大量元素氮：銨鹽、硝酸鹽混合磷：磷酸鹽鉀：鉀鹽鈣、硫、鎂無機微量元素主要有：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯有機成分（碳源）：糖、維生素、肌醇、氨基酸及有機附加物。植物生長調節物質：生長素類：NAA、IAA、IBA、2,4-D細胞分裂素類：BAP,KT，TDz，ZTpH值（5.8）瓊脂15培養基的主要成分：15封口：接種后，瓶，管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口溫度（25度），pH（5-6）和氧氣（5%）增殖：在新梢（愈傷組織）等形成后，分株或切段轉入增殖培養基中繼代培養。16封口：接種后，瓶，管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口5）愈傷組織的生成成熟細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定型的疏散排列的薄壁細胞---愈傷組織。植物愈傷組織的芽和根的分化由生長素和細胞分裂素的濃度及比例決定的。當生長素濃度大于細胞分裂素濃度時，愈傷組織分化根，反之則形成芽。175）愈傷組織的生成成熟細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定6）組培苗的練苗移栽試管苗進入自然環境前必須進行練苗。將培養容器打開，自然光照3天，取出小苗后用自來水沖洗干凈；再移栽到準備好的基質中。186）組培苗的練苗移栽試管苗進入自然環境前必須進行練苗。184.3.4愈傷組織的形成過程在接種和培養的過程中涉及到愈傷組織的形成，生長和分化。愈傷組織形成一般要經過三個步驟：194.3.4愈傷組織的形成過程在接種和培養1）啟動期：指成熟細胞或原生質準備分裂和脫分化的時期，需要合適的誘導劑：NAA，IAA等。2）分裂期：外植體細胞經過誘導以后脫分化，外層細胞，不斷分裂、增生子細胞的過程。3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，細胞內開始出現一系列形態和生理上的變化，從而使愈傷組織內產生不同形態和功能的細胞。分化出形態和功能不同的細胞，分生細胞、色素細胞、纖維細胞等。201）啟動期：指成熟細胞或原生質準備分裂和脫分化的時期，需要合愈傷組織要求：松散性好、增殖快、再生能力強。外觀一般為鮮艷的乳白或淡黃色，呈小顆粒狀，疏松易碎。21愈傷組織要求：松散性好、增殖快、再生能力強。外觀一般為鮮艷誘導愈傷組織形成的條件：植物生長調節劑是誘導愈傷組織形成的極為重要的因素：包括生長素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂素（KT，6-BA，ZT）：生長素使用濃度一般在0.01-10mg/L，分裂素使用濃度一般在0.1-10mg/L其他一些條件：植物生長力、來源、培養基的種類、培養條件等。22誘導愈傷組織形成的條件：植物生長調節劑是誘導愈傷組織形成的極幼苗莖尖消毒處理接種培養形成愈傷組織MS+（1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA繼代培養生芽培養MS+（2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培養MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+（2-5mg/L)PP333基質：河砂∶珍珠巖（1∶1）

煉苗煉苗移植蘆薈的愈傷組織培養23幼苗莖尖消毒處理接種培養形成愈傷組織MS+（1-6mg/L)4.3.5植物器官培養定義：指將植株上的各種器官從母體上分離出來，放在無菌的人工環境讓其進一步發育，最終長成幼苗的過程。植物器官主要包括：毛狀根，芽，體細胞胚等植物器官培養技術與植物組織培養技術基本一致。244.3.5植物器官培養定義：指將植株上的各種器官從母體上分4.3.6植物組織培養的應用：1.無性繁殖系快速繁殖2.獲得無病毒植株3.新品種育種4.在遺傳、生理、生化和病理研究上的應用5.種質資源保存與創新6.產業化生產：花卉，果蔬脫毒254.3.6植物組織培養的應用：1.無性繁殖系快速繁殖254.3.7人工種子

在一定條件下，愈傷組織細胞誘導分化出具有胚芽，胚根和胚軸的胚狀結構—胚狀體定義:即最外面包裹一層有機薄膜的植物胚狀體優勢：便于運輸和儲藏；提高生產效率；保存珍貴品種264.3.7人工種子在一定條件下，愈傷組織細胞誘導分化人工種子外層：固定化膜（有機薄膜），保護胚狀體水分，防止外部力量沖擊中間：營養成分和植物激素內層：包裹的胚狀體或芽27人工種子外層：固定化膜（有機薄膜），保護胚狀體水分，防止外部4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養284.1植物組織培養與細胞培養的區別284.4植物細胞的培養：4.4.1植物細胞培養定義定義：指在離體條件下，將愈傷組織或其它容易分散的組織置于培養基中進行培養，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一門技術。目的是獲得初級和次級代謝產物。可通過改變培養基成分及其濃度，生長調節劑的選擇等手段來實現代謝產物的誘導。294.4植物細胞的培養：4.4.1植物細胞培養定義294.4.2植物細胞培養的方法根據培養對象：主要有：單細胞培養，單倍體培養（花藥雄性生殖細胞），原生質根據培養系統：主要有：固體培養和液體培養。304.4.2植物細胞培養的方法根據培養對象：304.4.3植物細胞培養的培養基基礎培養基有：MS，B5，N6。主要有無機鹽，碳源，有機氮源，有機酸等構成。常用的培養基的組成：MS+植物生長激素+椰子汁314.4.3植物細胞培養的培養基基礎培養基有：314.4.4植物單細胞培養單細胞培養目的主要是觀察培養的細胞個體是如何進行分裂，分化，生長及發育，同時也為大規模培養奠定基礎。單細胞培養的過程中往往也涉及愈傷組織的形成.324.4.4植物單細胞培養單細胞培養目的主要是觀察培養的細胞4.4.4.1單細胞制備方法：機械法：機械磨碎；效率低酶解法：消化植物細胞壁的專一性水解酶如：纖維素酶，效率高來源于愈傷組織334.4.4.1單細胞制備方法：機械法：機械磨碎；效率低334.4.4.2單細胞培養平板培養看護培養微室培養雙層濾紙培養懸浮培養適宜于得到的細胞數目少，細胞比較珍貴的情況下使用344.4.4.2單細胞培養平板培養適宜于得到的細胞數目少，1)細胞平板培養平板培養（platingculture)是指將一定密度的懸浮細胞接種到或混合到一薄層固體培養基中培養的技術,類似于微生物細胞的平板培養。細胞的分離及密度的調整：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞，要選擇合適的過濾網篩。細胞密度一般控制在1000-1×105/ml351)細胞平板培養平板培養（platingculture)板的制備和細胞的培養：35℃的固體培養基（1.4%瓊脂）均勻的平鋪于培養皿中，厚度5mm左右。接種和培養：

26℃置暗處培養21天。低倍顯微鏡觀察，記數單細胞或小細胞團，計算置板效率（也稱植板率）。植板率:已形成細胞團的百分數（即每100個鋪在平板上的細胞中有多少個能長出細胞團）36板的制備和細胞的培養：35℃的固體培養基（1.4%瓊脂）均固體平板培養圖示：優點:可以定點觀察分離細胞容易缺點:培養細胞氣體交換不暢，濕度不夠。37固體平板培養圖示：372）看護培養和飼養層培養I看護培養（nurseculture）Muir等1953年設計。是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續分裂和增殖。382）看護培養和飼養層培養I看護培養（nursecultu定義:指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。基本技術:（1）在一個培養瓶中加入一定量厚的固體培養基，滅菌后備用。（2）在無菌條件下，將一小塊活躍生長的愈傷組織接種到培養基上，再在愈傷組織塊上放一片已滅菌的濾紙，放置一晚上。（3）將分離的單細胞接種到培養基的濾紙上。（4）恒溫培養1-3月。39定義:指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長優點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

（1）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。看護培養特點：40優點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

II飼養層培養：飼養層培養是用處理過的（X射線處理）無活性的或分裂很慢，不具備分裂能力的細胞來飼養所養的靶細胞(要培養的細胞）。紅色的細胞為飼養層細胞；藍色的為靶細胞41II飼養層培養：飼養層培養是用處理過的（X射線處理）無活性3）雙層濾紙培養

在飼養層和靶細胞層之間放兩張濾紙,上面一層濾紙用于將靶細胞轉移到其他培養基上繼續培養.423）雙層濾紙培養

在飼養層和靶細胞層之間放兩張濾4）微室培養定義:將單細胞培養在少量的培養基中培養。434）微室培養定義:將單細胞培養在少量的培養基中培養。43優點：

（1）在培養過程中，可以連續進行顯微觀察一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程.

缺點：

（1）培養時間較短.

（2）操作麻煩。44優點：

（1）在培養過程中，可以連續進行顯微觀察一個細5)懸浮培養將一定密度的懸浮細胞接種于液體培養基中,在保持良好的分散狀態下培養.適宜于消化得到的細胞數充足的情況下使用。懸浮培養455)懸浮培養將一定密度的懸浮細胞接種于液體培養基中,在保持4.4.4.3細胞的同步化細胞同步化：指同一培養體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。有饑餓法，抑制法和冷處理法等。464.4.4.3細胞的同步化細胞同步化：指同一培養體系的所可以通過饑餓法獲得G1或G2期同步化細胞。47可以通過饑餓法獲得G1或G2期同步化細胞。4748484949有絲分裂抑制法:在指數生長期的細胞懸浮培養物加入一定濃度的有絲分裂抑制劑如秋水仙素4-6小時，作用不可逆的。50有絲分裂抑制法:在指數生長期的細胞懸浮培養物加入一定濃度的4.4.4.4植物細胞的保存繼代培養保存法低溫保存法：5-10度冰凍保存法：-20度或液氮中514.4.4.4植物細胞的保存繼代培養保存法514.5原生質體培養原生質體的相關的概念和研究意義原生質體的分離原生質體培養524.5原生質體培養原生質體的相關的概念和研究意義524.5.1關于原生質體的幾個重要概念原生質體(protoplast):指除去細胞壁的細胞或是說一個被質膜所包圍的裸露細胞。亞原生質體（subprotoplast）：在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成一些較小的原生質體就叫做亞原生質體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。534.5.1關于原生質體的幾個重要概念原生質體(protop4.5.2原生質體研究意義研究組織和器官發育機制；可以進行有關遺傳操作；研究植物細胞的生理功能；誘導融合形成雜種細胞。544.5.2原生質體研究意義研究組織和器官發育機制；544.5.3原生質體的制備原材料準備預處理與酶解原生質體收集與純化原生質體活力檢測554.5.3原生質體的制備原材料準備預處理與酶解原生質體收集4.5.3.1用于分離原生質體的材料來源兩個來源：各種組織的葉片，根尖等愈傷組織564.5.3.1用于分離原生質體的材料來源兩個來源：各4.5.3.2酶消化取材消毒取植物組織，消毒后去掉表皮，剪碎；酶消化然后在25-28度水浴酶解60-90分鐘。使用的酶：果膠酶，纖維素酶等574.5.3.2酶消化取材消毒574.5.3.3收集和純化原生質體

酶解結束后,要將原生質與碎片和酶液分離，然后經洗滌后再進行培養.過濾-離心法：先過濾后低速離心沉淀漂浮法：利用原生質體比重小，能在25%的蔗糖溶液中漂浮沉降法和漂浮法結合.先離心收集沉淀，在用21%蔗糖漂浮離心584.5.3.3收集和純化原生質體

酶解結束后,4.5.3.4原生質體鑒定及活力檢測鑒定：低滲脹破法和熒光染色法594.5.3.4原生質體鑒定及活力檢測鑒定：低滲脹破法和熒光熒光染色法：在活細胞內，FDA（二乙酸熒光素）被酯酶裂解即發熒光（熒光素）

活力測定60熒光染色法：在活細胞內，FDA（二乙酸熒光素）被酯酶影響原生質體活力的因素

分離材料的生理狀態酶解條件：酶質量、濃度、酶解溫度、酶解時間、酶溶液的滲透壓分離條件：高心次數、離心速度、純化方法、分離持續時間環境條件：操作環境的溫度、分離用具的影響61影響原生質體活力的因素分離材料的生理狀態61液體淺層培養；固液雙層培養，固體平板培養，瓊脂糖珠培養，看護培養，飼養層培養。4.5.4原生質體培養62液體淺層培養；固液雙層培養，固體平板培養，瓊脂糖珠培養，看護4.5.5愈傷組織形成與植株再生細胞分裂與細胞壁再生在短時間內細胞壁和葉綠體開始生成；細胞開始分裂。愈傷組織形成愈傷組織分化根據需要可進行植株再生或細胞的大規模培養634.5.5愈傷組織形成與植株再生細胞分裂與細胞壁再生634.5植物細胞和組織的大規模培養植物中含有數量極為可觀的次代謝物質。這些次級代謝產物對人類有巨大的利用價值，如紫草細胞中的紫草寧可用于治療創傷，燒傷；人參是治療與保健的名貴藥材。依靠傳統從植物中分離提取已很難滿足需求，工業化生產植物產品是一條有效的途徑。644.5植物細胞和組織的大規模培養植物中含有植物細胞培養和從完整的植物生產紫草寧的比較生產方式收獲時間紫草寧濃度（%干重）完整植物2-3y1-2植物細胞培養21d1465植物細胞培養和從完整的植物生產紫草寧的比較生產方式收獲時間紫4.5.1植物細胞大規模培養的特點植物細胞的特點（與微生物比較）：體積大以細胞團的形式存在對剪切力敏感生長慢，周期長對營養要求高培養過程中容易產生泡沫664.5.1植物細胞大規模培養的特點植物細胞的特點（4.5.2培養植物細胞的生物反應器要取得植物細胞大規模培養的成功，生物反應器是其關鍵因素：生物反應器的設計與選擇：性能要好；生產效率要高；價格要便宜。674.5.2培養植物細胞的生物反應器要取得植物細胞大規模培養4.5.2.1生物反應器培養方式：分批培養：一次性添加培養液和細胞半連續培養：每隔一段時間加培養液和收集培養物連續培養：連續加培養液和收集培養物。684.5.2.1生物反應器培養方式：分批培養：一次性添加培養4.5.2.2植物細胞大規模培養方式：機械攪拌懸浮培養非機械攪拌填充床反應器固定化細胞培養流化床反應器

694.5.2.2植物細胞大規模培養方式：1）攪拌式生物反應器特點：剪切力大；但混合效果好701）攪拌式生物反應器特點：剪切力大；但混合效果好702）非攪拌式生物反應器（依靠氣流使細胞流動）特點：產生剪切力小；高密度培養時提高通氣量容易產生大量氣泡712）非攪拌式生物反應器（依靠氣流使細胞流動）特點：3）細胞固定化大規模培養：細胞的固定化：指將游離的細胞包埋或固體的支持物中，培養液呈流動狀態進行無菌培養的一門技術。固定化細胞的制作：海藻酸鹽固定化；卡拉膠固定化；瓊脂糖固定化723）細胞固定化大規模培養：72流化床生物反應器：特點：包埋細胞的顆粒小，傳質效率高，適宜體外分泌產物的細胞培養。73流化床生物反應器：734.5.3影響植物次級代謝產物的因素生物條件（如外植體，季節等）物理條件：溫度，光照，通氣等化學條件：培養基的種類和植物調劑素的種類和比率等工業培養條件：攪拌和培養方法744.5.3影響植物次級代謝產物的因素生物條件（如外植體，季第四章植物組織與細胞培養4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養75第四章植物組織與細胞培養4.1植物組織培養與細胞培養的4.1植物組織培養與細胞培養的區別植物組織培養：指取出機體內組織與細胞，模擬機體內生理條件，使之在體外生長成組織或完整植株。植物細胞培養：植物細胞在體外條件下的存活或生長，不再形成組織，以生產次生代謝產物為目的。意義：能夠有效地保持優良品種的特性；生產無病毒種苗，快速繁殖新品種；生成藥物成分如紫杉醇等764.1植物組織培養與細胞培養的區別意義：能夠有效地保持優良4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養774.1植物組織培養與細胞培養的區別34.2發展歷史和研究意義：4.2.1發展歷史：自學4.2.2研究意義：具有重要的經濟意義784.2發展歷史和研究意義：4.2.1發展歷史：自學44.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養794.1植物組織培養與細胞培養的區別54.3植物組織與器官培養4.3.1植物組織培養的定義：在無菌條件下，將離體的植物器官，組織，細胞，胚胎，原生質體等在人工培養的條件下，誘發產生愈傷組織，潛在芽或者長成新的完整植物的一門實驗技術，又稱為“試管植物”。804.3植物組織與器官培養4.3.1植物組織培養的定義：4.3.2幾個重要概念全能性細胞：是能夠表達生物體基因組的任何一種基因，并能分化出該生物體內任何一種類型的細胞，進而發育為一個完全相同的生物體。外植體：用來進行離體無菌培養的離體材料。愈傷組織：外植體在離體培養條件下，細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定型的疏散排列的薄壁細胞（具有未分化細胞的特性）。胚狀體：由愈傷組織細胞誘導分化出具有胚芽，胚根和胚軸的胚狀結構。不定芽：愈傷組織中的細胞發生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽和根。814.3.2幾個重要概念全能性細胞：是能夠表達生物體基因組的4.3.3植物組織培養的基本步驟培養材料的采集培養材料的消毒制備外植體愈傷組織形成根和芽的誘導組培苗的練苗移栽基本步驟824.3.3植物組織培養的基本步驟培養材料的采集基本步驟8試管植物的兩個核心步驟：一是愈傷組織的形成，二是愈傷組織的分化愈傷組織的形成愈傷組織的分化83試管植物的兩個核心步驟：一是愈傷組織的形成，二是愈傷組織的分1）培養材料的采集：可以取受精卵，發育中的分生組織（根尖，莖尖），雌雄配子等。最常用的培養材料是莖尖，通常切塊0.5cm以下，如果是培養無病毒苗，其長度在0.1mm以下。841）培養材料的采集：可以取受精卵，發育中的分生組織（根尖，外植體（培養材料）選擇的原則必須含有活細胞。幼嫩組織所含活躍分裂的細胞比例高。母株必須健康并且無任何腐爛或生病的跡象。母株必須活躍生長并且不會立即進入休眠。

總的原則：健康無病的年幼組織。85外植體（培養材料）選擇的原則必須含有活細胞。總的原則：健康無2）培養材料的消毒材料自來水和蒸餾水沖洗酒精中浸泡30-60秒0.01%升汞（HgCl2)消毒10分鐘無菌水沖洗3遍862）培養材料的消毒材料自來水和蒸餾水沖洗酒精中浸泡30-603）制備外植體在無菌條件下將材料切成0.2-0.5cm厚的小片，剝去芽的鱗片，嫩枝的外皮或種皮胚乳。873）制備外植體在無菌條件下將材料切成0.2-0.5c4）接種和培養（愈傷組織的形成，生長和分化）接種：無菌環境下，外植體接種在培養基上，每瓶接種4-10個。884）接種和培養（愈傷組織的形成，生長和分化）接種：無菌環境培養基的主要成分：水無機成分：無機大量元素氮：銨鹽、硝酸鹽混合磷：磷酸鹽鉀：鉀鹽鈣、硫、鎂無機微量元素主要有：鐵、硼、錳、鋅、銅、鉬、鈷、氯有機成分（碳源）：糖、維生素、肌醇、氨基酸及有機附加物。植物生長調節物質：生長素類：NAA、IAA、IBA、2,4-D細胞分裂素類：BAP,KT，TDz，ZTpH值（5.8）瓊脂89培養基的主要成分：15封口：接種后，瓶，管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口溫度（25度），pH（5-6）和氧氣（5%）增殖：在新梢（愈傷組織）等形成后，分株或切段轉入增殖培養基中繼代培養。90封口：接種后，瓶，管用無菌藥棉或蓋封口，培養皿用無菌膠帶封口5）愈傷組織的生成成熟細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定型的疏散排列的薄壁細胞---愈傷組織。植物愈傷組織的芽和根的分化由生長素和細胞分裂素的濃度及比例決定的。當生長素濃度大于細胞分裂素濃度時，愈傷組織分化根，反之則形成芽。915）愈傷組織的生成成熟細胞經脫分化等一系列過程，產生一團不定6）組培苗的練苗移栽試管苗進入自然環境前必須進行練苗。將培養容器打開，自然光照3天，取出小苗后用自來水沖洗干凈；再移栽到準備好的基質中。926）組培苗的練苗移栽試管苗進入自然環境前必須進行練苗。184.3.4愈傷組織的形成過程在接種和培養的過程中涉及到愈傷組織的形成，生長和分化。愈傷組織形成一般要經過三個步驟：934.3.4愈傷組織的形成過程在接種和培養1）啟動期：指成熟細胞或原生質準備分裂和脫分化的時期，需要合適的誘導劑：NAA，IAA等。2）分裂期：外植體細胞經過誘導以后脫分化，外層細胞，不斷分裂、增生子細胞的過程。3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，細胞內開始出現一系列形態和生理上的變化，從而使愈傷組織內產生不同形態和功能的細胞。分化出形態和功能不同的細胞，分生細胞、色素細胞、纖維細胞等。941）啟動期：指成熟細胞或原生質準備分裂和脫分化的時期，需要合愈傷組織要求：松散性好、增殖快、再生能力強。外觀一般為鮮艷的乳白或淡黃色，呈小顆粒狀，疏松易碎。95愈傷組織要求：松散性好、增殖快、再生能力強。外觀一般為鮮艷誘導愈傷組織形成的條件：植物生長調節劑是誘導愈傷組織形成的極為重要的因素：包括生長素（NAA，IAA，2，4-D）和分裂素（KT，6-BA，ZT）：生長素使用濃度一般在0.01-10mg/L，分裂素使用濃度一般在0.1-10mg/L其他一些條件：植物生長力、來源、培養基的種類、培養條件等。96誘導愈傷組織形成的條件：植物生長調節劑是誘導愈傷組織形成的極幼苗莖尖消毒處理接種培養形成愈傷組織MS+（1-6mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA繼代培養生芽培養MS+（2-4mg/L)BA+(0.1-0.5mg/L)NAA生根培養MS+(0.1-0.5mg/L)IBA+（2-5mg/L)PP333基質：河砂∶珍珠巖（1∶1）

煉苗煉苗移植蘆薈的愈傷組織培養97幼苗莖尖消毒處理接種培養形成愈傷組織MS+（1-6mg/L)4.3.5植物器官培養定義：指將植株上的各種器官從母體上分離出來，放在無菌的人工環境讓其進一步發育，最終長成幼苗的過程。植物器官主要包括：毛狀根，芽，體細胞胚等植物器官培養技術與植物組織培養技術基本一致。984.3.5植物器官培養定義：指將植株上的各種器官從母體上分4.3.6植物組織培養的應用：1.無性繁殖系快速繁殖2.獲得無病毒植株3.新品種育種4.在遺傳、生理、生化和病理研究上的應用5.種質資源保存與創新6.產業化生產：花卉，果蔬脫毒994.3.6植物組織培養的應用：1.無性繁殖系快速繁殖254.3.7人工種子

在一定條件下，愈傷組織細胞誘導分化出具有胚芽，胚根和胚軸的胚狀結構—胚狀體定義:即最外面包裹一層有機薄膜的植物胚狀體優勢：便于運輸和儲藏；提高生產效率；保存珍貴品種1004.3.7人工種子在一定條件下，愈傷組織細胞誘導分化人工種子外層：固定化膜（有機薄膜），保護胚狀體水分，防止外部力量沖擊中間：營養成分和植物激素內層：包裹的胚狀體或芽101人工種子外層：固定化膜（有機薄膜），保護胚狀體水分，防止外部4.1植物組織培養與細胞培養的區別4.2發展歷史4.3植物組織與器官培養4.4植物細胞培養4.5植物原生質培養1024.1植物組織培養與細胞培養的區別284.4植物細胞的培養：4.4.1植物細胞培養定義定義：指在離體條件下，將愈傷組織或其它容易分散的組織置于培養基中進行培養，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一門技術。目的是獲得初級和次級代謝產物。可通過改變培養基成分及其濃度，生長調節劑的選擇等手段來實現代謝產物的誘導。1034.4植物細胞的培養：4.4.1植物細胞培養定義294.4.2植物細胞培養的方法根據培養對象：主要有：單細胞培養，單倍體培養（花藥雄性生殖細胞），原生質根據培養系統：主要有：固體培養和液體培養。1044.4.2植物細胞培養的方法根據培養對象：304.4.3植物細胞培養的培養基基礎培養基有：MS，B5，N6。主要有無機鹽，碳源，有機氮源，有機酸等構成。常用的培養基的組成：MS+植物生長激素+椰子汁1054.4.3植物細胞培養的培養基基礎培養基有：314.4.4植物單細胞培養單細胞培養目的主要是觀察培養的細胞個體是如何進行分裂，分化，生長及發育，同時也為大規模培養奠定基礎。單細胞培養的過程中往往也涉及愈傷組織的形成.1064.4.4植物單細胞培養單細胞培養目的主要是觀察培養的細胞4.4.4.1單細胞制備方法：機械法：機械磨碎；效率低酶解法：消化植物細胞壁的專一性水解酶如：纖維素酶，效率高來源于愈傷組織1074.4.4.1單細胞制備方法：機械法：機械磨碎；效率低334.4.4.2單細胞培養平板培養看護培養微室培養雙層濾紙培養懸浮培養適宜于得到的細胞數目少，細胞比較珍貴的情況下使用1084.4.4.2單細胞培養平板培養適宜于得到的細胞數目少，1)細胞平板培養平板培養（platingculture)是指將一定密度的懸浮細胞接種到或混合到一薄層固體培養基中培養的技術,類似于微生物細胞的平板培養。細胞的分離及密度的調整：一般采用酶分離法，小細胞團不能超過6個細胞，要選擇合適的過濾網篩。細胞密度一般控制在1000-1×105/ml1091)細胞平板培養平板培養（platingculture)板的制備和細胞的培養：35℃的固體培養基（1.4%瓊脂）均勻的平鋪于培養皿中，厚度5mm左右。接種和培養：

26℃置暗處培養21天。低倍顯微鏡觀察，記數單細胞或小細胞團，計算置板效率（也稱植板率）。植板率:已形成細胞團的百分數（即每100個鋪在平板上的細胞中有多少個能長出細胞團）110板的制備和細胞的培養：35℃的固體培養基（1.4%瓊脂）均固體平板培養圖示：優點:可以定點觀察分離細胞容易缺點:培養細胞氣體交換不暢，濕度不夠。111固體平板培養圖示：372）看護培養和飼養層培養I看護培養（nurseculture）Muir等1953年設計。是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續分裂和增殖。1122）看護培養和飼養層培養I看護培養（nursecultu定義:指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長和增殖的方法。基本技術:（1）在一個培養瓶中加入一定量厚的固體培養基，滅菌后備用。（2）在無菌條件下，將一小塊活躍生長的愈傷組織接種到培養基上，再在愈傷組織塊上放一片已滅菌的濾紙，放置一晚上。（3）將分離的單細胞接種到培養基的濾紙上。（4）恒溫培養1-3月。113定義:指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，并使其生長優點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

（1）不能在顯微鏡下直接觀察細胞的生長過程。看護培養特點：114優點：

（1）簡便易行。

（2）效果好，易于成功。

缺點：

II飼養層培養：飼養層培養是用處理過的（X射線處理）無活性的或分裂很慢，不具備分裂能力的細胞來飼養所養的靶細胞(要培養的細胞）。紅色的細胞為飼養層細胞；藍色的為靶細胞115II飼養層培養：飼養層培養是用處理過的（X射線處理）無活性3）雙層濾紙培養

在飼養層和靶細胞層之間放兩張濾紙,上面一層濾紙用于將靶細胞轉移到其他培養基上繼續培養.1163）雙層濾紙培養

在飼養層和靶細胞層之間放兩張濾4）微室培養定義:將單細胞培養在少量的培養基中培養。1174）微室培養定義:將單細胞培養在少量的培養基中培養。43優點：

（1）在培養過程中，可以連續進行顯微觀察一個細胞的生長、分裂和形成細胞團的全部過程.

缺點：

（1）培養時間較短.

（2）操作麻煩。118優點：

（1）在培養過程中，可以連續進行顯微觀察一個細5)懸浮培養將一定密度的懸浮細胞接種于液體培養基中,在保持良好的分散狀態下培養.適宜于消化得到的細胞數充足的情況下使用。懸浮培養1195)懸浮培養將一定密度的懸浮細胞接種于液體培養基中,在保持4.4.4.3細胞的同步化細胞同步化：指同一培養體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。有饑餓法，抑制法和冷處理法等。1204.4.4.3細胞的同步化細胞同步化：指同一培養體系的所可以通過饑餓法獲得G1或G2期同步化細胞。121可以通過饑餓法獲得G1或G2期同步化細胞。471224812349有絲分裂抑制法:在指數生長期的細胞懸浮培養物加入一定濃度的有絲分裂抑制劑如秋水仙素4-6小時，作用不可逆的。124有絲分裂抑制法:在指數生長期的細胞懸浮培養物加入一定濃度的4.4.4.4植物細胞的保存繼代培養保存法低溫保存法：5-10度冰凍保存法：-20度或液氮中1254.4.4.4植物細胞的保存繼代培養保存法514.5原生質體培養原生質體的相關的概念和研究意義原生質體的分離原生質體培養1264.5原生質體培養原生質體的相關的概念和研究意義524.5.1關于原生質體的幾個重要概念原生質體(protoplast):指除去細胞壁的細胞或是說一個被質膜所包圍的裸露細胞。亞原生質體（subprotoplast）：在原生質體分離過程中，有時會引起細胞內含物的斷裂而形成一些較小的原生質體就叫做亞原生質體。它可以具有細胞核或沒有細胞核。1274.5.1關于原生質體的幾個重要概念原生質體(protop4.5.2原生質體研究意義研究組織和器官發育機制；可以進行有關遺傳操作；研究植物細胞的生理功能；誘導融合形成雜種細胞。1284.5.2原生質體研究意義研究組織和器官發育機制；544.5.3原生質體的制備原材料準備預處理與酶解原生質體收集與純化原生質體活力檢測1294.5.3原生質體的制備原材料準備預處理與酶解原生質體收集4.5.3.1用于分離原生質體的材料來源兩個來源：各種組織的葉片，根尖等愈傷組織1304.5.3.1用于分離原生質體的材料來源兩個來源：各4.5.3.2酶消化取材消毒取植物組織，消毒后去掉表皮，剪碎；酶消化然后在25-28度水浴酶解60-90分鐘。使用的酶：果膠酶，纖維素酶等1314.5.3.2酶消化取材消毒574.5.3.3收集和純化原生質體

酶解結束后,要將原生質與碎片和酶液分離，然后經洗滌后再進行培養.過濾-離心法：先過濾后低速離心沉淀漂浮法：利用原生質體比重小，能在25%的蔗糖溶液中漂浮沉降法和漂浮法結合.先離心收集沉淀，在用21%蔗糖漂浮離心1324.5.3.3收集和純化原生質體

酶解結束后,4.5.3.4原生質體鑒定及活力檢