植物檢疫專業核酸檢測方法驗證程序趙文軍植物檢疫專業委秘書處2013-6-26植物檢疫專業核酸檢測方法驗證程序趙文軍主要內容一.背景二、總則三、標準起草實驗室驗證四、獨立實驗室驗證五、驗證報告格式六、試點驗證標準主要內容第一章背景1、植物檢疫標準制定情況●思想觀念的轉變，2004年前意識標準淡薄●標準從無到有●標準的快速發展，分子生物學技術的發展促進了植物檢疫的標準化。新的植物檢疫名錄的頒布促進了標準的快速發展。已發布446項●標準質量急需提高，標準的科學性與可操作性第一章背景第一章背景2、有害生物檢測鑒定標準的過程情況●課題研究成果轉化●參考國內外文獻驗證，本實驗室驗證●國際或區域性標準轉化，本實驗室驗證●從文獻到標準，主要是形態鑒定方面的。第一章背景第一章背景3、有害生物檢測鑒定標準驗證情況●中國檢科院開展了植物病毒標準的驗證●總局立項課題上海局主持驗證●標準制定中本實驗室驗證●部分標準的委托驗證大部分標準沒有經過足夠嚴謹的獨立實驗室驗證，急需開展驗證，提升標準質量，促進標準實施。第一章背景第一章背景4、驗證方法的選擇植物檢疫性有害生物檢測鑒定涉及主要方法有●形態學：多用于昆蟲、雜草、真菌，

特點：經驗性強；●免疫學：病毒、細菌，

特點：易標準化，抗體質量對結果影響大；●分子生物學：病毒、細菌、真菌、昆蟲

特點：最常用的為PCR凝膠電泳及實時熒光PCR，易標準化。

綜合考慮，首先開展核酸類檢測分子檢測方法進行試點驗證。第一章背景第一章背景5、驗證方案的起草過程●2012年底第一稿●征求部分專家意見，2013.2月完成第二稿，●2013.5月，會議討論形成第三稿●征求全部專業委人員意見，小幅修改形成第四稿第一章背景第二章總則1、

目的為提高植物檢疫專業核酸檢測方法的科學性和適用性，規范驗證流程，特制定本程序。2、范圍●本程序適用于標準制修訂過程中核酸檢測方法的驗證，包括采用現有方法和自主研發的新方法制修訂的標準。●若所制定的標準為等同采用國際標準，僅采用本實驗室驗證程序即可，但鼓勵標準制修訂方進行完整的驗證流程。若所制定的標準為修改采用國際標準，且修改了關鍵性技術，則應進行完整的驗證流程。第二章總則3、組織機構植物檢疫專業委負責本專業有害生物核酸檢測方法驗證的組織、審核等管理工作。委員會通過下設秘書處承擔具體職責，包括審核驗證實驗室的資質，指定并組織驗證實驗室開展驗證工作，組織專家進行驗證材料的審核及驗證數據的統計分析等。秘書長：陳乃中副秘書長：趙文軍秘書：段勝男（中國檢科院）、盧曉雨（深圳局）、康芬芳（天津局）、黃麗麗（江西局）3、組織機構4、術語與定義4.1核酸檢測方法驗證是確認某一核酸檢測方法適用于某一檢測對象的過程。4.2本實驗室驗證標準制修訂實驗室在合理的時間間隔內，以方法適用范圍內不同樣品為對象，對同一方法的驗證指標進行確證的過程，初步判斷方法可靠性。4.3獨立實驗室驗證獨立于標準制修訂方的實驗室驗證，判定方法的驗證指標能否達到預期用途。4、術語與定義5、驗證程序5、驗證程序第三章本實驗室驗證1、驗證方案1.1方法要求待驗證的檢測方法應為標準化的，描述應明確完整。所有涉及該方法的因素，包括陽性樣品核酸、陰性樣品核酸的來源及陽性樣品鑒定報告、試劑、耗材、儀器、設備、器具、儀器設備的參數設置、樣品的制備等均應包括在文件中。1.2方法預期用途標準制修訂方應根據實際情況描述方法的預期用途，應當包括檢測方法的適用范圍和樣品類型等。第三章本實驗室驗證1.3驗證指標標準制修訂方應根據方法的預期用途選擇合適的驗證指標，設計并形成驗證方案。典型的驗證指標包括方法的特異性、靈敏度、重復性、重現性等。2、本實驗室驗證首先驗證文本中規定的適用范圍，初步判斷方法的可靠性。驗證過程中，若某一指標的結果表明檢測方法不能滿足檢測目標的特定要求，應對該方法作必要的修改并重新驗證，直至能夠證明其滿足預期用途。1.3驗證指標3、驗證材料的審核標準制修訂方完成驗證后，須向秘書處提交驗證材料，具體包括：a）標準草案、b）驗證方案、c）驗證報告。秘書處組織專家評估提交材料的完整性與符合性及驗證方案的合理性。若提交的材料不完整，應要求其補足材料；若材料完整，驗證方案合理，且驗證結果能夠滿足預期用途的要求，則進行獨立實驗室驗證程序。3、驗證材料的審核第四章獨立實驗室驗證秘書處組織驗證實驗室進行獨立實驗室驗證。1、驗證實驗室的選擇1.1驗證實驗室數量參加驗證的實驗室不少于5個，原則上要求獲得至少5個實驗室的有效數據報告。在特殊情況下，如參加獨立驗證實驗的實驗室確實不足等原因，經秘書處商定后，可在較小的實驗室范圍內進行驗證實驗，但至少有兩家以上有效數據報告。1.2驗證實驗室的要求參加驗證的實驗室應具代表性，由秘書處從驗證實驗室庫中抽取，驗證實驗室按照驗證方案開展實驗。第四章獨立實驗室驗證1.3驗證實驗室的選擇原則秘書處根據需驗證的有害生物的種類及口岸檢疫的具體情況，結合實驗室認可、指定口岸等因素，考慮地域、儀器和人員配置等條件，選擇獨立驗證實驗室。1.4獨立驗證實驗室庫包括（1）總局規劃的重點實驗室及區域性重點實驗室（2）技術能力較強，具有開展核酸檢測能力的系統內實驗室；（3）某些產品的指定口岸所在的檢驗檢疫局實驗室；（4）國內其他具有能力的相關實驗室。（5）中國檢科院為暫定固定的獨立實驗室1.3驗證實驗室的選擇原則2、驗證樣品核酸的要求核酸的提供：標準制修訂方負責驗證樣品核酸的準備，核酸的質量：應滿足標準所列方法的要求，并滿足核酸的穩定性和均勻性要求，并經相關學科的復核鑒定專家確認。對照核酸：原則上包括近似種樣品核酸（針對具體有害生物種類，近似種的選取及數量由相關學科復核鑒定專家商定，若不能提供近似種樣品核酸，需提供2位相應學科復核鑒定專家的書面同意意見及理由）。核酸的量：考慮到驗證過程中可能會出現操作失誤，樣品數量應充分滿足測試所需。2、驗證樣品核酸的要求3方法驗證指標3.1特異性●對待檢對象不同地理種群的檢測結果為陽性；●與待檢對象親緣關系較近的有害生物的檢測結果為陰性；●同寄主上的其他有害生物尤其是引起類似癥狀的有害生物的檢測結果為陰性；

●對適用范圍中健康寄主植物及其產品的檢測結果為陰性。3方法驗證指標3.2靈敏度考察方法是否具備足夠的靈敏度以滿足口岸檢疫的要求。對于每種代表性樣品需要獨立驗證其靈敏度。可用已知的陽性樣品進行實驗，對陽性樣品制備的核酸溶液梯度稀釋的方式確定最低檢測靈敏度，以剛好能被有效檢出的濃度水平作為靈敏度。3.3重復性對于同一樣品的檢測，需重復3次實驗以上，分析各檢測結果之間的差異是否顯著，以測試方法的可靠性。3.2靈敏度3.4重現性在不同地區，不同實驗室，不同主流品牌試劑，不同操作人員的情況下，測試方法的穩定性與可靠性。方法應適用于實驗室擁有的同類主流檢測儀器，若所用參數不同，應在文件中說明。對方法中涉及的關鍵儀器設備，需在主流型號的儀器上測試，確保結果的可靠性。3.4重現性4、驗證實驗的實施秘書處與選定的驗證實驗室聯系并經實驗室確認后，根據驗證方案，標準制修訂方將驗證樣品核酸和驗證方案分發給各驗證實驗室。各實驗室應在規定時間內完成驗證實驗，每個驗證實驗室應需重復測試3次。5、驗證材料的提交驗證實驗室將驗證實驗報告及評價報告提交至秘書處，組織專家審核。●若結果滿足方法預期用途，則完成獨立實驗室驗證程序。●若結果不能完全滿足方法的預期用途，秘書處將結果反饋給標準制定方，并要求其對方法進行必要的審查并重新進行本實驗室的驗證程序；4、驗證實驗的實施第五章驗證報告參考格式

1、驗證實驗報告驗證實驗室應提供驗證實驗中涉及關鍵步驟的原始記錄（包括PCR電泳圖、熒光PCR的熒光圖譜或芯片檢測的原始數據圖等），以確保實驗結果的可追溯性。驗證實驗報告應包括詳細的實驗步驟、關鍵儀器型號、操作及數據結果等，并對結果進行分析，報告需反映實驗及結果的真實性。第五章驗證報告參考格式2、驗證評價報告方法特異性□特異完全滿足使用要求□比較特異基本滿足使用要求□特異性不夠不能滿足使用要求描述：方法靈敏度□靈敏度高完全滿足使用要求□比較靈敏基本滿足使用要求□靈敏度不夠不能滿足使用要求描述：重復性請驗證專家根據實際情況評價。方法重現性請驗證專家根據實際情況評價。2、驗證評價報告方法特異性□特異完全滿足使用要求方法靈可操作性□方法科學，可操作性強，適合口岸實際情況□可操作性一般，時間長，試劑購買難，操作比較復雜

□難于操作常規實驗室不具備硬件及軟件條件，不適合目前口岸實驗室使用。描述：安全性1、對人員及環境安全性□安全所用試劑安全環保，對操作人員及環境無傷害□安全性尚可需要防護設施，適合應用□不安全易導致操作人員傷害，需要常規實驗室不具備的防護設施。2、有害生物逃逸及擴散的可能性□安全常規操作不會導致有害生物逃逸及擴散□安全性尚可需要防護設施，能有效防止有害生物逃逸及擴散□不安全易導致有害生物逃逸及擴散綜合評價可操作性□方法科學，可操作性強，適合口岸實際情況安全性12013年試點驗證的植物檢疫行業標準2012B182 黃瓜花葉病毒檢疫鑒定方法 植檢 深圳局2012B184 馬鈴薯M病毒檢疫鑒定方法 植檢 黑龍江局2013年試點驗證的植物檢疫行業標準謝謝謝謝植物檢疫專業核酸檢測方法驗證程序趙文軍植物檢疫專業委秘書處2013-6-26植物檢疫專業核酸檢測方法驗證程序趙文軍主要內容一.背景二、總則三、標準起草實驗室驗證四、獨立實驗室驗證五、驗證報告格式六、試點驗證標準主要內容第一章背景1、植物檢疫標準制定情況●思想觀念的轉變，2004年前意識標準淡薄●標準從無到有●標準的快速發展，分子生物學技術的發展促進了植物檢疫的標準化。新的植物檢疫名錄的頒布促進了標準的快速發展。已發布446項●標準質量急需提高，標準的科學性與可操作性第一章背景第一章背景2、有害生物檢測鑒定標準的過程情況●課題研究成果轉化●參考國內外文獻驗證，本實驗室驗證●國際或區域性標準轉化，本實驗室驗證●從文獻到標準，主要是形態鑒定方面的。第一章背景第一章背景3、有害生物檢測鑒定標準驗證情況●中國檢科院開展了植物病毒標準的驗證●總局立項課題上海局主持驗證●標準制定中本實驗室驗證●部分標準的委托驗證大部分標準沒有經過足夠嚴謹的獨立實驗室驗證，急需開展驗證，提升標準質量，促進標準實施。第一章背景第一章背景4、驗證方法的選擇植物檢疫性有害生物檢測鑒定涉及主要方法有●形態學：多用于昆蟲、雜草、真菌，

特點：經驗性強；●免疫學：病毒、細菌，

特點：易標準化，抗體質量對結果影響大；●分子生物學：病毒、細菌、真菌、昆蟲

特點：最常用的為PCR凝膠電泳及實時熒光PCR，易標準化。

綜合考慮，首先開展核酸類檢測分子檢測方法進行試點驗證。第一章背景第一章背景5、驗證方案的起草過程●2012年底第一稿●征求部分專家意見，2013.2月完成第二稿，●2013.5月，會議討論形成第三稿●征求全部專業委人員意見，小幅修改形成第四稿第一章背景第二章總則1、

目的為提高植物檢疫專業核酸檢測方法的科學性和適用性，規范驗證流程，特制定本程序。2、范圍●本程序適用于標準制修訂過程中核酸檢測方法的驗證，包括采用現有方法和自主研發的新方法制修訂的標準。●若所制定的標準為等同采用國際標準，僅采用本實驗室驗證程序即可，但鼓勵標準制修訂方進行完整的驗證流程。若所制定的標準為修改采用國際標準，且修改了關鍵性技術，則應進行完整的驗證流程。第二章總則3、組織機構植物檢疫專業委負責本專業有害生物核酸檢測方法驗證的組織、審核等管理工作。委員會通過下設秘書處承擔具體職責，包括審核驗證實驗室的資質，指定并組織驗證實驗室開展驗證工作，組織專家進行驗證材料的審核及驗證數據的統計分析等。秘書長：陳乃中副秘書長：趙文軍秘書：段勝男（中國檢科院）、盧曉雨（深圳局）、康芬芳（天津局）、黃麗麗（江西局）3、組織機構4、術語與定義4.1核酸檢測方法驗證是確認某一核酸檢測方法適用于某一檢測對象的過程。4.2本實驗室驗證標準制修訂實驗室在合理的時間間隔內，以方法適用范圍內不同樣品為對象，對同一方法的驗證指標進行確證的過程，初步判斷方法可靠性。4.3獨立實驗室驗證獨立于標準制修訂方的實驗室驗證，判定方法的驗證指標能否達到預期用途。4、術語與定義5、驗證程序5、驗證程序第三章本實驗室驗證1、驗證方案1.1方法要求待驗證的檢測方法應為標準化的，描述應明確完整。所有涉及該方法的因素，包括陽性樣品核酸、陰性樣品核酸的來源及陽性樣品鑒定報告、試劑、耗材、儀器、設備、器具、儀器設備的參數設置、樣品的制備等均應包括在文件中。1.2方法預期用途標準制修訂方應根據實際情況描述方法的預期用途，應當包括檢測方法的適用范圍和樣品類型等。第三章本實驗室驗證1.3驗證指標標準制修訂方應根據方法的預期用途選擇合適的驗證指標，設計并形成驗證方案。典型的驗證指標包括方法的特異性、靈敏度、重復性、重現性等。2、本實驗室驗證首先驗證文本中規定的適用范圍，初步判斷方法的可靠性。驗證過程中，若某一指標的結果表明檢測方法不能滿足檢測目標的特定要求，應對該方法作必要的修改并重新驗證，直至能夠證明其滿足預期用途。1.3驗證指標3、驗證材料的審核標準制修訂方完成驗證后，須向秘書處提交驗證材料，具體包括：a）標準草案、b）驗證方案、c）驗證報告。秘書處組織專家評估提交材料的完整性與符合性及驗證方案的合理性。若提交的材料不完整，應要求其補足材料；若材料完整，驗證方案合理，且驗證結果能夠滿足預期用途的要求，則進行獨立實驗室驗證程序。3、驗證材料的審核第四章獨立實驗室驗證秘書處組織驗證實驗室進行獨立實驗室驗證。1、驗證實驗室的選擇1.1驗證實驗室數量參加驗證的實驗室不少于5個，原則上要求獲得至少5個實驗室的有效數據報告。在特殊情況下，如參加獨立驗證實驗的實驗室確實不足等原因，經秘書處商定后，可在較小的實驗室范圍內進行驗證實驗，但至少有兩家以上有效數據報告。1.2驗證實驗室的要求參加驗證的實驗室應具代表性，由秘書處從驗證實驗室庫中抽取，驗證實驗室按照驗證方案開展實驗。第四章獨立實驗室驗證1.3驗證實驗室的選擇原則秘書處根據需驗證的有害生物的種類及口岸檢疫的具體情況，結合實驗室認可、指定口岸等因素，考慮地域、儀器和人員配置等條件，選擇獨立驗證實驗室。1.4獨立驗證實驗室庫包括（1）總局規劃的重點實驗室及區域性重點實驗室（2）技術能力較強，具有開展核酸檢測能力的系統內實驗室；（3）某些產品的指定口岸所在的檢驗檢疫局實驗室；（4）國內其他具有能力的相關實驗室。（5）中國檢科院為暫定固定的獨立實驗室1.3驗證實驗室的選擇原則2、驗證樣品核酸的要求核酸的提供：標準制修訂方負責驗證樣品核酸的準備，核酸的質量：應滿足標準所列方法的要求，并滿足核酸的穩定性和均勻性要求，并經相關學科的復核鑒定專家確認。對照核酸：原則上包括近似種樣品核酸（針對具體有害生物種類，近似種的選取及數量由相關學科復核鑒定專家商定，若不能提供近似種樣品核酸，需提供2位相應學科復核鑒定專家的書面同意意見及理由）。核酸的量：考慮到驗證過程中可能會出現操作失誤，樣品數量應充分滿足測試所需。2、驗證樣品核酸的要求3方法驗證指標3.1特異性●對待檢對象不同地理種群的檢測結果為陽性；●與待檢對象親緣關系較近的有害生物的檢測結果為陰性；●同寄主上的其他有害生物尤其是引起類似癥狀的有害生物的檢測結果為陰性；

●對適用范圍中健康寄主植物及其產品的檢測結果為陰性。3方法驗證指標3.2靈敏度考察方法是否具備足夠的靈敏度以滿足口岸檢疫的要求。對于每種代表性樣品需要獨立驗證其靈敏度。可用已知的陽性樣品進行實驗，對陽性樣品制備的核酸溶液梯度稀釋的方式確定最低檢測靈敏度，以剛好能被有效檢出的濃度水平作為靈敏度。3.3重復性對于同一樣品的檢測，需重復3次實驗以上，分析各檢測結果之間的差異是否顯著，以測試方法的可靠性。3.2靈敏度3.4重現性在不同地區，不同實驗室，不同主流品牌試劑，不同操作人員的情況下，測試方法的穩定性與可靠性。方法應適用于實驗室擁有的同類主流檢測儀器，若所用參數不同，應在文件中說明。對方法中涉及的關鍵儀器設備，需在主流型號的儀器上測試，確保結果的可靠性。3.4重現性4、驗證實驗的實施秘書處與選定的驗證實驗室聯系并經實驗室確認后，根據驗證方案，標準制修訂方將驗證樣品核酸和驗證方案分發給各驗證實驗室。各實驗室應在規定時間內完成驗證實驗，每個驗證實驗室應需重復測試3次。5、驗證材料的提交驗證實驗室將驗證實驗報告及評價報告提交至秘書處，組織專家審核。●若結果滿足方法預期用途，則完成獨立實驗室驗證程序。●若結果不能完全滿足方法的預期用途，秘書處將結果反饋給標準制定方，并要