基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,并通過在生物體外進行DNA重組等技術，賦予生物以新的遺傳特性,從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的,因此又叫做DNA重組技術或基因拼接技術.（一）基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程實質（原理）結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平人們需要的新的生物類型和生物產品切割→拼接→導入→表達基因重組▲基因工程的若干問題:基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程實質（原理）結DNA重組技術(基因工程)的

基本工具做工程是需要工具的.DNA重組技術(基因工程)的做工程是需要工具的.一、限制性核酸內切酶（限制酶）

——“分子手術刀”⒈主要來源及種類：原核生物、約4000種一、限制性核酸內切酶（限制酶）

——“分子手術刀”⒈主要來源1.限制酶——“分子手術刀”作用：能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間(此處叫“切點”)的磷酸二酯鍵斷開(注意:不是氫鍵).注意:

一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并且只能在一個特定的切點上切割DNA分子。即：特異性.(注意:特異性表現在兩個方面.)作用部位在DNA的骨架上1.限制酶——“分子手術刀”作用：能識別雙鏈DNA的某種特▲限制酶的特異性表現在:

特定的脫氧核苷酸序列特定的切點.▲限制酶的特異性表現在:AATTGCCTTAAGDNA雙鏈及“磷酸二酯鍵”磷酸二酯鍵AATTGCCTTAAGDNA雙鏈及“磷酸二酯鍵”磷酸二酯鍵1.大腸桿菌(EcoRΙ)的一種限制酶能識別的脫氧核苷酸序列是(用堿基表示)_____________;切點在________之間。限制酶▲看圖回答:GAATTCG和A▲在G和A之間被限制酶切斷的是化學鍵是___________________.1.大腸桿菌(EcoRΙ)的一種限制酶能識別的脫

EcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端Goback

EcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackSmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端

如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，產生相同黏性末端嗎？

會產生相同的黏性末端..思考:如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶將DNA片段之間的縫隙“縫合”起來，即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶

作用部位在DNA骨架上互補的黏性末端的堿基通過氫鍵連接成堿基對，DNA連接酶將DNA片段之間的縫隙“縫合”起來，即恢復被限制▲DNA連接酶的種類(根據來源分)及其在功能上的異同.

----見課文P5.來源功能同異名稱E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體形成磷酸二酯鍵只能:互補的黏性末端黏性末端和平末端均可▲DNA連接酶的種類(根據來源分)及其在功能上的異同.來源功

異:

DNA連接酶:是將幾個DNA片段連接起來;不需DNA模板.

DNA聚合酶:則是將脫氧核苷酸連接(聚合)成DNA;需以DNA的一條鏈為模板.▲提示:

注意比較基因工程中的DNA連接酶和DNA復制中的DNA聚合酶的作用有何異同?

同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.異:▲提示:同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.----導入過程需要運輸“目的基因”的工具——運載體?！⒁?

一般地,不能將目的基因直接導入受體細胞.----導入過程需要運輸“目的基因”的工具——運載體?！?、“分子運輸車——基因進入受體細胞的運載體需要的條件：⑴有1~多個限制酶切點，供外源基因插入其中⑵對受體細胞無害⑶導入基因能在受體細胞中復制，提供大量的目的基因⑷有某些標記基因，鑒定受體細胞中是否有重組DNA，便于篩選⒉常用運載體：⑴細菌的質粒⑵噬菌體或某些動植物病毒⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制，轉基因生物能有預想的效果嗎？

⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點行嗎？

⑵霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷載有目的基因的載體有沒有進入受體細胞，肉眼看不到，如何去鑒定它是否進入？

三、“分子運輸車——基因進入受體細胞的運載體需要的條件：⑶▲什么是質粒?

是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體(即原核的DNA)之外，并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子.

質粒是基因工程最常用的載體.

▲小結:

質粒是小型、環狀的DNA分子.▲什么是質粒?是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序▲基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟：1）目的基因的獲取2）“基因表達載體”的構建3）將目的基因導入受體細胞(即“轉化”)4）目的基因的檢測與鑒定▲基因工程的基本操作程序主要包括1）目的基因的獲取步驟一：目的基因的獲取▲什么叫目的基因?

主要是指編碼蛋白質的結構基因.步驟一：目的基因的獲取▲什么叫目的基因?▲獲取目的基因的途徑有哪些?1.從“基因文庫”中獲取.2.利用“PCR技術”擴增.3.直接人工合成(適合于基因較小且已知其核苷酸順序)----見課文.共三條.▲獲取目的基因的途徑有哪些?1.從“基因文庫”中獲取.---▲從基因文庫中獲取“目的基因”：什么叫“基因文庫”?分為:1.基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.2.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.如cDNA文庫.

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)

類似從圖書館里取書.▲從基因文庫中獲取“目的基因”：什么叫“基因文庫”?分為:▲利用PCR技術擴增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶鏈式反應”,是一種在生物體外復制特定DNA片斷的技術.2.原理:DNA的半保留復制.3.過程:(見圖).4.優點:大量獲取目的基因.(指數式擴增,近2n)▲利用PCR技術擴增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶▲提示:PCR的基本操作(過程):

PCR是一種反復循環的DNA合成反應過程,其基本反應有三個步驟：

1.變性:通過加熱(高溫)使模板DNA完全變性成為單鏈,同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除.

2.退火:將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結合；

3.延伸:將溫度升高,熱穩定DNA聚合酶(即耐高溫)以脫氧核苷酸為原料催化合成DNA鏈延伸.

以上三步為一個循環，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經多次循環后即可達到擴增DNA片段的目的.▲提示:PCR的基本操作(過程):

PCR是一種反復循▲提示與思考:1.圖中的“模板DNA”就是已知核苷酸序列的2.引物是人工合成的,與模板DNA(即目的基因)互補3.加熱的作用是使_________.4.聚合酶(Tap酶)是指____(選:DNA聚合酶;RNA聚合酶),其特點是_________.5.原料是_________.6.每擴增一次,目的基因的數目增加___.DNA解鏈目的基因▲每循環(擴增)一次,就需要添加

引物.兩個▲提示與思考:DNA解鏈目的基因▲每循環(擴增)一次,就需要▲人工合成目的基因

如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接合成。1.通過反轉錄法合成:又分為:目的基因的mRNA(已知)單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成▲人工合成目的基因如果基因比較小，核苷酸序列又已知，2.直接合成.

根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成2.直接合成.根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應▲提示“基因表達載體”就是已插入

的載體.目的基因▲基因表達載體的構建

▲提示目的基因▲基因表達載體的構建3.啟動子:是有特殊結構的DNA片斷,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的識別和結合的部位.有它才能驅動目的基因轉錄出MRNA.最終獲得蛋白質.(不是復制!)4.終止子:位于目的基因的尾端.作用是終止轉錄.5.標記基因:是為了鑒別受體細胞里是否已經含有目的基因,從而將含目的基因的細胞篩選出來.如“抗生素基因”、“熒光標記基因”等.6.復制原點是載體復制(不是轉錄)時的起點.3.啟動子:是有特殊結構的DNA片斷,位于目的基因的首端,是▲什么叫轉化?

將目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定(如復制)和表達(即轉錄、翻譯為特定蛋白質及表現特定性狀等)的過程.▲提示:

注意,目的基因是隨著基因表達載體被導入受體細胞的,而不是被單獨導入的.步驟三：

轉化----將目的基因導入受體細胞▲什么叫轉化?▲提示:步驟三：1.將目的基因導入植物細胞----.農桿菌轉化法1.將目的基因導入植物細胞----.農桿菌轉化法▲提示:(1)農桿菌及農桿菌轉化法:農桿菌是土壤中的一種細菌.能感染雙子葉植物和裸子植物.其細胞里含Ti質粒,該質粒上含有一段DNA叫“T-DNA”(叫“可轉移的DNA”).將目的基因插入到該“T-DNA”中,通過使農桿菌感染植物,而將目的基因轉化入植物細胞并將其插入到植物細胞中的染色體的DNA上.(2)將目的基因導入植物細胞的方法還有:基因槍法和花粉通道法.▲提示:(2)將目的基因導入植物細胞的方法還有:2.將目的基因導入動物細胞---顯微注射法.2.將目的基因導入動物細胞---顯微注射法.

用口徑為1μm的DNA注射器，將大量目的基因片段(注意:是含目的基因的“基因表達載體”,而不是裸的目的基因)注入到受精卵的核內，然后把經過注射的受精卵移植到另一只雌性動物的子宮內，使受精卵發育為轉基因動物。什么叫顯微注射技術？用口徑為1μm的DNA注射器，將大量目的基因1）將細菌用

，以增大細菌

的通透性。

2）使含有目的基因的

進入受體細胞。

3）目的基因在受體細胞內，隨其繁殖而復制，由于細菌

的速度非?？?，在很短的時間內就能獲得大量的目的基因。CaCl2處理重組DNA繁殖3.將目的基因導入微生物細胞—感受態細胞法.大腸桿菌細胞是最常用的微生物受體細胞細胞壁1）將細菌用，以▲通過轉化以后,目的基因是否真正插入到了受體細胞的DNA中，是否能夠在受體細胞中穩定遺傳和正確表達呢?

這只有通過檢測、鑒定才能得知.▲通過轉化以后,目的基因是否真正插入到了受體細胞的DNA▲提示:目的基因的檢測與鑒定檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質抗蟲鑒定、抗病鑒定方法——方法--方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原抗體雜交▲提示:目的基因的檢測與鑒定檢測—鑒定——①檢測轉基因生物染▲DNA分子雜交原理：DNA分子雜交是基因診斷最基本的方法之一。其基本原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結合成雙鏈，即能夠進行雜交。這種結合是特異的，即嚴格按照堿基互補配對進行。因此，當用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與被測基因進行接觸，若兩者的堿基完全配對成雙鏈，則表明被測基因中含有已知的基因序列。▲DNA分子雜交原理：DNA分子雜交是基因診斷最基因探針只能和______(選:目的基因;非目的基因)雜交.基因探針只能和______(選:目的基因;非目的基因)雜交.例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。----個體生物學水平的鑒定檢測目的基因是否翻譯成蛋白質例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現中毒癥狀，說明未攝入

基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,并通過在生物體外進行DNA重組等技術，賦予生物以新的遺傳特性,從而創造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的,因此又叫做DNA重組技術或基因拼接技術.（一）基因工程的概念基因工程是指按照人們的愿望,進行嚴格的設計,基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程實質（原理）結果基因拼接技術或DNA重組技術生物體外基因DNA分子水平人們需要的新的生物類型和生物產品切割→拼接→導入→表達基因重組▲基因工程的若干問題:基因工程的別名操作環境操作對象操作水平基本過程實質（原理）結DNA重組技術(基因工程)的

基本工具做工程是需要工具的.DNA重組技術(基因工程)的做工程是需要工具的.一、限制性核酸內切酶（限制酶）

——“分子手術刀”⒈主要來源及種類：原核生物、約4000種一、限制性核酸內切酶（限制酶）

——“分子手術刀”⒈主要來源1.限制酶——“分子手術刀”作用：能識別雙鏈DNA的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個脫氧核苷酸之間(此處叫“切點”)的磷酸二酯鍵斷開(注意:不是氫鍵).注意:

一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列,并且只能在一個特定的切點上切割DNA分子。即：特異性.(注意:特異性表現在兩個方面.)作用部位在DNA的骨架上1.限制酶——“分子手術刀”作用：能識別雙鏈DNA的某種特▲限制酶的特異性表現在:

特定的脫氧核苷酸序列特定的切點.▲限制酶的特異性表現在:AATTGCCTTAAGDNA雙鏈及“磷酸二酯鍵”磷酸二酯鍵AATTGCCTTAAGDNA雙鏈及“磷酸二酯鍵”磷酸二酯鍵1.大腸桿菌(EcoRΙ)的一種限制酶能識別的脫氧核苷酸序列是(用堿基表示)_____________;切點在________之間。限制酶▲看圖回答:GAATTCG和A▲在G和A之間被限制酶切斷的是化學鍵是___________________.1.大腸桿菌(EcoRΙ)的一種限制酶能識別的脫

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EcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackEcoRⅠ黏性末端黏性末端GobackSmaⅠ平末端平末端SmaⅠ平末端平末端

如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來切割，產生相同黏性末端嗎？

會產生相同的黏性末端..思考:如果把兩種來源不同的DNA用同一種限制酶來DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶——“分子縫合針”DNA連接酶將DNA片段之間的縫隙“縫合”起來，即恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。DNA連接酶

作用部位在DNA骨架上互補的黏性末端的堿基通過氫鍵連接成堿基對，DNA連接酶將DNA片段之間的縫隙“縫合”起來，即恢復被限制▲DNA連接酶的種類(根據來源分)及其在功能上的異同.

----見課文P5.來源功能同異名稱E.ColiDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體形成磷酸二酯鍵只能:互補的黏性末端黏性末端和平末端均可▲DNA連接酶的種類(根據來源分)及其在功能上的異同.來源功

異:

DNA連接酶:是將幾個DNA片段連接起來;不需DNA模板.

DNA聚合酶:則是將脫氧核苷酸連接(聚合)成DNA;需以DNA的一條鏈為模板.▲提示:

注意比較基因工程中的DNA連接酶和DNA復制中的DNA聚合酶的作用有何異同?

同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.異:▲提示:同:兩種酶都是形成磷酸二酯鍵.----導入過程需要運輸“目的基因”的工具——運載體。▲注意:

一般地,不能將目的基因直接導入受體細胞.----導入過程需要運輸“目的基因”的工具——運載體?！?、“分子運輸車——基因進入受體細胞的運載體需要的條件：⑴有1~多個限制酶切點，供外源基因插入其中⑵對受體細胞無害⑶導入基因能在受體細胞中復制，提供大量的目的基因⑷有某些標記基因，鑒定受體細胞中是否有重組DNA，便于篩選⒉常用運載體：⑴細菌的質粒⑵噬菌體或某些動植物病毒⑶假如目的基因導入受體細胞后不能復制，轉基因生物能有預想的效果嗎？

⑴作為分子運輸車——載體，如果沒有切割位點行嗎？

⑵霍亂菌的質粒多個限制酶切點，你會用它來做分子運輸車嗎？

⑷載有目的基因的載體有沒有進入受體細胞，肉眼看不到，如何去鑒定它是否進入？

三、“分子運輸車——基因進入受體細胞的運載體需要的條件：⑶▲什么是質粒?

是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體(即原核的DNA)之外，并具有自我復制能力的雙鏈環狀DNA分子.

質粒是基因工程最常用的載體.

▲小結:

質粒是小型、環狀的DNA分子.▲什么是質粒?是一種裸露的、結構簡單、獨立于細菌染色體基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序▲基因工程的基本操作程序主要包括四個基本步驟：1）目的基因的獲取2）“基因表達載體”的構建3）將目的基因導入受體細胞(即“轉化”)4）目的基因的檢測與鑒定▲基因工程的基本操作程序主要包括1）目的基因的獲取步驟一：目的基因的獲取▲什么叫目的基因?

主要是指編碼蛋白質的結構基因.步驟一：目的基因的獲取▲什么叫目的基因?▲獲取目的基因的途徑有哪些?1.從“基因文庫”中獲取.2.利用“PCR技術”擴增.3.直接人工合成(適合于基因較小且已知其核苷酸順序)----見課文.共三條.▲獲取目的基因的途徑有哪些?1.從“基因文庫”中獲取.---▲從基因文庫中獲取“目的基因”：什么叫“基因文庫”?分為:1.基因組文庫:

基因文庫中包含了一種生物所有的基因,這種基因文庫叫做基因組文庫.2.部分基因文庫:

基因文庫中包含了一種生物的一部分基因,這種基因文庫叫做部分基因文庫.如cDNA文庫.

將含有某種生物不同基因的許多DNA片段,導入受體菌的群體中儲存,各個受體菌分別含有這種生物的不同的基因,稱為基因文庫(genelibrary)

類似從圖書館里取書.▲從基因文庫中獲取“目的基因”：什么叫“基因文庫”?分為:▲利用PCR技術擴增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶鏈式反應”,是一種在生物體外復制特定DNA片斷的技術.2.原理:DNA的半保留復制.3.過程:(見圖).4.優點:大量獲取目的基因.(指數式擴增,近2n)▲利用PCR技術擴增“目的基因”.1.概念:PCR即“聚合酶▲提示:PCR的基本操作(過程):

PCR是一種反復循環的DNA合成反應過程,其基本反應有三個步驟：

1.變性:通過加熱(高溫)使模板DNA完全變性成為單鏈,同時引物自身和引物之間存在的局部雙鏈也得以消除.

2.退火:將溫度下降至適宜溫度，使引物與模板DNA退火結合；

3.延伸:將溫度升高,熱穩定DNA聚合酶(即耐高溫)以脫氧核苷酸為原料催化合成DNA鏈延伸.

以上三步為一個循環，新合成的DNA分子又可以作為下一輪合成的模板，經多次循環后即可達到擴增DNA片段的目的.▲提示:PCR的基本操作(過程):

PCR是一種反復循▲提示與思考:1.圖中的“模板DNA”就是已知核苷酸序列的2.引物是人工合成的,與模板DNA(即目的基因)互補3.加熱的作用是使_________.4.聚合酶(Tap酶)是指____(選:DNA聚合酶;RNA聚合酶),其特點是_________.5.原料是_________.6.每擴增一次,目的基因的數目增加___.DNA解鏈目的基因▲每循環(擴增)一次,就需要添加

引物.兩個▲提示與思考:DNA解鏈目的基因▲每循環(擴增)一次,就需要▲人工合成目的基因

如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過DNA合成儀用化學方法直接合成。1.通過反轉錄法合成:又分為:目的基因的mRNA(已知)單鏈DNA雙鏈DNA(即目的基因)反轉錄合成▲人工合成目的基因如果基因比較小，核苷酸序列又已知，2.直接合成.

根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結構基因的核苷酸序列，再通過化學方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結構基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學合成2.直接合成.根據已知蛋白質的氨基酸序列，推測出相應▲提示“基因表達載體”就是已插入

的載體.目的基因▲基因表達載體的構建

▲提示目的基因▲基因表達載體的構建3.啟動子:是有特殊結構的DNA片斷,位于目的基因的首端,是RNA聚合酶的識別和結合的部位.有它才能驅動目的基因轉錄出MRNA.最終獲得蛋白質.(不是復制!)4.終止子:位于目的基因的尾端.作用是終止轉錄.5.標記基因:是為了鑒別受體細胞里是否已經含有目的基因,從而將含目的基因的細胞篩選出來.如“抗生素基因”、“熒光標記基因”等.6.復制原點是載體復制(不是轉錄)時的起點.3.啟動子:是有特殊結構的DNA片斷,位于目的基因的首端,是▲什么叫轉化?

將目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩定(如復制)和表達(即轉錄、翻譯為特定蛋白質及表現特定性狀等)的過程.▲提示:

注意,目的基因是隨著基因表達載體被導入受體細胞的,而不是被單獨導入的.步驟三：

轉化----將目的基因導入受體細胞▲什么叫轉化?▲提示:步驟三：1.將目的基因導入植物細胞----.農桿菌轉化法1.將目的基因導入植物細胞----.農桿菌轉化法▲提示:(1)農桿菌及農桿菌轉化法:農桿菌是土壤中的一種細菌.能感染雙子葉植物和裸子植物.其細胞里含Ti質粒,該質粒上含有一段DNA叫“T-DNA”(叫“可轉移的DNA”).將目的基因插入到該“T-DNA”中,通過使農桿菌感染植物,而將目的基因轉化入植物細胞并將其插入到植物細胞中的染色體的DNA上.(2)將目的基