菌種保藏技術主講:傅文紅主要內容:一、菌種保藏的目的二、菌種保藏的原理（掌握）三、菌種保藏的方法（重點）什么是菌種衰退？生產菌株性狀的劣化或遺傳標記的丟失：1、菌落形態的改變2、生長速度緩慢3、生產能力下降4、抗不良環境能力減弱（抗噬菌體、低溫等）菌種退化的防止1、減少傳代次數2、用單核細胞和單菌落移種傳代3、菌種純化4、采用良好培養基和培養條件5、科學的保藏一、菌種保藏的目的

菌種保藏的目的是：使菌種長期保藏之后，仍然保持著原有的生命力、優良生產性能、形態特征，以及不污染雜菌和不發生蟲害。二、菌種保藏的原理菌種保藏的原理是通過低溫、干燥、隔絕空氣（真空）和斷絕營養、加保護劑等手段，以達到最大限度地降低菌種的代謝強度，抑制微生物的生長與繁殖。由于菌種的代謝相對靜止，生命活動將處休眠狀態，所以能夠保藏較長時間。三、菌種保藏的方法1、斜面低溫保藏

（定期移植法）2、液體石蠟保藏3、砂土管貯藏4、

麩皮保藏法5、懸液保藏

：

1）生理鹽水保藏法；2）蒸餾水保藏法：

6、冷凍真空干燥保藏法7、液氮超低溫保藏法8、甘油保藏法斜面低溫保藏(定期移植法)這是一種常用最簡便的保藏方法。為了減少培養基水分散發，延長保藏時間，在配制時瓊脂用量加到2.5％，再加入0.2％磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀及碳酸鈣等緩沖劑，以中和保藏過程中產生的有機酸。可以用無菌膠塞代替棉塞，既能防止污染，又可隔絕氧氣，避免斜面干燥細菌：1個月，酵母菌3個月，放線菌、霉菌半年。二）、液體石蠟法

操作簡便，只要在菌苔上灌注一層無菌的液體石蠟，即可使菌種與外界空氣隔絕，達到防止培養基水分散失，抑制菌絲新陳代謝，推遲菌種老化，延長菌種生命和保存時間的目的。此種方法也稱為隔絕空氣保藏法。

三）、砂土管貯藏：此法應用廣泛，適于貯藏孢子和酵母狀分生孢子，而對菌絲體不適用。此法保藏孢子，壽命可達2～10年，使用時在無菌條件下，挑取少許砂土孢子，抖撒在PDA斜面上，適溫培養，菌絲生長后，再轉管培養1次。

1.準備砂土:

細河砂，用內徑0.250～0.177毫米篩孔過篩,除去粗粒和砂未；

紅黃壤土，內徑0.149毫米過篩，用磁鐵襯紙吸除砂土中鐵屑，用0.05～0.1N鹽酸浸泡半天，除去有機質。然后用清水反復沖洗至酸堿度近中性后，置于60～80℃烘箱中烘干。砂土比例2:1或4:1混合，分裝入10毫米×100毫米試管或安瓿瓶內，每管裝量0.5克，經0.11兆帕121℃高壓滅菌30分鐘，每天1次，共3次，或160℃干熱滅菌1次，保持2～3小時。滅菌后挑取少許砂土移至PDA斜面上培養，證實無雜菌即可。2、接種:

干接：用接種環直接挑取孢子2～3環，拌入砂土管中濕接：將孢子刮入5毫升無菌水的試管內，充分搖勻，制在孢子懸液，然后用1毫升吸管吸取懸液，每管中加入0.2毫升。3、貯藏：干接法制成的砂土管，直接放在盛有無水氯化鈣、變色硅膠或生石灰的廣口瓶內保存：濕接法制成的砂土管，用真空泵抽氣8～10小時，使之干燥。放在盛有無水氯化鈣或變色硅膠的大試管內，加橡皮塞，放置4～6℃冰箱中貯藏。四）麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入孢子，然后在低溫干燥條件下保存。其制作方法將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經冷卻，接入新鮮培養的菌種，適溫培養至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。此法適用于產孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經濟實惠，工廠較多采用。中國科學院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達數年至數十年。五）、蒸餾水保藏法：這是保存斜面菌種和孢子最簡單的方法，有效期可達1年以上。1、斜面蒸餾水貯藏：在無菌條件下，將無菌蒸餾水傾注入需保藏的斜面菌種內。加水量需高出斜面頂端1～2厘米，更換無菌橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內貯藏。2、孢子蒸餾水貯藏：無菌條件下提取少許孢子，移入試管無菌蒸餾水內，換上橡皮塞，直立置于4～6℃冰箱內貯藏。若保存時間較長，中途需補充無菌蒸餾水。使用時從管內挑取菌種塊或蘸取孢子懸液，移接至新的斜面培養基上活化培養。原試管加塞后仍可繼續貯藏。六）、冷凍真空干燥保藏法1、安瓿瓶的準備：

2、保護劑的選擇：3、冷凍干燥裝置：4、制備孢子液5、預凍孢子液：6、減壓干燥7、真空熔封：

六）、冷凍真空干燥保藏法

1、安瓿瓶的準備：安瓿瓶的玻璃應能經受溫度的突變而不破裂，先用2％鹽酸浸泡12小時，再用清水洗滌3次，然后用蒸餾水洗凈、烤干；瓶口加棉塞，滅菌后備用。

2、保護劑的選擇：保護劑的作用是使細胞在凍干過程中免受損傷及減少在保藏過程中的死亡。保護劑種類很多，如牛馬血清、無菌牛奶等，多數菌種保藏是脫脂牛奶。

3、冷凍干燥裝置：這個裝置包括1臺真空泵、1付麥氏真空計、1個緩沖瓶、1個真空干燥器（內裝五氧化二磷或無水氯化鈣等干燥劑）和1個冷凍槽（內盛有1:3的食鹽和碎冰塊）。六）、冷凍真空干燥保藏法7、真空熔封：菌種安瓿瓶經減壓干燥后，應立即取出安裝在封口用的玻璃抽氣管上，進行抽氣熔封管口。邊抽氣，邊用煤氣或酒精燈的細火焰，對準安瓿瓶中央，即可熔斷封口。熔封時應注意火焰，不宜過大。

安瓿瓶菌種啟用時，在無菌操作下打開這瓿瓶，加入0.3～0.5毫升的無菌生理鹽水或1％麥芽汁即可使用。

由于真空干燥保藏的菌種是密封在安瓿瓶里的，因此不僅郵寄運輸方便，并且不會污染雜菌。此法適于能形成孢子的菇類長期保藏，其設備和操作均較復雜。

七）、液態氮超低溫保藏

將要保藏菌種的懸浮液或菌塊，密封于盛有保護劑的安瓿瓶里，先在控制的條件下致冷，使之緩速預凍，再置于-150至-196℃液態氮超低溫冰箱中保藏。優點：保存時間可長達數年至數十年；適用范圍廣，對一些即使不耐低溫菌種，如草菇等，也可在保護劑的保護下進行超低溫保存；此外，經保藏的菌種基本上不發生變異。國內主要的菌種保藏機構1、CCTCC中國典型培養物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，簡稱CCTCC):CCTCC保藏的微生物包括細菌、放線菌、酵母菌、真菌、單細胞藻類、人和動物細胞系、轉基因細胞、雜交瘤、原生動物，地衣，植物組織培養、植物種子、動植物病毒、噬菌體、質粒和基因文庫等各類微生物（生物材料/菌種）。/

國內主要的菌種保藏機構2、CGMCC普通微生物菌種保藏管理中心:CGMCC的宗旨是廣泛收集國內外的微生物資源，妥善保存，以公開的保藏機構的名義為工農業生產、衛生健康、環境保護、科研教育提供標準化的實驗材料,在保證生物安全和保護知識產權的前提下，為第三者能夠自由地利用各種微生物材料提供服務，最大限度的實現微生物資源的保護、共享和持續利用。

國內主要的菌種保藏機構3、CICC中國工業微生物菌種保藏管理中心:我國唯一的國家級工業微生物菌種資源保藏管理中心，保藏各種工業微生物菌種資源包括：細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌和大型真菌，共67個屬251種，近3000株，庫藏備份80000余支。/

國外主要菌種保藏機構1、ATCC(AmericanTypeCultureCollection）美國典型菌種保藏中心:主要從事農業、遺傳學、應用微生物、免疫學、細胞生物學、工業微生物學、菌種保藏方法、醫學微生物學、分子生物學、植物病理學、普通微生物學、分類學、食品科學等的研究。該中心保藏有藻類111株，細菌和抗生素16865株，細胞和雜合細胞4300株，絲狀真菌和酵母46000株，植物組織79株，種子600株，原生動物1800株，動物病毒、衣原體和病原體2189株，植物病毒1563種。另外，該中心還提供菌種的分離、鑒定及保藏服務。該中心保藏的菌種可出售。

國外主要菌種保藏機構2、NBRC(NITEBiologicalResourceCenter)：日本技術評價研究所生物資源中心

3、NRRL(AgriculturalResearchServiceCultureCollection)：美國農業研究菌種保藏中心

4、CBS(CentraalbureauvoorSchimmelcultures)荷蘭微生物菌種保藏中心

5、KCTC(KoreanCollectionforTypeCultures)韓國典型菌種保藏中心

6、DSMZ(DeutscheSammlungvonMikroor