酶工程第三章酶的發酵生產第一節酶生物合成的基本理論

一、RNA的生物合成——轉錄某種細胞能否合成某種酶分子。首先取決于細胞中的遺傳信息載體——DNA分子中是否存在有該酶所對應的基因。DNA分子可以通過復制生成新的DNA，再通過轉錄生成對應的RNA，然后再翻譯成為多肽鏈，經加工而成為具有完整空間結構的酶分子。轉錄是以DNA為模板，以核苷三磷酸為底物，在RNA聚合酶（轉錄酶）的作用下，生成RNA的過程。

第一節酶生物合成的基本理論轉錄時，RNA聚合酶首先結合到DNA的特定位點（啟動基因）上，DNA的雙螺旋鏈部分解開，以其中一條鏈為模板，通過堿基互補方式結合進第一個核苷三磷酸，然后隨著RNA聚合酶的移動，DNA雙螺旋逐漸解開，按照模板上的堿基順序逐個加入與其互補的核苷三磷酸并聚合而生成多聚核苷酸鏈。在RNA聚合酶后面生成的多聚核苷酸鏈立即與模板分開，DNA分子的兩條鏈又重新纏繞形成雙螺旋。（圖3-1）

圖3-1RNA的生物合成——轉錄示意圖轉錄生成的DNA按其結構和功能的不同，可以分成mRNA，tRNA和rRNA等3種。第一節酶生物合成的基本理論二、蛋白質的生物合成——翻譯以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核糖體上通過各種tRNA，酶和輔助因子的作用合成多肽鏈的過程，稱為翻譯。翻譯是將RNA分子上的堿基排列次序轉變為多肽鏈上氨基酸的排列次序的過程。不同的生物，其翻譯過程有些差別。現已大腸桿菌為例，說明翻譯的基本過程。翻譯過程分為4個階段。

1.氨基酸活化生成氨酰-tRNA氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的作用下，與特定的tRNA合，生成氨酰-tRNA。此過程由ATP提供能量，其反應如下：第一節酶生物合成的基本理論aa+tRNA+ATP氨酰-tRNA合成酶aa-tRNA+AMP+PPi對于大腸桿菌而言，肽鏈合成時的第一個氨基酸都是甲酰甲硫氨酸。它是在甲硫氨酸與tRNA結合后，再經甲酰化而成。即：

Met+tRNA’+ATP→Met-tRNA’+AMP+PPi

Met-tRNA’再經甲酰轉移酶[EC2.1.2.9]的作用，甲酰化而生成甲酰甲硫氨酰-Trna’（fMet-tRNA’）。2.肽鏈合成的起始肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子(InitiationFactor)的參與下,核糖體30s亞基,fMet-tRNA’,mRNA和50s亞基結合，組成起始復合物的過程。這一階段包括5個步驟：第一節酶生物合成的基本理論蛋白質合成的起始階段的示意圖如圖3-2所示。第一節酶生物合成的基本理論第一節酶生物合成的基本理論3．肽鏈的延伸

在延伸因子（ElongationFactor）的參與下，與mRNA上密碼子對應的氨酰-tRNA進入70s核糖體之中的“A”位。通過肽鏈合成酶的作用，P位上fMet—tRNAF的甲酰甲硫氨酰（fMet）與A位上的氨酰-tRNA(aa1-tRNA1)以肽鍵結合，形成肽酰-tRNA。接著，mRNA和核糖體作相對移動，A位上的肽酰-tRNA轉至P位上，而原在P位上的t-RNAF游離出去。然后，根據mRNA上密碼編排，下一個氨酰-tRNA進入A位，再重復上述過程，使肽鏈不斷延伸，直至終止密碼子為止。其主要過程如下:第一節酶生物合成的基本理論

圖3-3肽鏈的延伸第一節酶生物合成的基本理論4．肽鏈合成的終止

隨著肽鏈的延伸，mRNA與70s核糖體不斷地作相對移動。當mRNA分子中的終止密碼子（UAA，UAG，UGA）移動到核糖體的A位時，沒有相應的氨酰-tRNA進入，此時釋放因子（ReleaseFactor）進入A位，并與終止密碼子結合。據研究表明，釋放因子有兩種，其中RF-1可與UAA和UAG結合，而RF-2可與UAA和UGA結合。在釋放因子進入A位后，已合成的完整肽鏈從P位轉至A位時，被釋放出來。隨之70s核糖體解離成為30s亞基和50s亞基，可重新用于下一次肽鏈的合成。新合成的肽鏈釋放出來后，還需經過加工才能形成空間結構的酶或蛋白質。加工過程首先需經過肽脫甲酰酶的作用，使甲酰甲硫氨酸殘基上的甲酰基除去。有時還需在氨肽酶的作用下，從肽鏈的N-末端切除一個或數個氨基酸殘基，然后自動折疊卷曲成完整的空間結構。第一節酶生物合成的基本理論三、酶生物合成的調節

如上所述，酶的生物合成要經過一系列的步驟，需要諸多因素的參與。故此，在轉錄和翻譯過程中，許多因素都會影響酶的生物合成。那么，究竟哪些因素對酶的生物合成起主要的調節控制作用呢？研究結果表明，至少在原核生物中，甚至在所有生物中，轉錄水平的調節控制對酶的生物合成是至為重要的。轉錄水平調節控制，又稱為基因的調節控制。這種控制理論最早是由雅各（Jacob）和莫諾德(Monod)于1960年提出的操縱子學說來闡明的，1966年發現了啟動基因，使這一調節控制理論不斷完善。第一節酶生物合成的基本理論

聚合酶才能結合到其在啟動基因的位點上，這樣，酶的合成才有可能開始，否則酶就無法開始合成。調節基因可以產生一種阻抑蛋白，阻抑蛋白是一種變構蛋白,它可以通過與低分子作用物(誘導物或阻遏物)的特異結合而改變其結構，從而改變它與操縱基因的結合力。當阻抑蛋白結合到操縱基因上時,RNA聚合酶即使已經結合到啟動基因的位點上,也無法通過操縱基因而進入到結構基因位置,因而無法將遺傳信息轉錄到mRNA上,酶就無法合成。只有當阻抑蛋白改變結構而不與操縱基因結合時,RNA聚合酶才有可能通過操縱基因,到達結構基因位置,進行轉錄,進而翻譯成酶蛋白多肽鏈。基因對酶生物合成的調節控制有3種模式。即分解代謝物阻遏作用,酶合成的誘導作用以及酶合成的反饋阻遏作用。第一節酶生物合成的基本理論1.分解代謝物阻遏作用

分解代謝物阻遏作用是指容易利用的碳源阻遏某些酶(主要是誘導酶)生物合成現象。例如:葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成,果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成等。分解代謝物阻遏作用之所以產生,這是由于容易利用的碳源過量存在時,通過代謝途徑進行降解,放出的能量有一部分儲存在ATP中，ATP是由ADP和AMP通過磷酸化作用生成的。這樣細胞內ATP濃度增加，就使AMP濃度降低。由于cAMP可通過磷酸二酯酶作用，水解生成AMP。cAMP+H2O磷酸二酯酶AMP同時，cAMP的生成受阻，從而致使細胞中cAMP的濃度隨AMP濃度的降低而降低。這必然使cAMP-CRP復合物的濃度也跟著降低。結果,在啟動基因(P)上沒有cAMP-CRP復合物結合,RNA聚合酶也就無法結合啟動基因的位點上.就使結構基因(S)上的遺傳信息無法轉錄,酶的生物合成無法進行。第一節酶生物合成的基本理論

2．酶生物合成的誘導作用加進某中物質,使酶的生物合成開始或加速進行的過程,稱為酶生物合成的誘導作用。簡稱為誘導作用。起誘導作用的物質，稱為誘導劑。例如，乳糖誘導β—半乳糖苷酶的合成等。酶生物合成的誘導作用過程如圖3-4所示。

第一節酶生物合成的基本理論第一節酶生物合成的基本理論

圖3-4酶生物合成的誘導作用（A）-----無誘導物時（B）----添加誘導物時(B)第一節酶生物合成的基本理論

在無誘導物存在時，調節基因（R）產生的阻抑蛋白與操縱基因（O）的結合力較強，當它們結合時，就使已經在啟動基因（P）上的RNA聚合酶無法經過操縱基因位置而進入結構基因（S）的位置。因此遺傳信息無法轉錄，酶不能合成。當有誘導物存在時，誘導物與阻抑蛋白結合在一起，使阻抑蛋白結構發生改變，使之與操縱基因的結合力減弱。阻抑蛋白不能與操縱基因結合，就使RNA聚合酶可以順利通過操縱基因位置而到達結構基因位置。進行轉錄生成mRNA，再進一步翻譯成酶蛋白多肽鏈。

第一節酶生物合成的基本理論

3．酶生物合成的反饋阻遏作用酶生物合成的反饋阻遏作用又稱為產物阻遏作用，指的是酶催化作用的產物或代謝途徑的末端產物使該酶的生物合成受阻的過程。引起反饋阻遏的物質，稱為共阻遏物。例如，無機磷酸是堿性磷酸酶的催化磷酸單酯水解的產物，而它的過量存在，卻可阻遏堿性磷酸酶的生物合成；組氨酸作為組氨酸合成途徑的終產物，它的過量積累卻反過來對其合成途徑中的10種酶的生物合成均起反饋阻遏作用。反饋阻遏作用的機理與誘導合成的機理相似。如圖3-5所示。第一節酶生物合成的基本理論

圖3-5酶生物合成的反饋阻遏作用（A）-----無阻礙物時（B）----有阻礙物時第二節酶發酵生產常用的微生物

任何生物都能在一定條件下合成某些酶。但是并不是所有的細胞都能用于酶的發酵生產。一般說來，能用于酶發酵生產的細胞必需具備如下幾個條件：（1）酶的產量高。優良的產酶細胞首先要具有高產的特性，才有較好的開發應用價值。高產細胞可以通過篩選、誘變、或采用基因工程、細胞工程等技術而獲得。（2）容易培養和管理。要求產酶細胞容易生長繁殖，并且適應性較強，易于控制便于管理。（3）產酶穩定性好。在通常的生產條件下，能夠穩定地用于生產，不易退化。一旦細胞退化，要經過復壯處理，使其恢復產酶性能。（4）利于酶的分離純化。發酵完成后，需經分離純化過程，才能得到所需的酶。這就要求產酶細胞本身及其它雜質易于和酶分離。（5）安全可靠。要求使用的細胞及其代謝物安全無毒，不會影響生產人員和環境，也不會對酶的應用產生其他不良影響。第二節酶發酵生產常用的微生物

現在大多數酶都采用微生物細胞進行發酵生產。微生物具有種類多，繁殖快，容易培養代謝能力強等特點，有不少性能優良的產酶菌株已在酶的發酵生產中廣泛應用。現把常用的產酶微生物簡介如下：

一、枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）

枯草芽孢桿菌是應用最廣泛的產酶微生物之一。枯草桿菌是芽孢桿菌屬細菌。細胞成干狀，大小為（0.7—0.8）?*（2—3），?，單個，無莢膜，周生鞭毛，運動，革蘭氏染色陽性。菌落粗糙，不透明，污白色或微帶黃色。此菌用途很廣，可用于生產α—淀粉酶、蛋白酶、β—葡聚糖酶、堿性磷酸酶等。例如，枯草桿菌BF7658是國內用于生產α—淀粉酶的主要菌株；枯草桿菌AS1.398可用于生產中性蛋白酶和堿性磷酸酶。枯草桿菌生產的α—淀粉酶和蛋白酶都是胞外酶。而堿性磷酸酶存在于細胞間質之中。

第二節酶發酵生產常用的微生物

三、黑曲霉（Aspergillusniger）

黑曲霉是曲霉屬黑曲霉群霉菌。菌絲體由具橫隔的分枝菌絲構成，菌叢黑褐色，頂囊球形，小梗雙層，分生孢子球形，平滑或粗糙。黑曲霉可用于生產多種酶，有胞外酶也有胞內酶。如糖化酶、α—淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶、核糖核酸酶、脂肪酶、纖維素酶、橙皮苷酶、柚苷酶等。第二節酶發酵生產常用的微生物

四、米曲霉（Aspergillusoryzae）

米曲霉是曲霉屬黃曲霉叢霉菌。菌叢一般為黃綠色，后變為黃褐色，分生孢子頭呈放射形，頂囊球形或瓶形，小梗一般為單層，分生孢子球形，平滑少數有刺，分生孢子梗長2mm左右，粗糙。米曲霉可用于生產糖化酶和蛋白酶，這在我國傳統的酒曲和醬油中得到廣泛應用。此外，米曲霉還用于生產氨基酰化酶、磷酸酯酶、核酸酶P1、果膠酶等。第二節酶發酵生產常用的微生物

五、青霉（Penicillium）

青霉屬半知菌綱。營養菌絲無色，淡色，有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，頂端形成掃帚狀的分枝，小梗頂端串生分生孢子，分生孢子球形，橢圓形或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生長時呈藍綠色。青霉菌分布廣泛，種類很多。其中產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）用于生產葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素V）、果膠酶、纖維素酶CX等，桔青素（Penicilliumcitrinum）用于生產5—磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S1、核酸酶P1等。第二節酶發酵生產常用的微生物

六、木霉（Trichoderma）

木霉屬于半知菌綱。生長時菌落呈棉絮狀或致密叢束狀，菌落表面呈不同程度的綠色。菌絲透明，有分隔，分枝繁復，分枝末端為小梗，瓶狀，束生、對生、互生或單生，分生孢子由小梗相繼生出，靠黏液把它們聚集成球形或近球形的孢子頭。分生孢子近球形或橢圓形，透明或亮黃綠色。木霉是生產纖維素酶的重要菌株。木霉產生的纖維素酶中包含有C1酶、CX酶和纖維二糖酶等。此外，木霉中含有較強的17a羥化酶，常用于甾體轉化。第二節酶發酵生產常用的微生物

七、根霉（Rhizopus）

根霉生長時，由營養菌絲產生匍匐枝。匍匐枝的末端圖形出假根，在有假根的匍匐枝上生出成群的孢子囊梗，梗的頂端膨大形成孢子囊，囊內生孢子囊孢子，孢子呈球形，卵形或不規則形狀。根霉用于生產糖化酶、α—淀粉酶、轉化酶、酶性蛋白酶、核糖核酸酶、脂肪酶、果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶等。根霉有強的11α羥化酶，是用于甾體轉化的重要菌株。第二節酶發酵生產常用的微生物

八、毛霉（Mucor）毛霉的菌絲體在基質上或基質內廣泛蔓延，菌絲體上直接生出孢子囊梗，分枝較小或單生，孢子囊梗頂端有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常帶有針狀的草酸鈣結晶。毛霉用于生產蛋白酶、糖化酶、α—淀粉酶、脂肪酶、果膠酶、凝乳酶等。

九、鏈霉菌（Streptomyces）鏈霉菌是一種放線菌。形成分枝的菌絲體。有氣生菌絲和基內菌絲之分，基內菌絲體不斷裂，只有氣生菌絲體形成孢子鏈。鏈霉菌是生產葡萄糖異構酶的主要菌株，還可以用于生產青霉素酰化酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、幾丁質酶等。此外，鏈霉菌還含有豐富的16α羥化酶，可用于甾體轉。第二節酶發酵生產常用的微生物

十、啤酒酵母（Sacharomycescerevisiae）

啤酒酵母是在工業上廣泛應用的酵母，細胞由圓形、卵形、橢圓形到臘腸形。在麥芽汁瓊脂培養基上菌落為白色，有光澤，平滑，邊緣整齊。營養細胞可以直接變為子囊，每個子囊含有1—4個圓形光亮的子囊孢子。啤酒酵母主要用于釀造啤酒、酒精、飲料酒和面包制造。在酶的生產方面，用于轉化酶、丙酮酸脫羧酶、醇脫氫酶等的生產。第二節酶發酵生產常用的微生物

十一、假絲酵母（Candida）假絲酵母的細胞圓形、卵形或長形。無性繁殖為多邊芽殖，形成假菌絲，可生成厚垣孢子、無節孢子、子囊孢子。不產生色素。在麥芽汁瓊脂培養基上菌落呈乳白色或奶油色。假絲酵母是單細胞蛋白的主要生產菌。在酶工程方面可用于生產脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、轉化酶、醇脫氫酶。假絲酵母具有烷類代謝的酶系，可用于石油發酵；具有較強的17羥基化酶，可用于甾體轉化制造睪丸素等。酶的發酵生產是以獲得大量所需的酶為目的。為此，除了選擇性能優良的產酶細胞以外，還必須滿足細胞生長、繁殖和發酵產酶的各種工藝條件，并要根據發酵過程的變化進行優化控制。酶發酵生產的一般工藝流程如圖3-6所示。第三節發酵工藝條件及控制

酶的發酵生產是以獲得大量所需的酶為目的。為此，除了選擇性能優良的產酶細胞以外，還必須滿足細胞生長、繁殖和發酵產酶的各種工藝條件，并要根據發酵過程的變化進行優化控制。酶發酵生產的一般工藝流程如圖3-6所示。第三節發酵工藝條件及控制

圖3-6酶發酵生產的工藝流程第三節發酵工藝條件及控制

一、細胞活化與擴大培養

性能優良的產酶細胞選育出來以后，必須盡可能保持其生長和產酶特性不變異，不死亡，不被雜菌污染等。就必須采取妥善的保藏方法，以備隨時應用。保藏細胞在使用之前必須接種于新鮮的斜面培養基上，在一定條件下進行培養，以恢復細胞的生命活動能力，這就叫做細胞活化。為了保證發酵時有足夠數量的優質細胞，活化了的細胞一般要經過一級至數級的擴大培養。用于細胞擴大培養的培養基稱為種子培養基。種子培養基中一般氮源要豐富些，碳源可相對少些，種子培養條件，包括溫度、pH、溶解氧的供給等，應盡量滿足細胞生長的需要，以便細胞生長得既快又好。種子擴大培養的時間不宜太長，一般培養至對數生長期，即可接入下一級擴大培養或接入發酵。但若以孢子接種的則要培養至孢子成熟期，才能接入發酵。接入發酵的種子的量一般為發酵培養基總量的1%～10%。第三節發酵工藝條件及控制二、培養基的配制

培養基是指人工配制的用于細胞培養和發酵的各種營養物質的混合物。在設計和配制培養基時，應特別注意各種組分的種類和含量，以滿足細胞生長、繁殖和新陳代謝的需要，并要調節至適宜的pH。還必須注意到，有些細胞生長、繁殖階段和發酵階段所要求的培養基有所不同，在此情況下，要根據需要配制不同的生長培養基和發酵培養基。培養基有多種多樣，千差萬別。但培養基的組分一般包括碳源、氮源、無機鹽和生長因素等幾方面。

第三節發酵工藝條件及控制

不同的細胞對各種碳源的利用情況大不相同，所以在配制培養基時應根據不同細胞的不同要求而選擇適宜的碳源。在酶的發酵生產中，除了要從營養的角度考慮碳源的選擇以外，還要考慮到碳源對酶生物合成的調節作用，主要要考慮酶生物合成的誘導作用以及是否存在分解代謝物作用。在選擇碳源時應盡量選用對所需的酶有誘導作用的碳源，而不使用或少使用有分解代謝物阻遏作用的碳源。例如，α-淀粉酶的發酵生產中，應選用對該酶有誘導作用的淀粉作為碳源，而不用對該酶的生物合成有分解代謝物阻遏作用的果糖作為碳源。β-半乳糖苷酶發酵應選用乳糖為碳源，而不用或少用葡萄糖為碳源等等。在選擇碳源時，必需考慮原料的供求和價格問題。第三節發酵工藝條件及控制

1．碳源碳源是指能夠向細胞提供碳素化合物的營養物質。通常碳源同時也是提供能量的能源。碳是構成細胞成分的主要元素之一，也是各種酶的重要組成元素。所以，碳源是酶發酵生產乃至其他產物的發酵生產的必不可少的營養物質。目前，在酶發酵生產中最常用的碳源是淀粉及其水解物，如糊精、麥芽糖、葡萄糖等。

第三節發酵工藝條件及控制

2．氮源氮是組成細胞蛋白質和核酸的重要元素之一，也是酶分子的主要組成元素。凡能夠向細胞提供氮源素的營養物質稱為氮源。氮源可分為有機氮源和無機氮源兩種。有機氮源主要是各種蛋白質及其水解產物。如：酪蛋白、豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、多肽、氨基酸等。無機氮源是含氮的各種無機化合物，如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等各種銨鹽和硝酸鹽等。

第三節發酵工藝條件及控制

不同的細胞對各種氮源的要求各不相同，應根據要求進行選擇和配制。一般說來，動物細胞要求有機氮，植物細胞主要要求無機氮，微生物細胞中，異養型微生物用有機氮，自養型微生物用無機氮。此外，碳和氮兩者的比例對酶的產量有顯著的影響。所謂碳氮比（C/N）一般是指培養基中碳元素（C）的總量與氮元素（N）總量之比。可通過測定或計算培養基中碳和氮的含量而求出。有時也采用培養基中碳源總量和氮源總量之比來表示碳氮比。使用時要注意兩種比值是不同的。第三節發酵工藝條件及控制3．無機鹽無機鹽的主要作用是提供細胞生命活動不可缺少的無機元素，并對培養基的PH、氧化還原電位和滲透壓起調節作用。各種無機元素的功用各不相同，有些是細胞的主要組分，如：磷、硫等；有些是酶的組分，如：磷、硫、鋅、鈣等；有些是酶的激活劑或抑制劑，如：鉀、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鈣、鉬、鈷、氯、溴、碘等；有些則是對PH、滲透壓、氧化還原電位起調節作用的，如：鈉、鉀、鈣、氯、磷等。根據細胞對無機元素需要量的大小，可分為主要元素（大量元素）和微量元素兩大類。主要元素有：磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣等。微量元素有：銅、錳、鋅、鉬、鈷、碘等。微量元素是細胞生命活動不可缺少的，但需要量很少，過量反而會引起不良效果，必須嚴加控制。第三節發酵工藝條件及控制無機元素是通過添加無機鹽來提供的，一般采用水溶性的硫酸鹽、磷酸鹽或鹽酸鹽等。有時也使用硝酸鹽，在提供無機氮的同時，提供無機元素。4．生長因素生長因素是指細胞生長繁殖所必不可缺的微量有機化合物主要包括各種氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素，以及動植物生長激素等。各種氨基酸是蛋白質和酶的組分；嘌呤和嘧啶是核酸和某些輔酶的組分；維生素主要起輔酶作用；動植物生長激素則分別對動物細胞和植物細胞的生長、分裂起調節作用。有的細胞能夠自己合成各種生長因素，而有的細胞則缺少合成一種或多種生長因素的能力，需由外界供給，才能正常生長繁殖，這樣的細胞稱為營養缺陷型。第三節發酵工藝條件及控制在酶的發酵生產中，通常在培養基中加進玉米漿、酵母膏等，以提供各種必需的生長因素。有時，也加進純化的生長因素，以供細胞生長繁殖之需。現舉例幾種酶發酵培養基：（1）枯草桿菌BF7658α—淀粉酶發酵培養基：玉米粉8%，豆餅粉4%，磷酸氫二鈉0.8%，硫酸銨0.4%，氧化鈣0.2%，氯化銨0.15%。（2）枯草桿菌AS1.398中性蛋白酶發酵培養基：玉米粉4%，豆餅粉3%，麩皮3.2%，米糠1%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.03%。（3）黑曲霉糖化發酵培養基：玉米粉10%，豆餅粉4%，麩皮1%（PH4.4—5.0）。第三節發酵工藝條件及控制（4）地衣芽孢桿菌2709堿性蛋白酶發酵培養基：玉米粉5.5%，豆餅粉4.0%，磷酸氫二鈉0.4%，磷酸二氫鉀0.03%（PH8.5）。（5）黑曲霉AS3.350酸性蛋白酶發酵培養基：玉米粉6%，豆餅粉4%，玉米漿0.6%，氯化鈣0.5%，氯化銨1%，磷酸氫二鈉0.2%（PH5.5）。（6）流動放線菌葡萄糖異構酶發酵培養基：糖蜜2%，豆餅粉2%，磷酸氫二鈉0.1%，硫酸鎂0.05%（PH7.2）。（7）桔青霉磷酸二脂酸發酵培養基：淀粉水解糖5%，蛋白胨0.5%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.04%，磷酸氫二鈉0.05%，磷酸二氫鉀0.05%。第三節發酵工藝條件及控制

（8）黑曲霉AS3.396果膠酶發酵培養基：麩皮5%，果膠0.3%，硫酸銨2%，磷酸二氫鉀0.25%，硫酸鎂0.05%，硝酸鈉0.02%，硫酸亞鐵0.001%（自然PH）。（9）枯草桿菌AS1.398堿性磷酸酶發酵培養基：葡萄糖0.4%，乳蛋白水解物0.1%，硫酸銨1%，氯化鉀0.1%，氯化鈣0.1mmol/L，氯化鎂1.0mmol/L，磷酸氫二鈉20μmol/L（PH7.4的0.1mol/LTris—HCL緩沖液）。

三、PH調節培養基的PH與細胞的生長繁殖以及發酵產酶都有密切關系，故必須進行必要的調節控制。第三節發酵工藝條件及控制不同細胞生長繁殖的最適PH有所不同。一般細胞和放線菌的生長最適PH為中性或微堿性（PH6.5—8.0）；霉菌和酵母的生長最適PH為偏酸性（PH4.0—6.0）；植物細胞生長的最適PH為5—6。細胞發酵產酶的最適PH通常接近于該酶反應的最適PH，例如：發酵生產堿性蛋白酶的最適PH為堿性（PH8.5—9.0）;生產中性蛋白酶的PH為中性至微酸性（PH6.0—7.0）為宜；而酸性（PH4—6）條件有利于酸性蛋白酶的產生。然而要注意到有些酶在該酶反應的最適PH條件下，細胞受到影響，故有些細胞的產酶最適PH與酶作用的最適pH有明顯差別。例如：枯草桿菌堿性磷酸酶作用最適PH為9.5，而產酶最適PH為7.4。第三節發酵工藝條件及控制

有些細胞可以同時產生多種酶，通過控制培養基的PH，往往可以改變各種酶之間的產量比例。例如：黑曲霉可生產α—淀粉酶，又可生產糖化酶。當培養基的PH偏向中性時，可使α—淀粉酶產量增加而糖化酶減少，反之，當培養基的PH偏向酸性時，則糖化酶產量提高而α—淀粉酶的量降低。再如用米曲霉生產蛋白酶，當培養基的PH為堿性時，主要生產堿性蛋白酶，降低培養基的PH，則主要生產中性或酸性蛋白酶。

第三節發酵工藝條件及控制培養基的PH在細胞生長繁殖和代謝物產生的過程中往往會發生變化。這種變化與細胞特性有關，也與培養基的組分密切相關。含糖量高的培養基，由于糖代謝產生有機酸，會使培養基的PH向酸性方向移動；含蛋白質、氨基酸較多的培養基，經代謝產生較多的胺類物質，使PH向堿性方向移動；以硫酸銨為氮源時，隨著銨離子被細胞利用，使培養基PH下降；以尿素為氮源時，先隨著尿素被脲酶水解生成氨，使培養基PH上升，然后又隨著氨被細胞同化而使PH下降；磷酸鹽的存在，對培養基的PH起一定的緩沖作用。所以在細胞培養和發酵過程中，必須對培養基的PH進行適當的控制和調節。PH的調節可以通過改變培養基的組分或其比例來實現。必要時可使用緩沖溶液，或流加適宜的酸、堿溶液，以調節控制培養基中PH變化。第三節發酵工藝條件及控制四、溫度的調節控制溫度是影響細胞生長繁殖和發酵產酶的重要因素之一。不同的細胞有各自不同的最適生長溫度。如：枯草桿菌的最適生長溫度為34—37℃，黑曲霉的最適生長溫度為28—32℃，植物細胞的最適生長溫度為25℃左右。細胞發酵產酶的最適溫度與最適生長溫度有所不同，而且往往低于最適生長溫度，這是由于在較低的溫度條件下，可提高酶的穩定性，延長細胞產酶時間。例如，用醬油曲霉生產蛋白酶，在28℃條件下發酵，其蛋白酶的產量比在40℃條件下高2—4倍，在20℃溫度條件下發酵，則其蛋白酶產量會更高。但并不是溫度越低越好，若溫度過低，生化反應速度很慢，反而降低酶產量，延長發酵周期。故必須進行試驗，以確定最佳產酶溫度。第三節發酵工藝條件及控制為此，有些酶的發酵生產，要在不同階段控制不同的溫度條件。在生長繁殖階段控制在細胞生長最適溫度范圍內，以利于細胞生長繁殖，而在產酶階段，則需控制在產酶的最適溫度。在細胞生長和發酵產酶過程中，由于細胞的新陳代謝作用，不斷放出熱量，會使培養基的溫度升高，同時，熱量不斷擴散和散失，又會使培養基溫度降低，兩者綜合，決定了培養基的溫度。由于在發酵的不同階段，細胞新陳代謝放出的熱量差別很大，擴散和散失的熱量受到環境溫度等因素的影響，使培養基的溫度變化明顯。為此必須經常及時地進行調節控制，使培養基的溫度經常維持在適宜的范圍內。溫度控制的方法一般采用熱水升溫，冷水降溫，故此在發酵罐中，均設計有足夠傳熱面積的熱交換裝置，如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。第三節發酵工藝條件及控制五、溶解氧的調節控制細胞的生長繁殖以及酶的生物合成過程需要大量的能量。這些能量一般由ATP等高能化合物來提供。如本章第一節所述，大腸桿菌合成蛋白質的過程中，合成n個肽鍵的酶蛋白多肽鏈，就需要消耗(3n+2)個ATP，由于氨基酸活化生成氨酰—tRNA時，ATP失去兩個高能磷酸鍵，生成AMP。故此，實質上消耗了(4n+3)個ATP的高能磷酸鍵。由于酶都是大分子，可見酶生物合成消耗的能量是很多的。為了獲得足夠多的能量，以滿足細胞生長和發酵產酶的需要，培養基中的能源（一般是碳源提供）必須經有氧解才能產生大量的ATP。為此，必須供給充足的氧氣。第三節發酵工藝條件及控制在培養基中生長和發酵產酶的細胞，一般只能利用溶解在培養基中的氧氣—溶解氧。由于氧是難溶于水的氣體，培養基中含有的溶解氧并不多，很快就會被細胞利用完。為此，必須在發酵過程中連續不斷地供給無菌空氣，使培養基中的溶解氧保持在一定水平，以滿足細胞生長和產酶的需要。溶解氧的調節控制，就是要根據細胞對溶解氧的需要量，進行連續不斷的供氧，以使培養基中的溶解氧維持在一定的濃度范圍內。細胞對氧的需要量與細胞的呼吸強度及培養基中細胞濃度密切相關，可用耗氧速率Ko2表示：

Ko2=Qo2·Cc第三節發酵工藝條件及控制式中Ko2為耗氧速率，指的是單位體積（L，mL)的培養液中的細胞在單位時間（h，min）內所消耗的氧氣量（mmol，ml）。耗氧速率一般以[mmol/氧（h·L）]表示。Qo2為細胞呼吸強度，是指單位細胞量（每個細胞或每克干細胞）在單位時間（h,min）內的耗氧量，，以[mmol氧/（g干細胞·h）]或[mmol氧/（每個細胞·min）]表示。細胞呼吸強度與細胞種類和細胞生長期有關。不同的細胞其呼吸強度各不相同，就是同一種細胞在不同的生長階段，其呼吸強度也有所差別。一般細胞在對數生長期，呼吸強度較大，在產酶高峰期，由于大量進行酶的合成，需要很多能量也就需要大量氧氣，呼吸強度大。第三節發酵工藝條件及控制

Cc為細胞濃度。指的是單位體積培養液中細胞的量，以（g干細胞/L）或（個細胞/L）表示。在酶的發酵生產過程中,在不同的階段，細胞呼吸強度和細胞濃度各不相同，致使耗氧速率有很大差別。因此必須根據耗氧量的不同供給適量的溶解氧。溶解氧的供給，生產是將無菌空氣通入發酵容器中，然后在一定條件下使空氣的氧溶解到培養液中，以供細胞生命活動之所需。培養液中溶解氧的量多少決定于在一定條件下氧氣的溶解速度。氧的溶解速度又稱為溶氧速率或溶氧系數，以Kd表示。溶解速率是指單位體積的發酵液在一定時間內所能溶解的氧的量。其單位一般以[mmol/氧（h·L）]表示。第三節發酵工藝條件及控制溶氧速率與通氣量、氧的分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養液的性質等有密切關系。當溶氧速率與耗氧速率相等時，即Ko2=Kd的條件下，培養液中的溶解氧的量保持恒定，可滿足細胞生長和發酵產酶的需要。當耗氧速率改變時，必須相應地調節溶氧速率。調節溶氧速率的方法，主要有下列幾種：（1）調節通氣量：通氣量是指單位時間內流經培養液的空氣量（L/min）。通常用培養液體積與每分鐘通入的空氣體積之比表示。例如，1m3培養液，每分鐘流過的空氣量為0.5m3，則通氣量為1：0.5；每升培養液，每分鐘流過2L空氣，則通氣量為1：2等等。當通氣量增大時，可提高溶氧速率，反之，減少通氣量，則使溶氧速率降低。第三節發酵工藝條件及控制

（2）調節氧的分壓：增加空氣壓力，或提高空氣中氧的含量都能提高氧的分壓，從而提高溶氧速率。反之則使溶氧速率降低。（3）調節氣液接觸時間：氣液兩相接觸時間延長，可使更多的氧溶解，從而提高溶氧速率；反之則使溶氧速率降低。可以通過增加液層高度，在反應器中增設擋板等方法以延長氣液接觸時間。（4）調節氣液接觸面積：氧氣溶解到培養液是通過氣液兩相的界面進行的。增加氣流接觸界面的面積，有利于提高溶氣速率。為了增大氣液接觸面積，應使通過培養液的空氣盡量分散。在發酵容器的底部安裝空氣分配管，使分散的氣泡進入液層，是增加氣液接觸面積的主要方法。裝設攪拌裝置或增設擋板等可使氣泡進一步打碎和分散，也可有效地增加氣液兩相的接觸面積，從而提高溶氧速率。第三節發酵工藝條件及控制（5）培養液的特性對溶氧速率有明顯影響，若培養液的黏度大，產生氣泡多，則不利于氧的溶解。通過改變培養液的組分或濃度，可有效地降低培養液粘度，加入適宜的消泡劑或設置消泡裝置，以消除泡沫的影響，都可提高溶氧速率。以上各種方法可根據實際情況選擇使用，以便根據耗氧速率的改變而有效快捷地調節溶氧速率。若溶氧速率低于耗氧速率，則細胞得不到所需的供氧量，必然影響其生長和產酶；然而溶氧速率過高，對發酵也是不利的，一則造成浪費，二則在高溶氧速率下會抑制某些酶的生成，如青霉素酰化酶等；另外，為獲得高溶氧速率而采用的大量通氣或快速攪拌等措施會使某些細胞（如霉菌、放線菌、植物細胞和動物細胞、固定化細胞等）受到損傷。所以溶氧速率等于或稍高于耗氧速率即可。第三節發酵工藝條件及控制六提高酶產量的措施在酶的發酵生產過程中，為了提高酶產量，除了選育優良的產酶細胞，保證發酵工藝條件并根據需要變化情況及時加以調節控制以外，還可以采取某些行之有效的措施，諸如添加誘導物，控制阻遏物濃度，添加表面活性劑或其他產酶促進劑等。現簡介如下：1．添加誘導物對于誘導酶的發酵生產，在發酵培養基中添加適當的誘導物，可使產酶量顯著提高。例如：乳糖誘導β—半乳糖苷酶，纖維二糖誘導纖維素酶，蔗糖甘油單棕櫚酸酯誘導蔗糖酶等。

第三節發酵工藝條件及控制

一般來說，不同的酶有各自不同的誘導物。然而有時一種誘導物可誘導生成同一酶系的若干種酶。如β-半乳糖苷可同時誘導β-半乳糖苷酶、透過酶和β-半乳糖乙酰化酶等3種酶。同一種酶往往有多種誘導物，實際應用時可根據酶的特性、誘導效果和誘導物的來源等方面進行選擇。誘導物一般可分為3類：（1）酶的作用底物：許多誘導酶都可有其作用底物誘導產生。例如：大腸桿菌生長在以葡萄糖為單一碳源的培養基中，每個細胞平均只含有1分子β-半乳糖苷酶。若將該細胞轉移到含有乳糖而不含有葡萄糖的培養基中，第三節發酵工藝條件及控制2min后開始大量產生β-半乳糖苷酶，平均每個細胞產生3000分子β-半乳糖苷酶。此外，纖維素酶、果膠酶、青霉素酶、右旋糖酐酶、淀粉酶、蛋白酶等均可由各自的作用底物誘導產生。（2）酶的反應產物：有些酶可由其催化反應的產物誘導產生。例如：半乳糖醛酸是果膠酶催化果膠水解的產物，它卻可以作為誘導物，誘導果膠酶的產生。此外，纖維二糖誘導纖維素酶、沒食子酸誘導單寧酶等。（3）酶的底物類似物：研究結果表明，酶的最有效的誘導物，往往不是酶的作用底物，也不是其反應產物，而是不能被酶作用或很少被酶作用的底物類似物。例如：異丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）對β-半乳糖苷酶的誘導效果比乳糖高幾百倍，蔗糖甘油單棕櫚酸酯對蔗糖酶的誘導效果比蔗糖高幾十倍等。有些反映物對酶也有誘導效果。第三節發酵工藝條件及控制

可見添加誘導物對提高酶產量有非常顯著的效果。進一步研究和開發高效廉價的誘導物有著重要的意義和應用前景。2．控制阻遏物濃度如前所述，有些酶的生物合成受到阻遏物的阻遏作用。為了提高酶的產量，必須設法解除阻遏作用。阻遏作用有產物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。阻遏物可以是酶催化反應產物，代謝途徑的末端產物以及分解代謝物（葡萄糖等容易利用的碳源）。控制阻遏物濃度是解除阻遏、提高酶產量的有效措施。第三節發酵工藝條件及控制3．添加表面活性劑表面活性劑可分為離子型和非離子型兩大類。離子型表面活性劑又有陽離子型、陰離子型和兩性離子型之別。由于離子型表面活性劑有些對細胞有毒害作用，特別是季胺型離子表面活性劑（如“新潔爾滅”等）是消毒劑。不能用于酶的發酵生產。非離子型表面活性劑，如：吐溫（Tween）、特里頓(Triton)等，可積聚在細胞膜上，增加細胞的通透性，有利于酶的分泌，所以可增加酶的產量。例如，在霉菌發酵生產纖維素酶的培養基中，添加1%的吐溫，可使產酶量提高1-20倍。在使用時，要注意表面活性劑添加量，過多或過少都效果不好，應控制在最佳濃度范圍內，此外，添加表面活性劑有利于提高某些酶的穩定性和催化能力。第三節發酵工藝條件及控制4．添加產酶促進劑產酶促進劑是指可以促進產酶、但作用機理并未闡明清楚的物質。添加產酶促進劑往往對提高酶產量有顯著效果。例如，添加植酸鈣鎂可使霉菌蛋白酶和桔青霉磷酸二酯酶的產量提高1-20倍。添加聚乙烯醇(Polyvinylalcohol)可提高糖化酶的產量。聚乙烯醇、醋酸鈉等對提高纖維素酶的產量也有效果等。產酶促進劑對不同細胞、不同酶的作用效果各不相同，要通過試驗選用適當的產酶促進劑并確定一個最適濃度。

第四節固定化細胞發酵產酶固定化細胞又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞，是指用各種方法固定在載體上又能進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。固定化細胞是20世紀70年代后期才發展起來的技術，有關細胞固定化方法及其特性，留待本書第六章闡述。本節僅介紹其發酵產酶的特點。固定化細胞產酶是從1978年開始的，十幾年來，國內外均開展了大量研究，取得了可喜進展。利用固定化細胞發酵生產α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等胞外酶的研究均取得了成功。第四節固定化細胞發酵產酶固定化細胞又稱固定化活細胞或固定化增殖細胞，是指用各種方法固定在載體上又能進行生長、繁殖和新陳代謝的細胞。固定化細胞是20世紀70年代后期才發展起來的技術，有關細胞固定化方法及其特性，留待本書第六章闡述。本節僅介紹其發酵產酶的特點。固定化細胞產酶是從1978年開始的，十幾年來，國內外均開展了大量研究，取得了可喜進展。利用固定化細胞發酵生產α-淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、果膠酶、纖維素酶、溶菌酶、天冬酰胺酶等胞外酶的研究均取得了成功。第四節固定化細胞發酵產酶

一、固定化細胞生長固定化細胞在適宜的條件下培養時，固定在載體上的細胞以一定的速度生長，在達到平衡期以后的相當長的一段時間內，固定化細胞的濃度基本上保持恒定。同時，隨著固定化細胞的生長和增殖，有一些細胞泄漏到培養液中，這些泄漏細胞如同游離細胞一樣，在培養液中生長繁殖。根據10多年來的大量試驗結果，固定化細胞發酵生產胞外酶具有如下顯著特點：1．提高產酶率細胞經固定化后，在一定的空間范圍內生長繁殖，細胞密度增大，故可加速生化反應，提高產酶率。例如，固定化枯草桿菌細胞生產α-淀粉酶，在分批發酵時，其體積產酶率（又稱產酶強度）達到游離細胞的122%，在連續發酵時，產酶率更高（表3-1）。固定化細胞的比產酶速率（εg）較游離細胞比產酶速率（εf）高。第四節固定化細胞發酵產酶表3-1不同發酵方式對α-淀粉酶產酶率的影響第四節固定化細胞發酵產酶2.可在高稀釋率條件下連續發酵固定化細胞固定在載體上,不容易脫落流失,可反復使用多次,進行半連續發酵,并可在高稀釋率條件下進行連續發酵。例如,固定化細胞進行酒精、乳酸等厭氧發酵，可連續使用半年或更長時間，固定化細胞發酵產酶，可連續穩定地使用30天以上。3、發酵穩定性好細胞經固定化后，由于受到載體的保護作用，使細胞對PH和溫度的適應范圍增寬，能比較穩定地發酵產酶。這一特點有利于發酵的操作控制，有利于自動化生產。第四節固定化細胞發酵產酶

4、縮短發酵周期，提高設備利用率固定化細胞生長好以后，能長期維持其產酶特性，縮短發酵周期。例如，固定化黑曲霉半連續發酵生產糖化酶，第一批發酵時，周期為120h，與游離細胞發酵周期相同，但在第二批以后，發酵周期縮短到60h。若采用連續發酵，可在高稀釋率條件下穩定產酶，這就更加提高了發酵設備利用率。5、產品容易分離純化固定化細胞顆粒很容易與發酵液分離，發酵液中游離細胞含量較低，就有利于產品的分離純化，有利于提高產品質量。第四節固定化細胞發酵產酶二、固定化細胞發酵產酶的工藝條件控制固定化發酵產酶的基本工藝條件與游離細胞發酵大同小異，已在本章第三節中闡述。這里僅僅介紹固定化細胞發酵產酶過程中特別需要注意的幾個工藝條件控制問題。1、固定化細胞的預培養固定化細胞制備好以后，一般要進行預培養，以使固定在載體上的細胞生長繁殖。待長好后，才用于發酵產酶。為了使固定化細胞生長良好，預培養應采用利于生長的生長培養基和工藝條件。然后改換成有利于產酶的發酵培養基和最佳發酵工藝條件。有時也可采用相同的培養基和工藝條件進行預培養和發酵。第四節固定化細胞發酵產酶

2、溶解氧的供給固定化細胞在進行培養和發酵過程中，由于受到載體的影響，氧的溶解和傳遞受到一定的阻礙作用。特別是采用包埋法制備的固定化細胞，氧要通過凝膠層擴散到凝膠粒內部，才能供細胞應用，使氧的供給成為主要的限制性因素。為此，必須增加溶解氧的量，才能滿足細胞生長和產酶的需要。由于固定化細胞反映器均不能采用強烈的攪拌，以免破壞固定化細胞，所以，增加溶解氧的主要方法是加大通氣量。例如，游離的枯草桿菌細胞發酵生產α-淀粉酶，通氣量一般控制在0.5-1m3/(m3.min),而采用固定化細胞發酵，其通氣量要1-2m3/(m3.min)或者更多。此外，可通過改變固定化載體，固定化技術或改變培養基組分等方法，以改善供氧。例如，瓊脂對氧的擴散不利，應盡量少用作固定化載體；在凝膠中加進某些物質，使其有利于氧的傳遞；采用過氧化氫酶與細胞共固定化，再在培養液中添加適量的過氧化氫，通過酶的作用，產生氧氣，共細胞使用；降低培養基的濃度，盡量降低培養基的粘度等。溶解氧的供給，是固定化細胞好氣性發酵的關鍵限制性因素之一。有待進一步研究解決。第四節固定化細胞發酵產酶

3.溫度的控制固定化細胞對溫度的適應范圍較廣，在分批發酵和半連續發酵中，溫度不難控制。但在連續發酵過程中，由于稀釋率較高，反應器內溫度變化較大。若只是在反應器內調節溫度，則在流加的培養液溫度差別較大時，難以達到要求。一般在培養液進入反應器之前，必須預先調節到適宜溫度。第四節固定化細胞發酵產酶4．培養基成分的控制固定化細胞發酵培養基，一般與游離細胞發酵的培養基沒有多大差別。但是某些固定化載體的結構會受到某些成分的影響，所以在配制培養基時要加以注意。例如：用海藻酸鈣凝膠制備的固定化細胞，過量的磷酸鹽會使其結構破壞，故要在培養基中限制磷酸鹽濃度，同時要在培養基中加進一定濃度的鈣離子，以保持其穩定性。此外，為了有利于氧的溶解和傳遞，培養基濃度不宜過高，尤其是培養基的粘度應盡量的低些為好。此外，為了適應回定化細胞發酵產酶的工藝要求，還必須在固定化細胞反應器的研制，固定化載體和固定化技術等方面下功夫。第五節動、植物細胞發酵產酶

利用植物細胞和動物細胞發酵生產各種天然產物，是生物工程研究和開發的新領域。自20世紀80年代以來，世界上許多國家和地區的學者競相進行研究，已取得不少進展，呈現出廣闊的前景。一、動植物細胞的特性動物細胞和植物細胞均可以在人工控制條件的生物反應器中，如同微生物細胞那樣，發酵生產而獲得各種所需的產物。然而它們之間有不同的特性。微生物、植物、動物細胞的主要特性差異如表3—2所示。第五節動、植物細胞發酵產酶表3-2微生物、植物、動物細胞的特性比較第五節動、植物細胞發酵產酶

從表中可以看到，動、植物細胞比微生物大得多,體積為微生物細胞的幾千倍；動、植物細胞均對剪切力敏感，其中動物細胞由于沒有細胞壁，對剪切力的敏感性更強，這在反應器的研制和操作控制方面要嚴加注意；動、植物細胞的生長速率和代謝速率均比微生物低，故生長倍增時間和發酵周期勻較微生物長；動物細胞的營養要求比微生物和植物細胞都復雜，往往要有血清或其代用品，動物細胞才能長得好；微生物、植物和動物細胞應用于發酵的主要產物各不相同，微生物主要用于生產醇類、有機酸、氨基酸，核苷酸、抗生素和酶，植物細胞主要用于色素、香精、藥物和酶，而動物細胞培養的主要產物則是激素、疫苗、單克隆抗體和酶等各種功能蛋白質。第五節動、植物細胞發酵產酶二、植物細胞發酵的特點

植物是各種色素、香精、藥物和酶等天然產物的主要來源。據世界衛生組織公布，從植物中得到的最普遍而又不必不可少的藥物有17類。全世界每年使用的植物來源的天然芳香化合物的價值超過15億美元，美國每年所使用的植物來源的藥物超過30億美元，我國使用的中草藥及其制劑大部分來自植物，可見植物與人們的生活和健康有著極其密切的關系。然而，至今為止，植物來源的天然物質的生產幾乎都是采用提取法。即首先收集植物（栽培的或野生的），然后采用各種生化技術，把有用的物質從植物組織細胞中提取分離出來。例如，從木瓜中提取木瓜蛋白酶和糜蛋白酶，從人參中提取人參皂苷，從鼠尾草中提取迷迭香酸（一種天然抗氧化劑），從紫草根中提取紫草寧（一種色素和抗菌物質），從玫瑰茄中提取花青素，第五節動、植物細胞發酵產酶從茉莉花中提取香精等等。提取法的工藝路線比較繁雜，加上植物的栽培和生長受到地理環境和氣候條件的影響，難于滿足人們的需要。尤其是我國地少人多，野生植物資源越來越少，栽培條件又受到各種限制，不少植物資源出現供不應求的趨勢。為此，發展植物細胞發酵生產各種天然產物的技術，具有深遠的科學意義和廣闊的應用前景。植物細胞發酵技術首先從植物組織中選育出植物細胞，再經過篩選、誘變、原生質體融合或DNA重組等技術而獲得高產、穩定的植物細胞。然后，用植物細胞在人工控制條件的植物細胞反應器中，如同微生物細胞那樣，進行發酵而獲得各種所需的產物。植物細胞發酵生產天然產物，與從植物中提取分離這些物質相比較，具有如下特點：第五節動、植物細胞發酵產酶1．提高產率使用高產穩定的植物細胞進行發酵，可明顯提高天然產物的產率。例如，日本三進石油化學工業公司于1983年在世界上首次成功地用紫草細胞發酵生產紫草寧。他們用750L的反應器，發酵23天，發酵液中紫草寧的含量達到細胞干重的14%，比紫草根中紫草寧含量高10倍。比產率達到種植紫草的830倍。此外，木瓜蛋白酶、人參皂苷、迷迭香酸、小檗堿、黃連素、輔酶Q—10、青蒿素等幾十種物質，其植物細胞的發酵產率均達到或超過種植植物的產率。第五節動、植物細胞發酵產酶

2．縮短周期植物細胞生長的倍增時間一般為12~60h時，發酵周期10~30天，這比起微生物來是相當長的時間。但若與植物生長周期相比較，卻大大地縮短生產周期。一般植物從發芽生長到收獲，短則幾個月，長則數年或更長時間。例如：木瓜一般需要8個月，紫草要5年，野山參就更長時間了。

3．易于管理，減輕勞動強度植物細胞發酵在人工控制的條件下進行工業化生產，不受地理環境和氣候條件等的影響，易于操作管理，大大地減輕了勞動強度，改善了勞動條件。第五節動、植物細胞發酵產酶

4．提高產品質量植物細胞發酵生產的產物比較單一，主要產物濃度較高，加上在工廠生產，可以減少環境中各種有害物質（如農藥、農肥）的污染以及微生物、昆蟲等的侵蝕，產品易于分離純化，從而提高產品質量。然而植物細胞與微生物相比，存在對剪切力敏感和發酵周期長的缺點，由此引起的一系列問題有待研究解決。第五節動、植物細胞發酵產酶表3-3植物細胞發酵產物第五節動、植物細胞發酵產酶三、植物細胞發酵產酶的工藝條件控制

1．植物細胞生長和發酵所使用的培養基植物細胞生長和發酵培養基與常用的微生物培養基有較大差別。最主要的不同點在于：（1）植物細胞生長和發酵需要大量的無機鹽，除了P、S、K、Ca、Mg等大量元素外，還需要有B、Mn、Zn、Mo、Cu、Co、I等微量元素。（2）植物細胞需要多種維生素和植物激素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇以及激動素、奈乙酸、2，4—D（2，4—二氯苯氧乙酸）等。（3）植物細胞要求的氮肥源一般為無機氮源，如硝酸鹽和銨鹽。（4）植物細胞一般以蔗糖為碳源。現將植物細胞培養中經常采用的MS培養基和B5培養基的組