1、雙水相萃取的應用two aqueous phase extraction 主講人：宋孟嬌1組員：于寶云 劉 紅 高健云 李 洋 王立華 劉永花 孫 越 陳美靜 李志鵬2雙水相萃取雙水相系統：因兩種水溶性聚合物水溶液或一種水溶性聚合物的水溶液與鹽溶液混合時的不相容性而形成有明顯界面的兩相系統。特點：因使用的溶劑是水，因此稱為雙水相，在這兩相中水分都占很大比例(8595)，活性蛋白或細胞在這種環境中不會失活，但可以不同比例分配于兩相，這就克服了有機溶劑萃取中蛋白容易失活和強親水性蛋白難溶于有機溶劑的缺點。3雙水相萃取可分離多肽、蛋白質、酶、核酸、病毒、細胞、細胞器、細胞組織，以及重金屬離子等，近年

2、來，還應用于一些小分子，如抗生素、氨基酸和植物的有效成分等的分離純化。作為反應系統用于酶反應，生物轉化，發酵的產物生產與分離的集成。4萃取原理 雙水相萃取與水-有機相萃取的原理相似,都是依據物質在兩相間的選擇性分配。當萃取體系的性質不同時,物質進入雙水相體系后,由于表面性質、電荷作用和各種作用力(如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等) 的存在和環境因素的影響,使其在上、下相中的濃度不同。物質在雙水相體系中分配系數K可用下式表示： K= C2/ C1其中K為分配系數，C2和C1分別為被分離物質在上、下相的濃度。 5可形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙醇(PEG)/葡聚糖(Dx)，聚丙二醇/ 聚乙二醇和甲基

3、纖維素/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除雙聚合物系統外，聚合物與無機鹽的混合溶液也可形成雙水相，例如，PEG/磷酸鉀(KPi)、PEG/磷酸銨、PEG/硫酸鈉等常用于生物產物的雙水相萃取。PEG/無機鹽系統的上相富含PEG，下相富含無機鹽。雙水相體系7常用的雙水相體系是聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx) 體系和PEG/磷酸鹽體系。PEG/Dx體系一般用于小規模地分離生物大分子、膜、細胞等，PEG/無機鹽體系主要用來大規模地提純酶，這是因為PEG/無機鹽體系的萃取專一性更高，葡聚糖價格昂貴的緣故。8雙水相萃取的基本特點(1) 體

4、系有生物親和性。兩相中的水分含量通常高達85%95% ，所用的聚乙二醇PEG、葡聚糖dextran等高聚物或磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽對蛋白質、核酸等生物活性物質無毒害，甚至還有穩定保護作用，而且相界面張力比水-有機或有機-有機兩相體系的界面張力要小13 個數量級。由于生物活性物質在有機溶劑中易變性，再加上有的生物活性物質親水性很強，不溶于有機溶劑，有機溶劑萃取等分離技術難以在生物活性物質的分離中發揮其效能。10(2) 與常用的親和層析相比，雙水相萃取能夠在較少的溶液量和較短的操作時間內獲得較高產量的產品。另外，操作能夠容易、精確地按比例放大，非常適合大規模應用，可進行連續生產。而親和層析由于操作

5、難于放大，應用受到限制。(3) 聚合物的濃度和分子質量、無機鹽的種類和濃度、pH 以及溫度等均能影響被分配物質在兩相間的分配，所以操作容易進行控制，進而達到目的產物的最佳萃取條件。(4) 可與細胞破碎相結合，即細胞懸浮液中加入PEG和無機鹽后再通入珠磨機進行破碎，然后用離心機分相。既節省了萃取設備和時間，又避免了胞內酶的損失。11(5) 能進行萃取性的生物轉化。在一些雙水相體系中可將發酵生產過程中的生物轉化與下游處理的第1步相結合，即生物反應在其中一相中進行，同時生成的反應產物被連續萃取到另一相中。不僅解決了產物反饋抑制作用造成的產量低的問題，而且酶在高聚物溶液中比在緩沖液中更穩定，活性更大。

6、因為生物反應和生物產物的提取同時進行，尤其適于連續生產。12雙水相萃取技術:雙水相萃取技術是一種高效溫和的新分離技術,在生物制藥、分析檢測、稀有金屬分析等方面均有應用,特別是在生化分離工業中,比傳統的萃取方法有著更加明顯的技術和條件優勢。14雙水相萃取技術的應用雙水相萃取在生物和食品工業等領域的研究和應用發展較快。到目前為止，雙水相萃取應用及研究主要集中在以下幾個方面：(1) 提取酶和蛋白質。這是雙水相體系研究和應用最多的方面，發酵液、細胞培養液、植物、動物組織中細胞內、外的酶和蛋白質均可用雙水相體系來提取。工業上已有幾種雙水相體系用于從發酵液中分離提取蛋白質和酶，絕大多數是用PEG作上相成相

7、聚合物，葡聚糖、鹽溶液和羥甲基淀粉的其中一種作下相成相物質。15(2) 進行萃取性生物轉化。應用實例有：利用葡萄糖和淀粉生產乙醇、利用葡萄糖生產丙酮丁醇、利用淀粉和纖維素水解生產葡萄糖、水解酪蛋白、發酵生產乳酸、將青霉素G轉化為6-氨基青霉烷酸等。(3) 食品工業中用來從酸水解產物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等風味物質。在生物技術方面，可用來提取DNA。(4) 萃取細胞、細胞器、膜等粒子。大多數都是用親和萃取方法來達到目的的。(5) 應用于液- 液分配層析(LLPC)。將一種聚合物連接在固體顆粒(支持物) 上，另一種聚合物的溶液作為流動相，這種柱層析技術可分離蛋白質、核酸以及細胞混合物。17（)

8、 應用于金屬離子分離中：傳統的金屬離子溶劑萃取方法存在著溶劑污染環境、對人體有害、運行成本高、工藝復雜等缺點。近年來，利用雙水相技術萃取分離金屬離子達到了較高的水平。 用雙水相技術直接從發酵液中將丙酰螺旋酶素與菌體分離后進行提取，可實現全發酵液萃取操作，采用PEG/Na2HPO4體系，最佳萃取條件是PH=8.08.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小試收率達69.12，對照的乙酸丁酯萃取工藝的收率為53.14%。18()中草藥中有效成分的提取：近年來有關雙水相提取天然藥物中有效成分的報道逐年增多。以乙醇-磷酸氮二鉀-水雙水相體系萃取甘草有效成分，在最佳條件下，分配系數 (

9、K)達12.8， 收率(Y)高達98.3%。用雙水相萃取體系富集分離銀杏葉浸取液的研究，也有良好的分配系數和分離效果。 中藥中含有大量的有機化合物且成分十分復雜，提高中草藥中有效成分提取及分離技術對我國中醫中藥進入國際市場有很大的促進作用。中草藥有效成分分子中多具有疏水性結構，因此雙水相萃取技術在中草藥有效成分分離純化中具有一定的應用價值。 19案例利用聚乙二醇(PEG)-硫酸銨(NH4)2SO4雙水相體系從酸性溶液中萃取分離金。試驗考察了萃取體系中的pH值、PEG和(NH4)2SO4的質量分數、PEG的聚合度、萃取溫度等條件對萃取率的影響;經過三級萃取,金萃取率達到97.56%,富集金的PE

10、G相無需反萃取可直接用Zn置換出單質金,還原率達到95.16%。雙水相萃取為回收廢棄印刷線路板中的金提供了一種新的可行方法。20不同的雙水相體系對天冬氨酸轉氨酶的萃取分離效果，對聚乙二醇/無機鹽成相系統進行丁系統的研究，確定PEG1000/NazHP04為研究體系，并考察體系pH值、無機鹽對雙水相體系分配系數和純化系數的影響。當PEG 1000的質量分數為18%, NazHP04的質量分數為20%時，雙水相體系對天冬氨酸轉氨酶的分離系數和純化系數分別為2.36和2.94 021對三種雙水相體系進行研究，通過制作相圖，分析得出PEG（/NH4）2SO4雙水相體系是萃取糖化酶最合適體系。研究PEG

11、分子量、PEG溶液濃度、（NH4）2SO4溶液濃度對糖化酶分配系數、回收率影響，確定萃取糖化酶最佳條件，即PEG分子量為20 000、PEG溶液濃度為28%、（NH4）2SO4溶液濃度為20%時，分配系數為0.15，糖化酶回收率最高為96.1%。 22用雙水相萃取法從工業粗酶粉中分離純化淀粉酶。實驗表明，由21%22%PEG400和14%17%(NH4）2SO4所組成雙水相體系，在室溫下對淀粉酶的酶活回收率可達94.84%，分配系數可達17.1。另外，還有雙水相萃取果膠酶、無花果蛋白酶、粗狀假絲酵母脂肪酶等研究，也都取得滿意結果 24運用雙水相技術分離提取鈍頂螺旋藻中藻藍蛋白，對構成雙水相體系

12、中不同分子量PEG和酒石酸鉀鈉濃度影響進行分析。確定雙水相組成體系為16%PEG2000和25%酒石酸鉀鈉、pH值為6.0，在此體系中藻藍蛋白主要分布在上相，最高純度3.69、分配系數20.7、回收率94.56%。多次雙水相萃取有利于藻藍蛋白純度提高，3次雙水相萃取后，藻藍蛋白純化倍數達4.15。25親水性離子液體四氟硼酸1丁基3甲基咪唑（BmimBF4）和NaH2PO4制備雙水相體系，萃取分離莧菜紅。結果表明：NaH2PO4加入量為22.5 g、離子液量為1.02.0 ml、莧菜紅溶液量為1.5 ml、溶液pH值46時，離子液體雙水相體系對莧菜紅具有較高萃取率（90%）。 27用聚乙二醇硫酸

13、銨雙水相體系分離常見食用色素葉綠素銅鈉鹽（SCC），總量為50 ml、10%SCC溶液體積為1.0 ml、聚乙二醇濃度為30%、硫酸銨10.0 g、表面活性劑Triton X100 1.0 ml，在中性或微堿性條件下，常見離子不干擾SCC萃取，萃取率達97.98%。28利用乙醇/硫酸銨組成雙水相體系測定糧食中鉬含量。該法利用乙醇增敏作用提高體系吸光度，消除常見離子鐵干擾，具有較高選擇性和靈敏度。在乙醇硫酸銨雙水相體系中，所形成 糧食與油脂乙醇相對鉬與水楊基熒光酮紅色絡合物具有增敏作用，方法檢出限（3S/N）為0.06 mg/L，回收率為97.4%100.1%。 29甘草是一種應用價值很高的中草

14、藥，甘草的主要成分是具有甜味的皂苷甘草皂苷。基于與水互溶的有機溶劑和鹽水相的雙水相萃取體系具有價廉、低毒、較易揮發等特點，采用與水互溶的有機溶劑的新型雙水相體系萃取研究從甘草中提取甘草酸鹽的新工藝，結果提取甘草酸鹽的最佳溶劑為乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系，此體系的兩相分配完全，分配系數達12.8，收率為98.3%。此雙水相體系具有無需反萃取和避免使用黏稠水溶性高聚物等特點，易回收、易處理、操作簡便。30中藥黃芩是一種療效確切的傳統中藥，黃芩苷是黃芩主要有效成分,通過采用非離子表面活性劑聚乙二醇-磷酸氫二鉀-水雙水相體系分離純化黃芩苷，萃取率為98.6%。此方法所形成雙水相體系操作簡便，萃取率高，

15、方法重復性好，可適用工業化生產。31采用微膠囊與雙水相聯合萃取技術提取柑桔精油。通過調整-環糊精和硫酸鈉的濃度比，可有效控制囊化萃取物中柑桔精油的質量，總收率高達96%以上。將微膠囊技術和雙水相萃取技術相結合用于提取柑桔精油，不僅能提高柑桔精油的提取率和純度，而且還能避免提取過程中的高溫、氧化、聚合等情況的發生，有效地保護柑桔精油的天然組分。32雙水相萃取提純白黎蘆醇 首先進行了雙相體系的選擇，然后考察雙相萃取虎仗的提取也結果和有機溶 劑萃取虎仗提取液的結果。兩種體系萃取結果比較后得出：雙相萃取時白藜蘆醇的 損失率為7.72%。稍高于有機溶劑萃取的損失率5.81%，但是雙相萃取中白藜蘆醇含 量

16、達34.29%，其含量高出有機溶劑萃取的5.81%。因此雙水相體系可替代氯仿/水體 系對虎仗提取液進行初步分離，方便產品進一步的富集。 33雙水相萃取是一項可以利用不復雜的設備，并在溫和條件下進行簡單的操作就可獲得較高收率和純度的有效成分的新型分離技術。目前利用雙水相萃取技術從食品及發酵工業生物材料中提取有效成分的研究已經引起了人們的重視。由于這些生物材料中所含的化合物眾多，而雙水相萃取技術具有較高的選擇性和專一性，因此，利用這項技術有希望為從食品及發酵工業生物材料中提取有效成分開辟了一條嶄新的思路。雙水相萃取技術工業應用上的問題34但是,雙水相萃取技術目前仍不是十分成熟,理論及技術均存在一定

17、的問題。盡管雙水相體系的分配機制已成為研究重點,但并未徹底清楚; 體系的物理、化學性質還未完全了解,導致難以達到最佳萃取條件,因而應用有限。成相聚合物價格昂貴是阻礙該技術應用于工業生產的主要因素。葡聚糖是醫療上的血漿代用品，價格很高，用粗品代替精制品又會造成葡聚糖相粘度太高，使分離困難。35新型雙水相系統的開發： 在生物物質分離過程中得到應用的雙水相系統有2類：非離子型聚合物/非離子型聚合物/水系統和非離子型聚合物/無機鹽/水系統。因為這2類系統所用的聚合物無毒性, 己被許多國家的藥典所收錄, 而且其多元醇、多元糖結構能使生物大分子穩定。五、雙水相萃取技術進展及展望36 但在實際應用中,這2類

18、雙水相系統各有優缺點, 前者體系對生物活性物質變性作用低, 界面吸附少, 但是所用的聚合物如葡聚糖價格較高, 而且體系黏度大, 影響工業規模應用的進展；后者成本相對低, 黏度小, 但是由于高濃度的鹽廢水不能直接排入生物氧化池, 使其可行性受到環保限制, 且有些鹽對敏感的生物物質會在這類體系中失活。37 因此, 尋求新型雙水相體系成為雙水相萃取技術的主要發展方向之一, 新型雙水相體系的開發主要有廉價的雙水相系統及新型功能雙水相系統。廉價雙水相系統的開發目前主要集中在尋找一些廉價的高聚物取代現用昂貴的高聚物, 如采用變性淀粉、麥芽糊精、阿拉伯樹膠等取代葡聚糖, 羥基纖維素取代PEG等。38對新型雙水相系統的探索有：PEG/UCON(乙烯基氧與丙烯基氧共聚物的商品名）/水體系、UCON/水體系、EOPO環氧乙烷(EO)和環氧丙烷(PO)的隨機共聚物簡稱EOPO/羥基淀粉/水體系和EOPO/水體系等。這些體系分相的依據仍是聚合物之間的不相溶性, 但此性質與特定的臨界溫度有關。此類雙水相系統也被稱作熱分離型雙水相系統, 它們的優點之一是聚合物易于回收可實現循環利用。3940參考文獻1呂斌，陳有容，陳舜勝.雙水相萃取技術及其