1、實驗十七 單細胞凝膠電泳技術丁書茂單細胞凝膠電泳技術丁書茂1ppt課件實驗十七 單細胞凝膠電泳技術丁書茂1ppt課件單細胞凝膠電泳技術(single cell gel electrophoresis, SCGE) ，也稱彗星試驗(comet assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次提出，后經Singh等進一步完善的一種在單個細胞水平上檢測DNA損傷、交聯和修復的方法。因其簡單、靈敏、低耗、快速等優點而廣泛應用于生物檢測、遺傳毒理、流行病學調查等諸多方面。2ppt課件單細胞凝膠電泳技術(single cell gel elec一、實驗原理DNA鏈多為磷酸復合物，在生理條件

2、下DNA的多聚核酸鏈多呈陰離子狀態，當外源性因素（如紫外照射）造成DNA鏈斷裂時，負超螺旋結構變得松散，那么在電場作用下DNA就會以一定速率向正極移動。在細胞裂解液作用下，細胞膜、核膜等結構受到破壞，胞內蛋白質、RNA及其它成分均擴散到溶液中，而核DNA由于分子量大而只能留在原位。3ppt課件一、實驗原理DNA鏈多為磷酸復合物，在生理條件下DNA的多聚經堿處理和在堿性電解質的作用后，DNA解旋，損傷的DNA斷鏈及其片段會被釋放出來，而在電泳條件下， DNA片段可進入凝膠孔隙發生遷移。由于這些DNA分子量很小，所以在電泳過程中會離開核DNA向正極移動，形成彗星狀的圖像。在一定條件下，DNA遷移距

3、離和DNA含量分布與DNA損傷程度呈線性相關。隨著DNA損傷程度加劇，斷片數目增加，表現為尾部DNA含量增加，彗尾延長，熒光強度加強。4ppt課件經堿處理和在堿性電解質的作用后，DNA解旋，損傷的DNA斷鏈二、實驗流程采用堿性SCGE，其基本操作過程包括：5ppt課件二、實驗流程采用堿性SCGE，其基本操作過程包括：5ppt課1.細胞制取取處于對數生長期的Hela細胞，吹打為單細胞懸液，用PBS調節細胞密度為105-106 個/ml。6ppt課件1.細胞制取取處于對數生長期的Hela細胞，吹打為單細胞懸液2.細胞染毒染毒組：取1ml細胞懸液加入10-3 M H2O2 溶液50l ，混勻，37

4、水浴30min；陰性對照組：取1ml細胞懸液加入50l PBS緩沖液，同等條件下水浴30min。7ppt課件2.細胞染毒染毒組：取1ml細胞懸液加入10-3 M H2O3.制片第一層膠：在完全磨毛的載玻片上鋪180L質量分數為 1%的正常熔點瓊脂糖(NMA)，室溫固化10min；可將玻片用吹風機稍微加熱，以延緩瓊脂糖凝固。 8ppt課件3.制片第一層膠：在完全磨毛的載玻片上鋪180L質量分數為第二層膠：取50L 質量分數為0.8%的低熔點瓊脂糖（LMA）和30L的細胞懸液，混勻后滴加于第一層膠上，加該蓋片使其均勻鋪開，4凝固10min； 9ppt課件第二層膠：取50L 質量分數為0.8%的低熔

5、點瓊脂糖（LM第三層膠：移開蓋片，滴加100L質量分數為0.5%的LMA于第二層膠上，加蓋片， 4凝固10min。 10ppt課件第三層膠：移開蓋片，滴加100L質量分數為0.5%的LMA4. 裂解將制好的凝膠放入冷的裂解液中，4下裂解2小時；裂解液使用時新配(鋪完第二層膠后即可配制) 90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml Triton-X10011ppt課件4. 裂解將制好的凝膠放入冷的裂解液中，4下裂解2小時；15. 解旋從裂解液中將載玻片取出，在蒸餾水中洗去過多鹽，晾干。將新配制的電泳緩沖液倒入電泳槽中，約覆過載玻片0.25cm，蓋上蓋子，在高pH電泳緩沖液

6、中放置20 min以便DNA解螺旋。12ppt課件5. 解旋從裂解液中將載玻片取出，在蒸餾水中洗去過多鹽，晾干6. 電泳室溫下調節緩沖液液面高低，于20V，200mA下電泳20min。 13ppt課件6. 電泳室溫下調節緩沖液液面高低，于20V，200mA下電7. 中和將凝膠浸入0.4M Tris緩沖液（pH7.5）中，浸洗 30min。14ppt課件7. 中和將凝膠浸入0.4M Tris緩沖液（pH7.5）中8. 染色觀察用20g/L的吖啶橙染色35min，用雙蒸水洗掉表面的染料，24小時內在熒光顯微鏡下觀察。 15ppt課件8. 染色觀察用20g/L的吖啶橙染色35min，用雙蒸 三 結果觀察16ppt課件 三 結果觀察16ppt課件17ppt課件17ppt課件18ppt課件18ppt課件四 注意事項實驗操作均在紅光或暗處條件下進行，以避免造成DNA的額外損傷。關鍵步驟是鋪膠，尤其是第一層膠，一定要平整，均勻。若有氣泡，用下一層膠填平。配制裂解液時，DMSO為致癌劑，注意安全。用去尖的槍頭取Triton-X10019ppt課