1、多維NMR基本原理及蛋白質分子溶液結構與功能的NMR研究多維NMR基本原理部分核磁共振技術發(fā)展史概述1946年 E. M. Purcell和 F. Bloch發(fā)現核磁共振(NMR)現象1965年前后 脈沖傅里葉變換NMR技術興起1971年 J. Jeener提出二維NMR 方法80年代中 K. Wuthrich發(fā)展了運用同核二維核磁共振方法 進行蛋白質NMR譜圖的序列識別方法80年代末 遺傳工程技術迅速發(fā)展，13C 和15N同位素標記 樣品大量制備，A. Bax等人提出異核二維核磁共 振方法90年代初 三維和四維異核核磁共振方法迅速發(fā)展，750 MHz (1993年) 和800 MHz (19

2、95年)高場核磁共 振波譜儀問世現在 900MHz核磁共振波譜儀已大量使用，并已可確 定分子量大于3.6 KDa的蛋白質溶液三維結構一、 NMR簡介核磁共振方法簡介核磁共振是在二十世紀四十年代被發(fā)現的一種物理現象。在六十年的科學技術發(fā)展歷程內，核磁共振方法在生物學、化學、物理學、藥學、醫(yī)學以及化學工業(yè)、食品工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)等方面顯示了極大的生命力，成為研究分析各種物質及其性能的重要邊緣學科。在溶液高分辨核磁共振研究中，八十年代以來，由于遺傳工程和基因工程技術的迅速發(fā)展，使得蛋白質分子得以在體外大量表達，解決了蛋白質大分子樣品的制備問題，促使溶液高分辨核磁共振實驗方法朝多維核磁共振方向發(fā)展。因而，

3、目前已可用來確定分子量大到4萬的蛋白質分子的溶液三維空間結構。為我們在接近生理條件下，在溶液三維結構的基礎上研究蛋白質結構與功能的關系提供了重要的研究手段。 NMR方法的研究特點 在運用核磁共振方法分析物質時，物質分子中的原子核尤如一個精細的探針，允許核磁共振方法在分子、原子水平上探測物質，使我們得以深入了解物質的微觀特性變化。NMR是在分子、原子水平上檢測物質特性。原子核作為NMR的一個精細的探針探測物質的微觀特性變化。NMR研究不損傷蛋白質樣品。NMR可以檢測包括化學反應，構象變化等動力學過程。 二、二維NMR基本原理NMR波譜1D NMR: F( t )F( f ) 2D NMR: F(

4、 t1, t2 )F( f1, f2 ) 3D NMR: F( t1, t2 , t3 ) F( f1, f2, f3 ) 4D NMR: F( t1, t2 , t3 , t4 ) F( f1, f2, f3, f4 ) 一維 1H NMR波譜三維 NMR波譜三維 NMR波譜的某一截面 三維 NMR波譜三維 NMR波譜的不同截面 三維 NMR波譜3JHNH 10HZ , 建立3JHNH 10HZ , 建立antiphase 時間 (t 1/2J): 50ms3JNHN 92HZ , 5.5ms3JHC 145HZ , 3.4ms蛋白質分子量較大時，1H共振線寬 20 HZ，磁化矢量壽命時間

5、25ms 多維NMR實驗的靈敏度Sensitivity e3/2(1-e-/T1)1H-13C1H-15NH/X410XX3/211(normalize)HX3/2410XH3/2830HH3/232300三、多維核磁共振實驗檢測核 的化學位移范圍Range of Chemical Shifts of 1H, 13C, 15N Resonances1H Chemical Shifts:1HN: 6.0 11.0 ppm1H: 2.5 6.0 ppm1H: 2.0 4.5 ppm 1H,: 1.0 3.0 ppmCH3: 0.0 1.5 ppm1H (aromatic ring): 6.5 7.

6、8 ppm15N Chemical Shifts:15N (amide): 101 139 ppm 40 ppm 15N (Histidine side chain): 165 222 ppm15N (other side chain): 110 115 ppm, & 108 ppm四、二維核磁共振波譜實驗與分析基本的多維NMR實驗多維NMR實驗脈沖序列設計 (1) 在準備期生成所需的自旋磁化矢量；(2)在其后的演化期，該磁化矢量發(fā)生隨時間的演化，從頻域看相當于進行特征共振頻率的標記；(3)在混合期發(fā)生相干傳遞，這是建立不同磁化矢量間聯系的關鍵；(4)在采樣期，采樣獲得的FID信號經多維Fou

7、rier變換及相關的處理就得到多維譜圖。其中每一個時期都可以包括一個或多個脈沖和延時。二維同核NMR實驗二維1H-1H 核磁共振基本實驗：COSY:建立 a.a.殘基內標量耦合1H核自旋 間的化學位移關聯 1H 之間通過二鍵或者三鍵形成交叉峰TOCSY:建立a.a.殘基內1H核自旋 間的化學位移全關聯 1H 之間通過接力傳遞跨鍵產生交叉峰NOESY:建立a.a.殘基內或者殘基之間，偶極耦合1H 之間的NOE相關 兩個1H 之間空間距離小于或者等于5 時，產生NOE交叉峰20種氨基酸殘基的結構示意圖除了脯氨酸(Pro)和甘氨酸(Gly)，每個氨基酸殘基都各包含一個1HN 和1H 20種氨基酸殘基

8、自旋系統的NMR分布示意圖20種氨基酸殘基1H 共振峰分布范圍示意圖20種氨基酸殘基1H 交叉峰分布示意圖二維同核NMR實驗脈沖程序實現磁化矢量之間進行同核標量耦合傳遞的核磁共振實驗脈沖程序如下：2D 1H-1H COSY， DQF-COSY，TOCSY， E.COSY實現通過空間偶極耦合相互作用傳遞磁化矢量的核磁共振實驗脈沖程序如下：2D 1H-1H NOESY， ROESY2D 1H-1H COSY實驗原理2D 1H-1H COSY波譜(指紋區(qū), 約612ppm36ppm) 2D 1H-1H COSY波譜 (脂肪鏈區(qū), 約0ppm6ppm)2D 1H-1H NOESY實驗原理2D 1H-1

9、H NOESY波譜(指紋區(qū), 約612ppm36ppm)2D 1H-1H TOCSY波譜(H2O)二維1H-1H NMR波譜的基本分析方法自旋系統指認 (Spin system assignment) 識別波譜中出現的交叉峰屬于哪一類氨基酸殘基 COSY+ TOCSY的綜合分析氨基酸序列指認(Sequential assignment) 識別正確的氨基酸殘基的序列 COSY+ NOESY 波譜的綜合分析確定二級結構(Determination secondary structure) -helix; -sheet; reverse turn; NOE connectivity pattern

10、chemical shift index (1H, 13C)二維同核波譜的譜峰指認步驟首先指認各共振峰所屬的氨基酸類型, 二維COSY和TOCSY譜(在H2O & D2O中)然后指認各共振峰所屬的氨基酸序列位, 二維NOESY和COSY譜(在H2O中)指認產生NOE的兩個1H所屬的氨基酸殘基 二維COSY和TOCSY譜(在D2O中)核自旋系統的指認 (Spin system assignment)比較二維COSY和TOCSY譜(在D2O或H2O中) ，辨別TOCSY交叉峰確定交叉峰圖形所給出的氨基酸類型指認該氨基酸殘基中各1H共振的頻率，即化學位移比較二維COSY和TOCSY(在H2O中)，辨

11、別從1HN到1H形成的交叉峰的TOCSY交叉峰二維同核波譜中氨基酸殘基自旋系統指認舉例氨基酸序列指認 (Sequential assignment)在指紋區(qū)(fingerprint region)作序列識別(sequential assignment )是有方向性的, 即由橫向路徑到縱向路徑(1Hi1HNi+1) 基本規(guī)則為:(1) 由COSY交叉峰橫向引直線，找出在此線上的某一NOESY交叉峰。 該NOESY交叉峰是由前一位氨基酸殘基的1H與后一位氨基酸殘基的1HN之間建立的。是表示氨基酸殘基內的NOE相關。(2) 再由該NOESY交叉峰豎向引直線，找出在此線上的某一COSY交叉峰。(3)

12、由后一個COSY交叉峰重復上述步驟。在1HN1HN區(qū)域作序列識別。氨基酸序列指認示意圖氨基酸序列指認舉例說明二維同核波譜螺旋氨基酸殘基主鏈譜峰指認舉例Chemical shift index (1H) 示意圖二維異核NMR實驗HSQC: 建立a.a.殘基內1H-15N或1H-13C 之間的化學位移相關. 1H與異核（15N或13C）之間通過單鍵1JNH或1JCH形成交叉峰.HSQC-TOCSY: 建立a.a.殘基內1H 之間的化學位移全相關. 1H 之間通過1H-13C 之間的化學位移相關的介導而產生接力交叉峰.HSQC-NOE: 建立a.a.殘基內或者殘基之間，1H 之間的 NOE相關. 1

13、H 之間空間距離小于或者等于5 時，通過1H-15N或1H-13C單鍵1JNH相關的介導而產生NOE交叉峰.二維異核NMR實驗脈沖程序I通道第一個90度脈沖激發(fā)Iz成為Ix；隨后磁化矢量從Ix傳到異核單量子相干2SyIz 兩個t1/2時間內S核發(fā)生隨時間的演化，帶上化學位移的 頻率標記； (I通道180度脈沖回聚了I和S之間的標量耦合，相當于消 除了標量耦合JIS的影響)然后再把磁化矢量傳回I核；在最后采樣期被檢測。2D 1H-15N & 1H-13C HSQC:2D 1H-15N & 1H-13C HSQC-NOE:二維1H-15N &1H-13C HSQC實驗原理2D 1H-15N HSQC波譜2D 1H-15N HSQC-NOE波譜2D 1H-15N HSQC-NOE波譜2D 1H-13C HSQC波譜2D 1H-13C HSQC-NOE波譜2D 1H-13C HSQC波譜二維異核波譜譜峰指認基本方法自旋系統指認 (Spin system assignment) 識別波譜中出現的交叉峰屬于哪一類氨基酸殘基 HSQC + HSQC-TOCSY的綜合分析氨基酸序列指認(Sequential assignment) 識別正確的氨基酸殘基的序