1、引物設計原則及酶切位點選擇和設計整理:最初的時候，由于害怕設計酶切位點最后且不開，所以經常采用最通用的方法，用 T載體克隆解決問題，但后來發現她也有問題，就是濃度提不上去，你需要體大量的載體來 酶切，所以感到還是直接擴增好一點。但這就需要你仔細設計引物。連入質粒中的重要目的就是進行酶切和連接，當然首先就是在想要合成或者是進行PCR擴增出靶基因的時候在核酸的兩端接入酶切位點，酶切位點是與你的質粒的特點相關的， 可以在質粒的圖譜說明書上找取相應的位點，進行設計。（一）設計引物前應做的準備工作：準備載體圖譜，大致準備把片斷插在那個部分對片斷進行酶切分析，確定一下那些酶切位點不能用準備一本所買公司的酶

2、的商品目錄，便于查酶的各種數據及兩種酶是否可以配用 （二）設計引物所要考慮的問題兩個位點應是載體上的，所連接片斷上沒有這兩個位點，且距離不能太近，往往導致兩個酶都切不好。因此，緊挨在一起，只能切一個，除非恰好是與上面兩個酶在一起的酶切位點。 我看promega的說明書上說，最好隔四個。還有一種情況是：不能有堿基的交叉，比如AGATCTTAAG這樣的位點比較難切。 兩個酶切點最好不要是同尾酶（切下來的殘基不要互補），否則效果相當于單酶切。最好使用酶切效率高的。最好使用雙酶切有共同 buffer的酶。最好使用較常用的酶（如 hind3, bamhl, ecorl等），最好使用自己實驗室有的酶，這樣

3、可 以省錢。Tm的計算，關于Tm的問題，很多的戰友都有疑惑。其實園子里有很多的解釋了。Tm叫溶解溫度（melting temperature, Tm ）,即是DNA雙鏈溶解所需的溫度。 大家可以理解， 這個溫度是由互補的 DNA區域決定的，而不互補的區域對 DNA的溶解是沒有作用的。因此， 對于引物的Tm,只有和模板互補的區域對 Tm才有貢獻。計算Tm時，只計算互補的區域（除 非你的酶切位點也與模板互補）。不少戰友設計的引物都 Tm過低，是因為他們誤把保護堿 基和酶切位點都計算到 Tm里了，最后的結果是導致了PCR反應的諸多困難。所以，設計引物的時候，先不管 5端的修飾序列，把互補區的 Tm控

4、制在55度以上（我喜歡控制在 58以 上，具體根據PCR的具體情況，對于困難的 PCR需要適當提高Tm）,再加上酶切位點和保 護堿基，這樣的引物通常都是可用的，即使有小的問題，也可以挽回。Tm溫度高的引物就比較容易克服3 發卡、二聚體及3非特異結合等問題。簡單的計算公式可以用 2+4的公式。 若你計算的Tm值達到了快90 ,不包括酶切位點。引物公司給你發的單子是包括酶切位點 的。自己可以再估計一下。如你設計了帶酶切位點的引物，總長分別為29、33個堿基，去掉酶切位點和保護堿基，分別為17、21個堿基。引物公司給的單子是 70多度，實際用的只有50度，用55度擴的結果也差不多。其它關于Tm值的計

5、算，有用PP5.0進行評價的，需要考慮的參數包括：base number、GC% Tm、hairpin、dimer、false priming cross dimer。退一般退火溫度為 Tm-5 度，退火溫度的計 算可以不把加入的酶切位點及保護堿基考慮進去，如上所言，PCR幾個循環后，引物外側的序列已經參入了擴增片斷中，所以你可以在預變性后多加幾步，溫度比你Tm值低些（這樣可能會增加非特異性），Tm值是你包括酶切位點及保護堿基的Primer計算出來的。1.一般在5端加保護堿基，如果你擴增后把目的條帶做膠回收轉入T-VECTO減者其它的載體的話，酶切時可以不需加保護堿基2.有人的經驗加入酶切位點

6、的引物可以和未加入時使用相同的退火溫度，結果也還是令人滿意。關于引物二聚體，最好用primer或是其他設計引物的軟件進行計算一下，看看引物之間的 G （自由能）的絕對值，如果小于10, 一般是問題的。如果稍大，PCR時可以提高一下退火溫度，一般是沒有問題的。如果3端形成二聚體，并且自由能絕對值較大，如果PCR沒有條帶，建議重新設計引物。 此外，所加的三個核甘酸的保護序列經過盡心設計有時也可以降低二聚體的Go在設計酶切位點時， 最好能盡可能多的利用引物本身的堿基。這是因為，一個特異性引物一般都是20bp左右，再加上酶切位點序列和保護性堿基，大致就是 28bp左右了。而我們在 設計退火溫度時，與引

7、物的長度有關，比正常的引物 （20bp）的Tm肯定要高一些。如果我們 能利用引物自身的部分序列，就可以有效地減少引物的長度。還有，有些酶是離不開末端序列的， 因此，在設計一個酶位點時， 最好把該酶的性質弄清楚 設計時限制性酶切位點是應該在 5端的頂端。在設計引物時，常在 5 端添加酶切位點， 以利于PCR產物連接到載體。設計引物時保證在最后 5個核昔中含有3個A或T。先用軟件設計出合適的引物，引物的3端是引發延伸的起點，因此一定要與模板準確配對，應盡量避免在引物 3端的第一位堿基是 Ao （容易錯配）引物 3端最佳堿基的選擇是 G 和C,因為他們形成的堿基配對比較穩定。目的序列上并不存在的附加

8、序列，如限制位點和 啟動子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當計算引物Tm值時并不包括這些序列， 但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。酶切位點都需要保護堿基以利于內切酶的有效切割。酶切位點前加保護堿基 1,兩個酶切點至少隔上3個堿基，在做載體構建的時候設計引物擴增片段進行定向連接，除了酶切位點， 還要在兩端加一個三個核甘酸的保護序列，否則PCR產物很難被酶切，因此就會導致連接失敗，因為內切酶需要一定的輔助性堿基才能順利切割，在沒有輔助堿基的情況下，有的酶是可以切割的，比如：Sall和SpeI,他們不需要輔助性堿基即可切割，但大部分酶是需要輔助性堿基的。所以引物順序應是：5保護堿基

9、+酶切位點+引物配對區一3下面是幾個戰友的討論，請問：在引物的5 端加限制酶切位點，只在酶切位點的5 端加保護堿基可以嗎？還是必須要在酶切位點的兩側加保護堿基？是的，只要在5端加保護堿基可以了。 其實保護堿基就是要給限制性內切酶一個結合位點， 3 端還有更長的引物序列在，當然不需要再加保護堿基了，下面就來討論一下這個問題：（下面引自NEB網站）1、寡核甘酸近末端位點的酶切為了解不同內切酶對識別位點以外最少保護堿基數目的要求，NEB采用了一系列含識別序列的短雙鏈寡核甘酸作為酶切底物進行實驗。（這里用的是寡核甘酸！ ！而不是末端帶酶切位點的肽鏈！）實驗結果對于確定雙酶切順序將會有幫助（比如在多接頭

10、上切割位點很接近時），或者當切割位點靠近 DNA末端時也很有用。然后 NEB就提供了一個表，關于鏈長和切割效 率的。我覺得這只能說明酶在作用于識別位點時所需占據的鏈長，并不能說明在設計酶切位點時要加那么長的保護堿基，比如我用的NotI,要加10個堿基，切25個小時才95%的效率，這還是用了 20倍的酶量！我師姐只加了 4個堿基，也沒見出現問題。 2、線性載體近末端位點的酶切 將線性載體與相應內切酶（10 units/ g在適宜溫度及緩沖液條件下反應60分鐘，隨后進行連接和轉化。切割效率=100%-（0切產物車t化子數/再連接產物轉化子數近末端堿基對數 ”指的是從識別位點到 DNA末端的堿基對數

11、，但并不包括最初切割位點處留下的單鏈突出堿 基。（解釋一下：就像下面這個例子EcoRI酶切位點NNNG AATTCNNC TTAAG它的近末端堿基對數就是3,而不是4)PCR引物時應至少加上4個額還沒有證據表明單鏈核甘酸能否提高切割效率，因此在設計 外堿基。Not I 7 100 (2) Bluescript SK- Spe I4 100 (1) Bluescript SK-Ksp I1 98 (2) Bluescript SK Xba I拿 NotI酶切位點的設計與保護堿基的選擇EnzymeOligo SequenceChfkrnLengthAXb Cleavage 2 hr 20 hrAc

12、cIGGTCGACC800CGGTCGACCG1000CCGGTCGACCGG1200AflUICACATGTG800CCACATGTGG109090CCCACATGTGGG129090AsciGGCGCGCC89090AGGCGCGCCT109090TTGGCGCGCCAA129090AvalCCCCGGGG8SO90CCCCCGGGGG109090TCCCCCGGGGGA129090BamHICGGATCCG8102sCGGGATCCCG109090CGCGGATCCGCG129090BglllCAGATCTG800GAAGATCTTC107590ggaagatcttcc122590Bss

13、HIIGGCGCGCC800AGGCGCGCCT1000TTGGCGCGCCAA12SO下90BstEUGGGT(A/T)ACCC9010BstXIAACTGCAGAACCAATGCATTGG2200AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA242S50CTGCAGAACCAATGCATTGGATGCAT272590ClalCATCGATG800GATCGATC800CCATCGATGG109090CCCATCGATGGG1250SOEcoRIGGAATTCC89090CGGAATTCCG109090CCGGAATTCCGG12909CHaelllGGGGCCCC89090AGCGGCC

14、GCT109090TTGCGGCCGCAA129090HindlllCAAGCTTG800CCAAGCT1GG1000CCCAAGCTTGGG121075KpnlGGGTACCC800GGGGTACCCC109090CGGGGTACCCCG129090MluIGACGCGTC800CGACGCGTCG102550NcolCCCATGGG800CATGCCATGGCATG145075NdelCCATATGG800CCCATATGGG1000CGCCATATGGCG1200GGGTTTCATATGAAACCC1800GGAA F TC。AT ATGGAA1TCC20/b90GGGAA11ClAFA

15、TgGAAIFcCC227590NhelGGCTAGCC800CGGCTAGCCG101025CTAGCTAGCTAG121050Notl1FGCGGcCgCAA1200ATTTGCGGcCGCT1IA161010AAATATGCGGCCGcTATAAA201010ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTAT242590AAGGAAAAAAGCGGCCGCAAAAGGAAAA282590NsilTGCATGCATGCA121090CCAA1 GCA 1 IGGI ICIGCAG1 1229090Padttaattaa800gttaattaac10025CCTTAATTAAGG12090Pm

16、elgtttaaac800ggtttaaacc10025GGGTTTAAACCC12050AGCTTTGTTTAAACGGCGCGCCGG247590PstIGCTGCAGC800TGCACTGCAGTGCA141010zXAlT gcag aaccaat gcatt gg229090AAAACTGCAGCCAATGCATTGGAA249090CTGcAGAACCAATGCATTGGATGCAT2600PvulCCGATCGG800ATCGATCGAT101025TCGCGATCGCGA12010SadCGAGCTCG81010SadiGCCGCGGC800TCCCCGCGGGGA125090

17、SallGTCGACGTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC2800GCGTCGACGTCTTGGCCATAGCGGCCGCGG301050ACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGG321075SealGAGTACTC81025AAAAG tACl 1 1 1127S75SmalCCCGGG6010CCCCGGGG8010CCCCCGGGGG101050TCCCCCGGGGGA129090SpelGACTAGTC81090GGACTAGTCC101090CGGACTAGTCCG12050CTAGACTAGTCTAG14050SphIGGCATGCC800CATGCATGC

18、ATG12025ACATGCATGCATGT141050StulAAUGCC1r89090GAAGGCCTTC109090AAAAbGCL1ITT129090XbalCTCTAGAG800GCTCTAGAGC109090TGCTCTAGAGCA127590CTAG TL FAGACTAG147s90XholCCTCGAGG800CCCTCGAGGG101025CCGCTCGAGCGG121075XmalCCCCGGGG800CCCCCGGGGG102575CCCCCCGGGGGG125090TCCCCCCGGGGGGA1490901酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrNot ITTGCGG

19、CCGC AA00Alli GCGGCCGC IIIA1010AAATAT GCGGCCGC TATAAA1010ATAAGAAT GCGGCCGC TAAACTAT2590AAGGAAAAAA GCGGCCGC AAAAGGAAAA2590Nsi ITGC ATGCAT GCA1090CCA ATGCAT TGGTTCTGCAGTT9090Pac ITTAATTAA00GTTAATTAA C025CC TTAATTAA GG090Pme IGIIIAAAC00GGIIIAAAC C025GGGmAAAC CC050AGdU GUTAAAC GGCGCGCCGG7590Pst IGCTGCAG

20、 C00TGCA CTGCAG TGCA1010AACTGCAG AACCAATGCATTGG9090AAAA CTGCAG CCAATGCATTGGAA9090CTGCAG AACCAATGCATTGGATGCAT00Pvu ICCGATCG G00ATCGATCG AT1025TCG CGATCG CGA010Sac ICGAGCTC G1010Sac IIGCCGCGG C00TCC CCGCGG GGA5090Sal IGTCGAC GTCAAAAGGCCATAGCGGCCGC00GC GTCGAC GTCTTGGCCATAGCGGCCGCG1050GACGC GTCGAC GTCGG

21、CCATAGCGGCCGCGGAA1075Sca IGAGTACT C1025AAAAGTACT TH7575Sma ICCCGGG010CCCCGGG G010CC CCCGGG GG1050TCC CCCGGG GGA9090Spe IGACTAGT C1090GG ACTAGT CC1090CGG ACTAGT CCG050CTAG ACTAGT CTAG050Sph IGGCATGC C00CAT GCATGC ATG025ACAT GCATGC ATGT1050Stu IAAGGCCT T9090GAAGGCCT TC9090AAAAGGCCI III9090Xba ICTCTAGA

22、 G00GC TCTAGA GC9090TGC TCTAGA GCA7590CTAG TCTAGA CTAG7590Xho ICCTCGAG G00CC CTCGAG GG1025CCG CTCGAG CGG1075Xma ICCCCGGG G00CC CCCGGG GG2575CCC CCCGGG GGG5090TCCC CCCGGG GGGA9090酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hrAcc IGGTCGAC C00CG GTCGAC CG00CCG GTCGAC CGG00Afl IIICACATGT G00CC ACATGT GG9090CCC ACATGT GGG9090Asc IGGCGCGCC9090AGGCGCGCC T9090TTGGCGCGCC AA9090Ava ICCCCGGG G5090CC CCCGGG GG9090TCC CCCGGG GGA9090BamH ICGGATCC G1025CG GGATCC CG9090