1、納他霉素的發(fā)酵生產(chǎn)、分別純化及檢測組員：*生物工程【摘 要】7d 得到該菌孢子再將其接種到種子培育基中得到600mL 分 6 個搖瓶裝的發(fā)酵培育基中進(jìn)展納他霉素發(fā)酵，得到了納他霉素產(chǎn)物 0.08g，并在整個試驗過程定時鏡檢觀看菌體形態(tài)變化及測量發(fā)酵密，發(fā)酵后期菌體大而疏松。【關(guān)鍵詞】納他霉素；發(fā)酵；純化；鏡檢油黃色結(jié)晶粉末，幾乎無臭無味，溶點280，分子式C H 0 ,相對分子質(zhì)量 665.75。納他33 47 13霉素是一類兩性物質(zhì)，分子中有一個堿性基團(tuán)和一個酸性基團(tuán)，等電點為6.5，其在水中和極性有機(jī)溶劑中溶解度很低，不溶于非極性溶劑，室溫下在水中的溶解度為 3050mg/L，引起的疾病的

2、治療等。試驗材料與方法材料：發(fā)酵菌種：褐黃孢鏈霉菌培育基：4g/L10 g/L4 g/L，瓊脂 20 g/L；pH7.015 g/L10 g/L10 g/L；pH7.019.5 g/L50 g/L4 g/L 6g/L，pH7.0試驗試劑：酵母提取粉，葡萄糖，瓊脂，蛋白胨，氯化鈉，大豆分別蛋白，麥芽糊精， 酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化劑BHA，1，2-丙二醇，納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品；試驗儀器：250mL 三角瓶，搖床，生化培育箱，離心機(jī)，紫外分光光度計。方法：121滅菌 15min,擺斜面冷卻后3712d，備用，用斜面轉(zhuǎn)接收接種，2510d，待孢子長滿后，放置冰箱5d200mL，平分裝

3、在兩個三角錐瓶中，12125min529，200r/min24h，無菌取樣，涂片觀看種子菌球形態(tài)，并顯微拍照。搖瓶發(fā)酵：按搖瓶發(fā)酵培育基配方準(zhǔn)確配培育基600mL, 平分裝在 612125min1mL29，200r/min120168h24h1mL303nmOD態(tài)，并顯微照相。OD48h24h0.5mL3034.5mL1h，12022r/min10min0.5mL4.5mL蒸餾水，搖勻，用紫外分光光度計在波長303nm 處測定光密度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：取50mg 納他霉素，溶于100mL 丙二醇，得濃度為500ug/mL1OD 的值要求303相關(guān)系數(shù)R20.99產(chǎn)物濃度計算公式為：納他霉素含量m

4、g/L=X100n式中，X 為將所測樣品的濃度，100 為樣品處理時兩次稀釋倍數(shù)之積；1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線工作表管號123456工作溶液濃度/(ug/mL)01020304050納他霉素原液/mL 添加量00.81水/mLOD30310CK9.291.2.5 12022r/min 離心 10min。離心前發(fā)酵液的95%乙醇，20%氫氧化鈉調(diào)pH110.，邊加邊攪拌0.5留意肯定要調(diào)過pH后再計時，以便納他霉素充12022r/min 10min，保存上清液，將上清液用1mol/L 鹽酸調(diào) pH6.5，靜置3冰箱，以便納他霉素在等電點處沉淀析出；最終再12022

5、r/min離心10mi，保存沉淀產(chǎn)物，將產(chǎn)物置于5真空枯燥2，稱重。試驗結(jié)果與分析標(biāo)準(zhǔn)曲線制作結(jié)果：1 6 1mL 再4mL 5 倍OD 2 所示：表2納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)管號123456工作溶液濃度/(ug/mL)01020304050納他霉素原液/mL 添加量00.81水/Ml9.29實際工作溶液濃度/(ug/mL)0246810OD30300.1370.2990.4170.5560.6691 所示：圖1圖1 納他霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線 0.53030.4O0024681012納他霉素濃度ug/mL)如表3 所示表3定時測量

6、OD 值數(shù)據(jù)表培育時間/h487296144測得OD3030.0820.1030.1850.256納他霉素濃度ug/mL1.0801.3922.6083.662菌體鏡檢結(jié)果:斜面菌鏡檢圖片:圖2斜面菌落圖片圖3斜面菌40 倍鏡檢圖圖4斜面菌100 倍鏡檢圖局部 如圖3、圖4 可看到，此時接種到種子培育基前的菌體形態(tài)較小，需在100 倍鏡下才能看到，菌絲多分裂成芽孢，菌絲量少；由圖中可以看到有大量芽孢的存在，所以接種斜面以獲得菌體芽孢的目的已到達(dá)，可以進(jìn)展種子培育基接種了。24h 后菌體的鏡檢照片:圖5種子菌40 倍鏡檢圖圖6種子菌100 倍鏡檢圖5 可看到，此時很多芽孢已長成了菌體，菌體數(shù)量增

7、多，菌體形態(tài)由圖6 可以看到此時菌體還比較小，但長成了四周有輻射狀生長的短菌絲，中間一小部份實心；48h 鏡檢結(jié)果:圖7 發(fā)酵48h 10倍鏡檢圖圖8 發(fā)酵48h 40倍鏡檢圖9 48h 40 倍鏡檢圖局部7 10 在數(shù)量上也增加了很多；由圖8、圖 9 可看到，此時菌體形態(tài)多為菌球形，即中間有一略呈 是作裝片時打碎的；72h 鏡檢結(jié)果:圖10發(fā)酵72h 10倍鏡檢圖圖11發(fā)酵72h 40 倍鏡檢圖圖12發(fā)酵72 h 40 倍鏡檢圖局部10 72h 48h 1112 可看48h 時變大了，中部更致密周邊菌絲更多更長了；96h 鏡檢結(jié)果:圖13發(fā)酵96h 40 倍鏡檢圖圖14發(fā)酵96h 40 倍鏡

8、檢圖局部由圖13、圖14 可以看到，此時菌體較48h 時也變大了，但中間原來致密的局部現(xiàn)變得較松散了，菌體在形態(tài)上也從略呈圓形變也了不規(guī)章狀144h 鏡檢結(jié)果:圖15發(fā)酵144h 10 倍鏡檢圖圖16發(fā)酵144h 40 倍鏡檢圖局部 由圖15 可看到，此時菌體數(shù)削減了，單個菌體變大了，其具體構(gòu)造由圖16 可看到菌體周邊有大量的菌絲密密麻麻的中部較邊上致密，此時的菌絲多而細(xì)；納他霉素分別純化結(jié)果：4 所示:表4產(chǎn)物分別純化結(jié)果發(fā)酵液總體積/mL535.0離心后上清液體積/mL497.0濕菌泥體積/mL38產(chǎn)物干重/g0.084 0.08g3 OD 值得到3.662 ug/mL，由此算出理論上的產(chǎn)

9、物量為：3.662535.0=1959.17ug0.02g產(chǎn)物不純的最有可能的一個操作環(huán)節(jié)是在往離心得的濕菌泥加兩倍95%乙醇并調(diào)pH 充分?jǐn)嚢韬竽萌ルx心時的離心環(huán)節(jié)上，由于離心時因離心機(jī)壞了，我們試驗時只能用轉(zhuǎn)速才3000rpm 的離心機(jī),這與試驗要求的 12022rpm 相差很大而致使還有很多雜質(zhì)殘留在上清液OD 物量比用于測量的那瓶要多。試驗結(jié)果綜合分析：本試驗通過對整個發(fā)酵過程定時觀看菌體的變化，發(fā)酵現(xiàn)菌體數(shù)量的發(fā)酵過程中先是快速增多，增多到肯定數(shù)量后開頭有所削減，這從圖710 15 可看出；另外還覺察菌100 倍鏡下才能看到；在種子培育基中培育24h 后，菌體變大，菌體四周長出了菌絲

10、；發(fā)酵48h 后，菌體明顯變大，在 40 倍鏡下也能清楚的看到，菌絲增多且聚攏成球狀；發(fā)酵 72h且由所測OD 值數(shù)據(jù)3可知此時正處于發(fā)酵的旺盛時期；發(fā)酵96h 后，菌體形態(tài)變得較松散也較大了，沒有明顯的致密圓球形了，而到144h 后菌體變得更大，菌比多而細(xì)且聚積得較松散，事形態(tài)呈不規(guī)章狀，并通過對其OD 96 小時以后菌體發(fā)酵量相對于之前下降了很多，說明此階段菌體生產(chǎn)力量開頭減弱；以上結(jié)果可綜合上面圖4、69121416可看出。【參考文獻(xiàn)】1 雷德柱，胡位榮. 生物工程中游技術(shù)試驗手冊. 科學(xué)出版社，2022，96-100.2 HYPERLINK “ :/d.g.wanfangdata .cn/Thesis_Y1521854.aspx“ :/d.g.wanfangdata .cn/Thesis_Y1521854.aspx3 張龍翔. 生化試驗方法和技術(shù)M.北京：高等教育出版社，1997：1-3.4 周德慶2022微生物學(xué)教程高等教育出版社，北京。5 HYPERLINK “ :/wenku.baidu /view/43a0c507e87101f69e3195e3.html“ :/wenku.baidu /view/43a0c507e87101f69