1、鹽酸槐定堿注射液對DNA拓撲異構酶活性抑制作用的研究【關鍵詞】鹽酸槐定堿,；,拓撲異構酶；,活性作用摘要：目的研究鹽酸槐定堿對DNA拓撲異構酶I和酶IITPI、II活性的影響。方法DNA超螺旋解旋法檢測鹽酸槐定堿注射液對拓撲異構酶I及酶II介導的PBR322DNA解旋反響的影響。結果鹽酸槐定堿注射液能明顯抑制TPI介導的DNA解旋及斷裂，在終濃度為6250g/l和3215g/l時對拓撲異構酶I均有抑制作用，且劑量-效應關系親密，但對拓撲異構酶II介導的DNA解旋反響無影響。結論結果提示鹽酸槐定堿注射液的直接作用靶點是DNA拓撲異構酶I，該藥為拓撲異構酶I抑制劑。關鍵詞：鹽酸槐定堿；拓撲異構酶；

2、活性作用Abstrat：bjetiveThepurpsefthisstudyastinvestigatethepriniplefativityfprtingDNAtpiserase.ethdsTheeffetfSphridinehydrhlriuntpiseraseaseasuredbysuperiledDNArelaxatinassay.ResultsSphridinehydrhlriuuldarkedlyinhibittheativityftpiseraseI,by6250g/land3215g/lrespetively,uldntprvethatitinhibitedtheativity

3、ftpiseraseII.nlusinItaybethefatthatDNAtpiseraseIisadirettargetinantiturativityfSphridinehydrhlriu.Keyrds：Sphridinehydrhlriu;DNAtpiserase;antiturativity癌癥是嚴重威脅人類安康的一類疾病，尋找有效的抗癌藥物是目前世界醫學界重要的研究課題，由于合成藥物在伴隨治療中出現明顯的副作用，天然藥物越來越受到人們的重視和青睞。鹽酸槐定堿是一種植物來源的天然藥物，在槐樹的果實中含量很高。鹽酸槐定堿注射液主治癌癥，療效確切，毒副作用極低。為進一步討論該藥物的作用機

4、理，我們以DNA拓撲異構酶I、II為靶點，體外測定鹽酸槐定堿注射液對其活性的影響，以便為臨床治療腫瘤提供更多的根據。結果報道如下。1材料和方法1.1材料1.1.1藥物鹽酸槐定堿注射液由江西中醫學院提供。1.1.2試劑PBR322DNA、溴化乙錠EB及二甲苯青FF均系Siga公司產品。DNA拓撲異構酶I試劑盒購自大連保生工程，DNA拓撲異構酶II系美國USB產品，瓊脂糖系GIB產品，羥基喜樹堿購自黃石飛云制藥，鬼臼乙義苷VP-16購自江蘇恒瑞醫藥股份。1.2方法1.2.1拓撲異構酶I活性的測定在20l的反響體系中含有10反響緩沖液350l/LTris-HlpH8.0l/L,720l/L氯化鉀，5

5、l/L氯化鎂，50l/LDTT,50l/LSperidine2l,0.1%BAS2l，PBR3220.36g,陽性對照管羥基喜樹堿終濃度為212.5g/l，10.6g/l。各試管分別參加不同濃度的槐定堿終濃度分別為6250，3215，625g/l。拓撲異構酶I，各管用蒸餾水補充至20l，混勻后置37反響30in，參加5l終止液5%的SDD,40%的蔗糖，0.25g/l溴酚蘭終止反響。在TBE電泳緩沖液中進展瓊脂糖電泳，40V電壓下，電泳4h。溴化乙啶溶液1g/l染色30in,置260n紫外線下觀察DNA的電泳區帶，并攝片記錄。1.2.2拓撲異構酶II活性的測定參照TPII試劑盒實驗方法,20l

6、的反響體系中含有10 x反響緩沖液100l/LTris-Hl,pH7.9l/L,500l/L氯化鈉，500l/L氯化鉀，50l/L氯化鎂,1l/LEDTA,0.15g/lBSA,10l/LATP2l,PBR322DNA0.3g,陽性對照管鬼臼乙義苷VP-165000，1000，500g/l。各試管分別參加不同濃度的槐定堿:6250，3215，625g/l。儲藏酶用酶稀釋液10l/L磷酸鈉pH7.1,50l/L氯化鈉，0.2l/LDTT,0.1l/LEDTA,0.5g/lBSA,10%的甘油稀釋至1g/l,參加1l。各管用蒸餾水補充至20l，在30反響15in，參加3l終止液7l/LEDTA,0

7、.77%SDS,20%甘油，0.25g/l溴酚蘭終止反響。電泳、染色及觀察過程同1.2.1。2結果2.1鹽酸槐定堿注射液對TPI活性的影響結果見圖1。由圖1可見陽性對照藥羥基喜樹堿在212.5和10.6g/l時對TP酶I均有顯著的抑制作用,D道。鹽酸槐定堿具有一定的抑制TP酶I的的作用，6250g/l劑量組對TP酶I有較好的抑制作用,抑制該酶介導的DNA斷裂反響，3215g/l劑量組作用稍差，劑量降至625g/l抑制作用不明顯，劑量效應關系親密E,F,G道。2.2鹽酸槐定堿注射液對TPII活性的影響由圖2可見,隨著鹽酸槐定堿濃度的增加6250，3215，625g/l，超螺旋DNA均無明顯變化，

8、說明鹽酸槐定堿注射液對TPII的活性沒有影響,D,E道。陽性對照藥VP-16在5000，1000及500g/lF,G,H道三個濃度均能顯著抑制TPII酶的活性，量效關系明顯。3討論DAN拓撲異構酶是近年發現的維持DNA復制、重組、轉錄等信息傳遞及加工的重要空間構型酶，其催化單鏈或雙鏈DNA短暫別離，以利于復制，按其誘導DNA斷裂機制的不同，分為TPI和TPII。由于DNA超螺旋程度影響著機體的活動，而拓撲異構酶的作用正是控制DNA的空間構型酶，由此該酶被列為挑選抗腫瘤藥物的重要靶酶14。用DNA拓撲異構酶I和II介導DNA斷裂實驗觀察鹽酸槐定堿注射液對DNA作用的方式，這是目前較快速、敏感的體

9、外腫瘤藥物挑選方法。轉貼于論文聯盟.ll.本實驗研究了不同條件下鹽酸槐定堿注射液對拓撲異構酶I及酶II的影響，結果顯示，鹽酸槐定堿注射液能明顯抑制TPI的活性，抑制其介導的DNA解旋或斷裂，隨著濃度的進步，這種作用愈趨明顯，并呈現較好的量效關系，但其對TPII的活性幾無影響，因此我們推測鹽酸槐定堿注射液的細胞毒活性可能與其抑制TPI活性有關，TPI是其抗腫瘤作用的細胞內靶點之一。一般認為，藥物對酶介導的DNA斷裂反響的影響有促進或抑制兩種類型5，鹽酸槐定堿注射液屬于后種，即該藥可以抑制腫瘤細胞內拓撲異構酶I的活性，通過抑制該酶介導的DNA裂解反響發揮其抗癌作用。迄今為止，世界上進展過抗癌活性挑

10、選研究的化合物已超過50萬種，從中尋找出不少有臨床應用價值的藥物，批準上市的約有70種，這些藥物中有相當一局部是基于抑制DNA拓撲異構酶的作用而產生抗癌活性的，目前，TPI抑制劑主要為喜樹堿及其衍生物，近年來還開展了拓撲特肯TPT、依林特肯PT-11兩個喜樹堿類藥物，TPII抑制劑主要有阿霉素、柔紅霉素、VP-16等，蒽類氨基酸偶合物等那么可同時抑制TPI和II，在這些藥物中有些因不良反響大、水溶性低等原因，其臨床應用一直受限制，如喜樹堿等。因此尋找高效低毒的DNA拓撲異構酶I抑制劑具有重要的現實意義78。鹽酸槐定堿注射液是從中草藥中提取的單體生物堿中醫一類新藥，動物實驗已證實其對EA等動物腫

11、瘤有顯著的抗癌作用6，臨床試驗也證明該藥對惡性滋養葉癌惡葡和絨癌等癌癥有明顯的療效，并且毒副作用極低，同時，我們的實驗也證實鹽酸槐定堿注射液的直接作用靶點是DNA拓撲異構酶I，因此該藥是一類很有前途的天然植物抗癌藥。參考文獻：1RasheedZA,RubiEH.ehanissfresistanettpiserasel-targetingdrugJ.ngene,2022,22:7296.2angHK,rris-NatshkeSL,LeeKH.Reentadvanesinthedisveryanddevelpentftpiseraseinhibitrsasantituragents.J.edResRev,199717(4):3673張利萍，蔣記愷，劉祥貴.DNA拓撲異構酶及其抑制劑與細胞凋亡J.國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊，1997，1810：504angJ,DNAtpiserases.AnnuRevBihen,1996,355(1,2):915劉曉梅，王龍貴，籍秀娟，等.以DNA拓撲異構酶為靶點的一種抗癌藥物挑選的新方法J.癌癥，1991，35：2206李雪梅，吳運光，陳紹勵，等.槐定堿的抗癌作用J.中國藥理學報，1987，82：1537SinhaBK.T