1、 PAGE PAGE 13食品安全國家標準食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗范圍本標準規定了食品中腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的檢驗方法。本標準第一法適用于腸桿菌科含量較低而雜菌含量較高的食品中腸桿菌科的計數；第二法適用于腸桿菌科含量較高食品中腸桿菌科的計數。術語和定義腸桿菌科 Enterobacteriaceae在一定條件下發酵葡萄糖產酸、氧化酶陰性的需氧或兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞短桿菌。腸桿菌科計數count of Enterobacteriaceae 按本標準規定方法，對每克或每毫升檢樣中的腸桿菌科進行計數。最可能數most probable number，MPN基于泊松

2、分布的一種間接計數方法。設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：恒溫培養箱： 36 1 。冰箱：2 5 。水浴箱：46 1 。電子天平：感量0.1 g。顯微鏡：10100。均質器。振蕩器。無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。無菌錐形瓶或等效容器：容量150 mL、500 mL。無菌培養皿：直徑90 mm。無菌試管：18 mm180 mm、15 mm150 mm。pH計或pH比色管或精密pH試紙。培養基和試劑緩沖蛋白胨水（BPW）：見附錄A 中A.1。煌綠膽鹽葡萄糖肉湯（EE）：見附錄A 中A.2。結晶紫中性紅

3、膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）或再水化干膜測試片：見附錄A 中A.3。營養瓊脂（NA）：見附錄A 中A.4。葡萄糖瓊脂：見附錄A 中A.5。革蘭氏染色液：見附錄A 中A.6。氧化酶試劑：見附錄A 中A.7。無菌1 mol/L NaOH:見附錄A中A.8。無菌1 mol/L HCl：見附錄A中A.9。第一法 腸桿菌科MPN計數法檢驗程序腸桿菌科帶有前增菌的MPN計數法檢驗程序見圖1。選擇適宜3個連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度3管，共9管BPW。選擇適宜3個連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度3管，共9管BPW。接種VRBGA平板，報告結果確定鑒定革蘭氏染色、葡萄糖發酵試驗、氧化酶試驗檢樣25 g（或

4、25 mL）樣品+225 mL BPW，均質10倍系列稀釋1 mL BPW + 10 mL EE 18 h2 h可疑菌落移種NA平板36 36 24 h2 h36 24 h2 h36 18 h24 h查MPN表圖1 腸桿菌科帶有前增菌的MPN計數法檢驗程序操作步驟樣品的稀釋 固體和半固體樣品：稱取25 g樣品置盛有225 mL BPW的無菌均質杯內，8000 r/min10000 r/min均質1 min2 min，或放入盛有225 mL BPW的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min，制成1:10的樣品勻液。 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL BPW的無

5、菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL BPW的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計及相關限量要求，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1 mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。接種和培養非選擇性前增菌每個樣品，選擇3個適宜連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度3管，共9管BPW于36

6、1 培養18 h2 h。選擇性增菌從BPW各培養管中，移取1 mL，分別接種于10 mL的 EE肉湯中，36 1 培養24 h2 h。分離用接種環從EE肉湯各培養管中，移取1環，分別劃線接種于VRBGA平板，36 1 培養24 h2 h，觀察平板上有無典型菌落。典型菌落確認 典型菌落為直徑0.5 mm，有或無沉淀環的粉紅色至紅色或紫色菌落。從每個平板上至少挑取3-5個（小于5個全選）典型菌落進行確認；如果有不同形態的典型菌落，則每種形態分別至少挑取1個菌落進行確認；有些腸桿菌科可能導致菌落或培養基脫色，因此，如無典型菌落時可挑取白色菌落進行確認。純培養分別將所挑選的每一個菌落，劃線于營養瓊脂平

7、板，36 1 ，培養18 h24 h，取培養物進行革蘭氏染色和生化確認。革蘭氏染色腸桿菌科為革蘭氏陰性無芽胞桿菌。生化鑒定氧化酶試驗用鉑/銥接種環或玻璃棒（不要用鎳鉻接種環）挑取單個菌落涂于浸濕氧化酶試劑的濾紙上，濾紙的顏色在10 s內變成藍紫色，視為陽性反應。葡萄糖發酵試驗用接種針挑取少許氧化酶陰性的同一個菌落，穿刺于葡萄糖瓊脂內，于36 1 培養24 h2 h，若試管內的內容物變為黃色，視為陽性反應。報告腸桿菌科為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發酵葡萄糖產酸、氧化酶陰性。只要有1個菌落鑒定為腸桿菌科，其所代表的EE管即為腸桿菌科陽性，依據EE陽性管數查MPN表（見附錄B），報告每 g（mL）樣品中

8、腸桿菌科的MPN值。稱重取樣以MPN/g為單位報告，體積取樣以MPN/mL為單位報告。第二法 腸桿菌科平板計數法檢驗程序腸桿菌科平板計數法檢驗程序見圖2。選擇2個選擇2個3個適宜連續稀釋度的樣品勻液，各取1 mL BPW分別加入無菌培養皿內（或再水化干膜測試片）計數，挑取可疑菌落，接種于NA斜平板結果報告確定鑒定革蘭氏染色、葡萄糖發酵試驗、氧化酶試驗檢樣25 g（或25 mL）樣品+225 mL BPW，均質10倍系列稀釋每皿中傾注10 mL15 mL VRBGA培養基24 h2 h36 1 36 1 18 h24 h圖2 腸桿菌科平板計數法檢驗程序操作步驟樣品的稀釋 按5.1.1進行。培養選

9、擇2個3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。或吸取1 mL BPW加入到測試片中，每個稀釋度接種兩個測試片。同時，吸取1 mL BPW加入兩個無菌平皿（或測試片）內作為空白對照。將10 mL15 mL冷卻至46 1 的VRBGA（可放置于46 1 恒溫水浴箱中保溫）傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，使樣品勻液與培養基充分混勻。待瓊脂凝固后，傾注一薄層同樣的培養基覆蓋平板表層。防止蔓延生長并使菌落特征更為明顯。待VRBGA平板上層瓊脂凝固后翻轉平板，36 1 培養18 h24 h。測試片接種后直接進行培養。計數和挑選菌落確認典型菌落確認見

10、5.1.3。再水化干膜測試片中典型菌落為帶有氣泡和/或黃暈的菌落。記錄稀釋倍數和相應的菌落數量，平板計數以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。選取菌落數在15150之間的平板（或測試片）計數。大于150的可記錄為多不可計。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數；若片狀菌落不到平板的四分之一，而其余菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2，代表一個平板菌落數。當平板上出現菌落間無明顯界線的鏈狀生長時，則將每條單鏈作為一個菌落計數。從每個平板（或測試片）上隨機挑取5個有代表性的菌落（不足5個時，應全部挑選）純

11、培養后進行生化確認。 結果的計算一般原則 a） 若有兩個連續稀釋度的平板（或測試片）典型菌落數在適宜計數范圍內，按公式（1）計算。公式（1）（1）式中：N 樣品中腸桿菌科菌落數；A 某一平板（或測試片）中用于確認試驗的菌落數；b 某一平板（或測試片）中A個菌落中被確證為腸桿菌科的菌落數，bA；C 某一平板（或測試片）中典型菌落總數；a 確證的腸桿菌科菌落數之和；n1 第一稀釋度（低稀釋倍數）平板（或測試片）個數（含適宜范圍典型菌落數）n2 第二稀釋度（高稀釋倍數）平板（或測試片）個數（含適宜范圍典型菌落數）d 稀釋倍數（第一稀釋度）示例1兩個連續稀釋度均含適宜的典型菌落數平板，并含有已確證的腸

12、桿菌科菌落，數據見表1。表1 示例1中腸桿菌科平板計數結果稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）典型菌落數（CFU）1261182024用于確認試驗的菌落數（CFU）5555確證的菌落數（CFU）4543a4/5126=1015/5118=1184/520=163/524=14上述數據按6.2.2數字修約后，表示為11000或1.1104。示例2兩個連續稀釋度均含適宜典型菌落數平板，其中某一稀釋度的一個平板菌落數不在適宜范圍內，或者兩個稀釋度各有一個平板菌落數不在適宜范圍內，則相應的平板不作為計數平板，數據見表2。表2 示例2中腸桿菌科平板計數結果稀釋度1:100（第一稀釋度

13、）1:1000（第二稀釋度）典型菌落數（CFU）1261182010用于確認試驗的菌落數（CFU）555/確證的菌落數（CFU）454/a4/5126=1015/5118=1184/520=16/上述數據按6.2.2數字修約后，表示為11000或1.1104。示例3兩個連續稀釋度均含適宜典型菌落數平板，其中一個平板無已確證的腸桿菌科菌落，數據見表3。表3 示例3中腸桿菌科平板計數結果稀釋度1:100（第一稀釋度）1:1000（第二稀釋度）典型菌落數（CFU）1261182020用于確認試驗的菌落數（CFU）5555確證的菌落數（CFU）4540a4/5126=1015/5118=1184/52

14、0=160上述數據按6.2.2數字修約后，表示為11000或1.1104。 b）若只有一個稀釋度平板（或測試片）上的典型菌落數在適宜計數范圍內，按公式（1）計算，n2（或n1）= 0。 c）若所有稀釋度的平板（或測試片）上典型菌落數均大于150，則對稀釋度最高的平板進行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。低菌落數 d）所有稀釋度的平板（或測試片）典型菌落數均小于15，則按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。 e）若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板（或測試片）均無菌落生長，或典型菌落數均小于15且無證實的腸桿菌科菌落，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。特殊情

15、況 f）第一稀釋度平板（或測試片）菌落數超過150，第二稀釋度菌落數低于15。如果第一稀釋度的平均菌落數在167150之間（置信區間的上限加權平均為150），按照公式（1）計算結果。如果第一稀釋度平均菌落數大于167，則計算第二稀釋度的結果并得出一個估算值，如果估算值小于8（置信區間的下限加權平均值為15），這時兩個稀釋度的差異是不能接受的。 g）第一稀釋度平板上（或測試片）的菌落數超過150，有證實的腸桿菌科菌落，以及第二稀釋度菌落數少于150個，其中，無證實的腸桿菌科菌落，結果按照小于1/第二稀釋度 CFU/g（mL）且大于1/第一稀釋度CFU/g（mL）計算。 h）第一稀釋度平板上（或測

16、試片）的菌落數超過150，無證實的腸桿菌科菌落，以及第二稀釋度菌落數少于150個，無證實的腸桿菌科菌落，結果按照小于1/第二稀釋度 CFU/g（mL）計算。報告菌落數小于100時，以整數報告。菌落數大于或等于100時，對第3位數字進行修約后，取前2位數字，后面用0代替位數；也可用10的指數形式來表示，采用兩位有效數字。數字修約按“四舍五入”原則進行。若所有平板上為蔓延菌落而無法計數，則報告菌落蔓延。若空白對照上有菌落生長，則此次檢測結果無效。稱重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告。附錄A培養基和試劑A.1 緩沖蛋白胨水（BPW）A.1.1成分蛋白胨10.0 g氯化鈉5

17、.0 g磷酸氫二鈉 3.5 g磷酸二氫鉀1.5 g蒸餾水1000.0 mLA.1.2 制法將各成分加熱溶解，于25 時調節pH至7.20.2，分裝于500 mL 廣口瓶中，每瓶225 mL，121 高壓滅菌15 min。A.2煌綠膽鹽葡萄糖肉湯（EE肉湯）A.2.1 成分蛋白胨10.0 g葡萄糖5.0 g磷酸氫二鈉（無水）6.45 g磷酸二氫鉀2.0 g3號膽鹽20.0 g煌綠3.0 mL（0.5 %水溶液）蒸餾水1000.0 mLA.2.2 制法將各成分溶于水中，加熱煮沸至完全溶解，加熱不宜超過30 min，迅速冷卻培養基，于25 調節pH至7.20.2，分裝于滅菌的18 mm180 mm試

18、管中，每管10 mL，不需高壓滅菌，5 3 可存放一個月。A.3結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）A.3.1 成分蛋白胨7.0 g酵母浸膏3.0 g3號膽鹽1.5 g葡萄糖10.0 g氯化鈉5.0 g中性紅0.03 g（或0.6 %酒精溶液5 mL）結晶紫0.002 g（或0.1 %水溶液2 mL）瓊脂粉10.0 g12.0 g蒸餾水1 000.0 mLA.3.2 制法將各成分溶于水中，加熱煮沸至完全溶解，25 時調節pH至7.40.2，分裝于滅菌的三角燒瓶中，不需高壓滅菌，用前制備。A.4 營養瓊脂A.4.1 成分牛肉浸膏3.0 g蛋白胨5.0 g瓊脂粉10.0 g12.0 g蒸餾水1

19、000.0 mLA.4.2 制法將各成分溶于水中，加熱煮沸，25 時調節pH至7.30.2，121 高壓滅菌15 min。A.5 葡萄糖瓊脂A.5.1 成分胰蛋白胨10.0 g酵母浸膏1.5 g葡萄糖 10.0 g氯化鈉5.0 g溴甲酚紫0.015 g（或0.4 %溴甲酚紫酒精溶液3.75 mL）瓊脂粉10.0 g12.0 g蒸餾水1000.0 mLA.5.2 制法將各成分溶于水中，加熱煮沸，25 時調節pH至7.00.2，分裝于15 mm150 mm試管，每管約5 mL，121 高壓滅菌15 min后，試管垂直放置。于5 3 可存放1周。為去除培養基中的氧氣，使用前可將葡萄糖瓊脂試管置于沸水

20、浴中15 min，然后迅速冷卻，備用。A.6 革蘭氏染色液A.6.1 結晶紫染色液A.6.1.1 成分結晶紫1.0 g95 %乙醇 20.0 mL1 %草酸銨水溶液80.0 mLA.6.1.2 制法將結晶紫完全溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。A.6.2 革蘭氏碘液A.6.2.1 成分碘1.0 g碘化鉀2.0 g蒸餾水300.0 mLA.6.2.2 制法 將碘和碘化鉀先行混合，加入少許蒸餾水充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300 mL。A.6.3 沙黃復染液A.6.3.1 成分沙黃0.25 g95%乙醇10.0 mL蒸餾水90.0 mLA.6.3.2 制法將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。A.6.4 染色法A.6.4.1將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1 min，水洗。A.6.4.2滴加革蘭氏碘液，作用1 min，水洗。A.6.4.3滴加95%乙醇脫色約1530 s，直至染色液被洗掉，但不要過分脫色，水洗。A.6.4.4加沙黃復染液，復染1 min，水洗、干燥、鏡檢